一、重组信号分子GRF的PH结构域抑制蛋白激酶C活性（论文文献综述）
杨惠芳[1]（2021）在《PLCG2基因P645L和N798S突变在儿童炎症性肠病中的致病机制初探》文中进行了进一步梳理目的:临床上我们发现两例极早发炎症性肠病（very early onset IBD,VEO-IBD）患儿,完善基因测序检查后未发现明确的致病性突变,却发现分别存在磷脂酶Cγ2（phospholipase C gamma 2,PLCG2/PLCγ2）基因Pro645Leu和Asn798Ser突变。因此,本研究拟初步探究PLCG2基因P645L和N798S突变与儿童炎症性肠病的相关性及其致病机制。方法:1、建立细胞模型:构建野生型及突变型（P645L、N798S和S707Y突变）PLCG2、Syk和Rac2质粒,分别转染和共同转染人胚肾-293T（human embryonic kidney-293T,HEK-293T）细胞。2、检测PLCG2基因的蛋白表达:在炎症因子的刺激下,通过蛋白质印迹（Western Blot,WB）实验,检测野生型及突变型PLCG2基因的蛋白表达。3、探索PLCG2基因突变与儿童IBD的相关性:通过免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）实验,检测细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）的磷酸化水平,在细胞水平上进行功能验证。4、检测信号通路变化,探索致病机制:通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）实验,分别检测上游信号分子脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase,Syk）和Rac2与PLCG2的结合情况。同时在Rac2的参与下,通过IP实验检测ERK的磷酸化水平。结果:1、与野生型PLCG2相比,突变型PLCG2（P645L和N798S突变）诱导更多的ERK磷酸化。2、与野生型PLCG2相比,突变型PLCG2并不与Syk相结合,而是与Rac2相结合,且在Rac2的参与下诱导更多的ERK磷酸化。结论:1、PLCG2基因P645L和N798S突变均为儿童IBD的致病性突变。2、PLCG2基因P645L和N798S突变通过增强Rac GTPase介导的ERK磷酸化,使PLCγ2信号通路过度激活,从而促进肠道炎症反应。
谭卫星[2]（2021）在《外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制》文中研究表明一、背景类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以对称性、侵蚀性和破坏性关节炎为特点的慢性全身性自身免疫性疾病,其中RA患者关节成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-1ike synoviocyte,FLS）的生物学特征改变及功能异常被认为与RA的发病密切相关。人们对导致RA-FLS“肿瘤样增殖”表型的分子机制目前仍知之甚少,猜测可能是细胞暴露于体内类风湿炎症环境中以某种方式的被动应答,而这一炎症环境中的效应分子包括最新研究发现的一些新的生物标志物如:外泌体,后者被认为同样具有潜在的临床诊断和治疗作用。我们既往研究显示在Wnt经典及非经典两条信号通路中扮演着交叉点角色的Dvl的一个亚型即Dvl3分子在RA血清外泌体中显着升高。推测Dvl3这一分子在RA中可能具有诱人的研究前景,因此本研究旨在探寻Dvl3在RA中的表达模式以及通过外泌体这一方式研究Dvl3 mRNA在RA中的功能及作用机制,为将来能够更深入了解RA的发病机制及发现新的可能的治疗靶点奠下基础。二、研究目的第一部分:明确Dvl3在RA患者滑膜组织和细胞以及胶原诱导关节炎小鼠模型（CIA）滑膜组织中的表达情况。第二部分:明确外泌体Dvl3 mRNA在体外对成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及炎性反应的作用。第三部分:明确外泌体Dvl3 mRNA在体内对CIA模型疾病程度、疼痛、滑膜破坏和凋亡、软骨和骨破坏以及血清炎性因子水平的影响。第四部分:探讨Dvl3 mRNA发挥上述作用的可能下游机制。三、研究方法第一部分:（1）分别收集了6例RA和创伤（Trauma）患者的膝关节滑膜组织,经固定、包埋、切片机组织HE染色对两组滑膜组织病理进行比较;（2）分别通过免疫组化（IHC）、蛋白印迹（WB）及实时定量PCR（q PCR）比较Dvl3在两组患者滑膜组织中的表达水平;（3）从滑膜组织中原代提取成纤维样滑膜细胞,比较Dvl3的表达水平;（4）通过构建胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型,比较Dvl3在疾病模型小鼠及正常小鼠膝关节中的表达水平。第二部分:（1）构建Dvl3 mRNA过表达及干扰慢病毒,鉴定摸索慢病毒感染RA-FLS条件,获得能够稳定上调或下调Dvl3 mRNA的RA-FLS;（2）进一步摸索条件通过对细胞培养上清超速离心获得能够稳定介导目标RA-FLS中Dvl3 mRNA水平改变的外泌体,并通过q PCR及WB进行验证转染效果。（3）采用Tunel及流式检测法测定不同来源外泌体转染RA-FLS后对细胞凋亡的影响;CKK8测定RA-FLS细胞活性;（4）经划痕和Transwell迁移实验比较细胞迁移能力;（5）利用Transwell侵袭实验及基质金属蛋白酶（MMPs）表达水平检测反映细胞侵袭能力;（6）提取目的细胞RNA及上清分别使用q PCR及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各细胞因子的mRNA及蛋白水平。第三部分:（1）外泌体获取同第二部分,构建CIA小鼠模型,对小鼠关节腔注射外泌体,每周一次;（2）第二次免疫次日起对小鼠疾病评分;（3）对小鼠足爪机械痛觉进行一次评分;（4）颈椎脱臼法处死小鼠获取小鼠膝关节,分别行HE染色、番红O-固绿染色及Tunel染色对小鼠膝关节病理、软骨破坏及滑膜细胞凋亡情况进行评价;（5）门静脉取血并采用ELISA法检测各细胞因子表达水平。第四部分:（1）提取不同来源外泌体处理后的RA-FLS中的RNA,q PCR检测Wnt信号通路的关键信号分子筛选Dvl3的可能下游通路;（2）进行WB验证;（3）构建Dvl3 mRNA过表达和干扰质粒并进行转染验证,上述质粒同双荧光素酶报告基因质粒进行共转染实验,验证Dvl3对TCf以及ROCK2启动子的活性。四、结果第一部分:（1）成功提取了RA和创伤患者关节滑膜的原代FLS进行培养、鉴定及传代。（2）RA组滑膜在滑膜增生、炎性细胞浸润及毛细血管增生等方面的评分明显更高。（3）Dvl3在RA患者滑膜中的表达水平明显升高。（4）Dvl3在RA-FLS中的表达同样明显高于对照创伤组。（5）Dvl3在炎性关节炎中的表达被显着上调。第二部分:（1）CKK8结果显示来自过表达外泌体组的外泌体能够显着促进细胞增殖活性,而干扰外泌体组外泌体可以起到抑制FLS增殖的作用。（2）凋亡结果显示过表达外泌体组较对照组显着下调了RA-FLS的凋亡水平。（3）迁移及侵袭实验提示了过表达Dvl3外泌体对细胞迁移及侵袭的促进作用,同时伴有上调基质金属蛋白酶表达水平的作用,在干扰外泌体组中则观察到几乎相反的作用。（4）q PCR及ELISA法检测细胞因子含量水平提示Dvl3 mRNA过表达外泌体能够显着促进TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-21的表达,干扰外泌体组则可以观察到IL-17和IL-21的显着下调。第三部分:（1）成功构建了CIA小鼠模型,小鼠疾病评分结果显示过表达外泌体注射组小鼠关节炎指数较对照组升高更快。（2）机械痛阈值测定结果显示干扰外泌体组小鼠疼痛阈值下降程度较对照组明显减缓。（3）WB及q PCR验证了外泌体注射干预效果。（4）HE染色提示过表达外泌体组病理评分明显高于对照组;而Sh-Dvl3 mRNA干扰外泌体注射组则有效缓解了小鼠的关节炎症。（5）番红O-固绿染色结果显示过表达外泌体组评分明显高于对照组,而干扰实验组则倾向表现出对关节软骨的保护性作用。（6）Tunel实验提示Sh-Dvl3 mRNA外泌体注射组表现出强烈的促凋亡结果。（7）ELISA结果显示Dvl3在膝关节的表达水平升高可以显着上调血清中TNF-α、IL-17及IL-21的水平。第四部分:（1）q PCR结果显示Dvl3 mRNA的过表达同样伴随着β-catenin及Rho A下游分子ROCK2的明显升高,而在Dvl3 mRNA干扰外泌体组则观察到β-catenin及Ro CK2较对照组的显着下降。以上结果经WB得到进一步验证。（2）双荧光素酶报告基因检测系统来明确Dvl3在Wnt通路两条通路中的作用,结果提示了Dvl3可以同时激活经典及非经典Wnt信号通路。五、结论本课题通过临床及动物组织样本表达、原代细胞培养体外实验研究、构建动物模型体内实验研究以及具体分子机制四个部分对Dvl3的表达以及外泌体Dvl3mRNA的功能进行了较为详尽的研究,发现了Dvl3在RA患者及炎性关节炎动物模型中的高表达,以及其在细胞水平可能具有促进细胞增殖抑制凋亡,促进迁移、侵袭及促炎性细胞因子的分泌等作用进而参与介导了关节炎的进展和加重,进一步的机制研究显示其发挥上述作用的下游途径可能离不开对Wnt经典及非经典通路的激活,包括β-catenin/TCF/LEF-1及Rho A/ROCK2通路的活化,同时Dvl3 mRNA干扰外泌体组获得的对炎症性关节炎的保护性结果为未来RA的干预治疗提供了理论基础和新的潜在靶点。
段晨阳[3]（2020）在《Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究》文中研究说明线粒体作为细胞有氧呼吸的主要场所,是缺血缺氧后较早发生损害的细胞器之一。以往针对线粒体的治疗措施主要以抗氧化应激、抗凋亡等线粒体功能障碍发生后的效应为靶点,缺乏针对线粒体质量调控过程中关键环节的防治措施,治疗效果有限。近年研究表明,线粒体质量失衡如线粒体过度分裂、融合受损、自噬和代谢紊乱等关键环节异常与缺血缺氧损伤后多器官功能障碍和机体物质能量代谢紊乱的发生密切相关。Drp1作为经典线粒体动力蛋白,主要影响了线粒体质量调节中的线粒体分裂过程。以往研究认为Drp1只有在内质网和线粒体接触（ER-Mito接触）引起线粒体预收缩后才会被招募到线粒体上参与线粒体分裂过程,但招募机制还有待深入研究。并且正常情况下转位到线粒体上参与线粒体分裂的Drp1仅占总Drp1含量的6%,还有大量Drp1存在于胞浆中。那么大量存在的细胞质Drp1具有哪些功能?在被招募到线粒体之前是否已经开始参与线粒体分裂过程?对于ER-Mito接触形成及线粒体预收缩是否有调控作用?对除了线粒体分裂的其他线粒体质量调控环节比如线粒体自噬、线粒体代谢等是否也有影响呢?此外,目前研究认为Drp1被招募到线粒体上后主要是通过其GTPase活性切割线粒体膜介导分裂的,但是Drp1介导线粒体分裂结束后下一步如何发展一直是困扰大家的问题。近年来在多种疾病模型中发现Drp1参与了线粒体和细胞功能调节,但具体调控机制尚不清楚。有研究表明,线粒体mPTP通道过度开放是线粒体膜电位改变、细胞坏死等发生的先决条件,而ROS大量堆积可能是引起上述线粒体和细胞功能障碍的重要诱因。那么缺血缺氧后线粒体Drp1除了介导线粒体分裂外,是否对线粒体外膜mPTP通道开放和ROS的产生及清除也有影响?为此,本研究利用整体失血性休克和细胞糖氧剥夺方法复制急性缺血缺氧损伤模型。首先我们了解了缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律。其次我们探究了Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及调控机制,重点研究了细胞质Drp1介导ER-Mito接触对线粒体预收缩的启动机制以及线粒体Drp 1对mPTP和ROS等线粒体功能的调控机制。最后,我们观察了使用Drp 1抑制剂Mdivi-1或者Drp 1敲除干预等措施对缺血缺氧损伤后多器官功能的保护作用,为从维持线粒体质量平衡角度调整急性缺血缺氧损伤临床救治方案提供了新思路和新靶点。[研究内容]第一部分:急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺细胞模型,观察缺血缺氧不同时相点（0.5h、1h、2h、3h、4h）血管组织、肠组织、心肌组织及其对应细胞线粒体形态和数量变化以及ATP产生、ROS含量、线粒体膜电位等线粒体功能变化,以了解急性缺血缺氧损伤多组织器官线粒体质量失衡的特征规律。第二部分:Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中作用及调控机制研究1.急性缺血缺氧损伤后线粒体动力蛋白Drp1表达、分布及修饰变化利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺血管平滑肌细胞（VSMC）模型,观察缺血缺氧不同时相点线粒体动力蛋白表达、分布情况;观察缺血损伤后血管和肠组织Drp1修饰变化。2.Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体形态和数量变化中作用及对ER-Mito接触的调控机制（1）Drp1介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的调控作用利用Drp1干扰/过表达腺病毒转染的VSMC细胞,观察干预线粒体Drp1对正常情况下和缺氧后线粒体形态和数量变化的影响,以明确Drp1介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的调控作用。（2）细胞质Drp1介导ER-Mito接触对线粒体预收缩的启动机制利用失血性休克SD大鼠和Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型、糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺血缺氧不同时相点ER-Mito接触情况;观察干预细胞质Drp1对ER-Mito接触和线粒体预收缩的影响;观察干预Drp1-Shroom4复合体对肌动蛋白束化、ER-Mito接触以及线粒体预收缩的影响,以阐明细胞质Drp1通过Shroom4束化肌动蛋白启动ER-Mito接触形成的机制。（3）细胞质Drp1加速线粒体转位的发生机制利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺血不同时相点Calnexin、Fundc1表达及分布情况;观察干预内质网蛋白Calnexin对缺氧早期Drp1和Fundc1的线粒体转位、线粒体预收缩和线粒体分裂的影响,以了解细胞质Drp1在ER-Mito接触位点Calnexin-Fundc1环的招募作用下加速线粒体转位的发生机制。（4）Drp1介导线粒体自噬对破损线粒体的清除机制利用失血性休克Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺Drp1干扰腺病毒转染的VSMC细胞模型,基因组学分析生理和缺血损伤情况下Drp1可能参与的调控通路;观察干预Drp1对缺血缺氧后线粒体自噬小体和自噬溶酶体形成的影响;观察干预Drp1对自噬相关蛋白表达及分布的影响,以阐明Drp1通过Clec16a-Parkin途径介导线粒体自噬的机制。3.Drp1在缺血缺氧损伤mPTP开放和ROS堆积等线粒体功能变化中作用及调控机制（1）Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体mPTP通道开放中的作用及调控机制利用失血性休克SD大鼠、Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺氧不同时相点mPTP开放情况;观察缺血缺氧不同时相点mPTP结构蛋白表达和分布情况;观察干预mPTP结构蛋白HK2表达活性对缺氧后mPTP开放的影响;观察干预线粒体Drp1-LRRK2结合对HK2活性、分布和mPTP开放的影响,以阐明线粒体Drp1对缺血缺氧损伤mPTP过度开放的调控机制。（2）Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体ROS堆积中的作用及调控机制利用失血性休克Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察机体能量代谢变化;代谢组学检测干预Drp1对缺血损伤后线粒体代谢的影响;观察干预Drp1介导谷胱甘肽代谢对线粒体功能的影响,以阐明Drp1通过影响线粒体代谢参与ROS生成和清除的潜在调控通路。第三部分:干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究使用Drp1抑制剂Mdivi-1以及Drp1敲除干预观察缺血缺氧损伤后（1）血管反应性、血管管径变化、血管平滑肌细胞收缩张力以及动态血压维持情况;（2）肝肾血流灌注、肝功、肾功、心输出量、心损和心肌细胞收缩力;（3）肠上皮紧密连接情况、肠道菌群组成及肠屏障功能;（4）血流动力学指标（LVSP、±dp/dt max）、血气指标（Lac、HCO3-、BE、pH等）以及72h存活情况,以阐明干预Drp1对急性缺血缺氧损伤后重要器官功能的保护作用及其临床意义。[研究结果]第一部分:急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究1.缺血缺氧损伤后血管、肠和心脏组织线粒体形态和数量均发生明显变化,但变化时间、变化程度和变化形式存在差异。血管组织变化起始于缺血缺氧后1h并逐渐加剧。肠组织在缺血缺氧后0.5h即发生明显变化,但后续并没有进一步加重。心脏组织变化不如血管和肠组织明显,缺血缺氧后2h才有稍许增加,并且不同于血管和肠组织线粒体缺血缺氧后表现为线粒体过度分裂和碎片化线粒体数量增多,缺血缺氧损伤对心肌线粒体的影响主要体现在心肌线粒体排布紊乱和内部嵴结构的破坏。2.缺血缺氧损伤后血管、肠和心脏组织线粒体功能均发生明显变化,且缺血缺氧损伤后相同组织线粒体功能变化均晚于线粒体形态和数量的变化。第二部分:Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中作用及调控机制研究1.急性缺血缺氧损伤后线粒体动力蛋白Drp1表达、分布及修饰变化（1）缺血缺氧损伤1h后Drp1发生从细胞质到线粒体转位,且其时相变化规律与线粒体碎片化程度呈正相关,提示Drp1线粒体转位在缺血缺氧早期线粒体过度分裂中发挥了重要作用。进一步发现转位到线粒体上的Drp1主要富集在线粒体预收缩位点,对于线粒体分裂的发生具有重要意义。（2）缺血损伤后Drp1的磷酸化、苏木化、亚硝基化修饰明显增高,泛素化修饰轻度减低。缺血缺氧损伤后活跃的Drp1修饰变化对于线粒体质量调控具有重要意义。2.Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体形态和数量变化中作用及对ER-Mito接触的调控机制（1）缺血缺氧后线粒体碎片化的发生是由于Drp1线粒体转位后介导线粒体过度分裂导致的。干扰Drp1后线粒体Drp1减少的同时伴随线粒体碎片数量减少。正常情况下过表达Drp1会导致线粒体过度分裂和线粒体数量的增加。上述结果明确了 Drp1线粒体转位介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的决定作用。（2）缺血缺氧损伤初期Drp1发生大量线粒体转位之前,过度磷酸化和亚硝基化的细胞质Drp1通过激活细胞骨架调节蛋白Shroom4并与之结合形成Drp1-Shroom4复合体。Drp1-Shroom4复合体如“卡扣”一样将内质网周围散乱分布的F-肌动蛋白束化,增强了内质网与线粒体之间的牵引力和有效接触面积。随后内质网在束化F-肌动蛋白锚定端INF2的牵引下,缠绕在线粒体周围,形成ER-Mito接触并进一步引起线粒体预收缩。（3）缺血缺氧损伤ER-Mito接触引起大量线粒体预收缩后,内质网Calnexin会迁移到ER-Mito接触位点并与细胞质中Fundcl结合形成功能环,加速细胞质Drp1沿内质网轨迹向ER-Mito接触位点的线粒体转位过程。（4）缺血缺氧损伤后活化Drp1可上调线粒体Clec16a表达,一方面抑制了 Parkin的线粒体募集,导致线粒体碎片形成自噬小体受阻;另一方面也加速了自噬小体向自噬溶酶体的转变,促进了缺血缺氧损伤后的自噬流过程。3.Drp1在缺血缺氧损伤mPTP开放和ROS堆积等线粒体功能变化中作用及调控机制（1）缺血缺氧晚期,线粒体收缩位点大量富集的Drp1除了介导线粒体分裂外,还会通过结合mPTP结构蛋白BAX,识别线粒体收缩位点附近的mPTP通道。然后通过招募线粒体LRRK2到线粒体收缩或分裂位点形成Drp1-LRRK2复合体引起mPTP通道结构蛋白HK2失活及其线粒体分离,破坏mPTP通道结构,导致mPTP通道过度开放,线粒体CytC释放增多,影响线粒体功能和细胞功能。（2）缺血缺氧后活化Drp1会造成ROS的过度堆积,进而破坏线粒体功能,引起细胞能量代谢异常。其潜在发生机制包括:（a）活化Drp1通过抑制辅酶Q的生物合成破坏线粒体呼吸链,导致线粒体ROS生成增加;（b）活化Drp1抑制线粒体谷氨酸-谷胱甘肽代谢,导致ROS清除减少;（c）活化Drp1通过阻断神经递质途径（包括酪氨酸-多巴胺代谢和维生素E相关通路）进一步降低ROS清除率。第三部分:干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究1.急性缺血缺氧损伤后合并使用Drp1抑制剂Mdivi-1液体复苏可以明显提高血管反应性及其收缩张力。干预Drp1可以很好地维持缺血缺氧损伤后的动态血压。2.干预Drp1可以改善缺血损伤后肝肾血流灌注和肝肾功能,对于缺血损伤后心肌细胞收缩力也有一定的影响。3.Drp1敲除干预可以通过影响肠道菌群中拟杆菌门的组成、恢复短链脂肪酸（SCFA）的产生,从而保护缺血损伤后的肠屏障功能。4.干预Drp1介导的线粒体质量失衡可以很好地改善缺血缺氧损伤后血流动力学、血气和存活情况。[结论]1.Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中发挥了重要作用。其中“Drp1的过度激活（磷酸化、苏木化、亚硝基化）”和“大量细胞质Drp1的线粒体转位”是急性缺血缺氧后线粒体形态数量和功能发生变化的重要原因。2.缺血缺氧后大量存在的细胞质Drp1在被招募到线粒体之前已经开始参与线粒体分裂过程。具体表现为过度磷酸化和亚硝基化的细胞质Drp1通过Shroom4束化肌动蛋白,增强内质网和线粒体之间牵引力,启动大量ER-Mito接触并引起大量线粒体预收缩,为后续细胞质Drp1转位到线粒体收缩位点介导线粒体过度分裂奠定了结构基础。3.缺血缺氧后细胞质Drp1加速线粒体转位是由于ER-Mito接触位点Calnexin-Fundcl功能环大量形成,促进了细胞质Drp1沿内质网向ER-Mito接触位点的大量迁移。4.缺血缺氧晚期Drp1介导线粒体分裂结束后下一步会进一步影响线粒体功能。线粒体Drp1一方面在线粒体收缩或分裂位点通过识别并破坏线粒体mPTP通道结构引起mPTP过度开放,CytC释放增加;另一方面还可通过多种线粒体代谢途径影响ROS的清除和生成,导致ROS过度堆积,最终加重了缺血缺氧后线粒体和细胞功能损伤。5.急性缺血缺氧损伤后使用Drp1抑制剂Mdivi-1液体复苏或者Drp1敲除干预可以保护血管收缩张力、改善肝肾血流灌注以及肠屏障功能,弥补了常规林格液体复苏“虽然可以快速扩容但难以长时间维持血压”的缺陷,对于延长急性缺血缺氧损伤患者的临床救治时间、提高患者救治率和存活率具有重要临床意义。
申晓蒙[4]（2020）在《玉米穗行数QTL qKRN5b的克隆和功能研究》文中提出玉米是世界上最重要的粮食作物之一。玉米果穗的穗行数是单穗籽粒产量的重要组成因子,对籽粒产量起着重要作用。玉米穗行数的形成主要受遗传调控。前人已鉴定到了大量的玉米穗行数相关的数量性状位点（quantitative trait loci,QTL）,然而,已克隆的QTL仍然十分有限。因此,鉴定并克隆控制穗行数变异的关键基因,将有助于阐明玉米产量形成的遗传基础和调控网络,发掘优良等位基因,也可为高产育种实践提供理论指导和基因资源。本研究利用图位克隆策略对一个玉米穗行数QTL q KRN5进行精细定位和候选基因克隆,通过核酸序列分析、表达分析、蛋白活性检测以及遗传转化等研究候选基因的遗传变异和生物学功能,主要结果如下:1、近等基因系构建和QTL证实:利用初定位区间的两侧标记umc1365和umc2512,在NX531×SIL8的高代回交群体中筛选q KRN5区间的杂合单株,自交构建了纯合近等基因系q KRN5NX531和q KRN5SIL8。两个近等基因系间雌花序分生组织宽度差异显着(p=3.5×10-7),果穗的穗行数、穗粒数和单穗籽粒产量差异显着,而主要植株形态性状和开花期无显着差异,表明该QTL区间控制玉米雌花序分生组织的大小及随后发育而成的穗行数和籽粒产量。2、q KRN5的剖分:利用QTL区间内开发的12个多态性标记筛选近等基因系衍生的分离群体,鉴定到9个重组类型。通过子代测验将q KRN5剖分为两个紧密连锁的相引相QTL,其中q KRN5a的加性效应为0.34-0.39行,位于标记SC533和SC520之间,区间大小为884.5 kb;q KRN5b的加性效应为0.93-0.94行,位于标记bnlg1879和umc2293之间,区间大小为1.07 Mb。两个QTL间的物理距离为1.04 Mb。3、q KRN5b的精细定位和克隆:利用QTL q KRN5b区间内开发的4个多态性标记筛选分离群体,鉴定到5种重组类型,每种类型包含5-10个单株。在两年4个环境下鉴定纯合重组家系的表型,通过染色体片段代换作图将q KRN5b定位于标记SC36031和K13之间。该区段物理距离为32.05 kb,编码一个基因,将其命名为KRN5b。在近等基因系间该基因编码区第794位存在1个SNP造成一个氨基酸变异,在基因非编码区和启动子区存在大量序列变异。4、KRN5b的表达和蛋白功能鉴定:KRN5b主要在雌、雄穗等部位特异表达,在q KRN5NX531中的表达量为在q KRN5SIL8中的1.5倍。m RNA原位杂交显示,KRN5b主要在小穗维管组织、成对小穗分生组织（SPM）的起始部位、小穗分生组织和小花分生组织原基等处聚集,说明KRN5b为玉米穗部特异性表达基因。KRN5b酶活性测定显示,KRN5b的特异性底物为PI（4,5）P2和PI（3,4,5）P3,对PI（4,5）P2亲和性高;KRN5b NX531对PI（4,5）P2和PI（3,4,5）P3的水解活性显着高于KRN5b SIL8。5、KRN5b的生物学功能:利用CRISPR创制了KRN5b功能缺失的2个突变体KO1和KO2。相较于野生型,突变体KO1和KO2的穗行数分别减少2.2行和1.6行(p=1.1×10-6,1.3×10-4),雄穗分枝数分别减少2.4和3.0个(p=6.4×10-6,0.004),雄穗的小花密度显着减少（p=0.021）。KO雌花序中的SPM缺陷,或无法发育、或仅分化产生一个SM,缺陷型SPM比例大于野生型(p=5.2×10-4);雄穗小穗稀疏,且雄穗基部的分支减少。表明KRN5b通过控制成对小穗分生组织的起始和活性维持进而影响小穗的发育。6、q KRN5b的育种潜力评估:将q KRN5NX531与5个优良自交系杂交,利用q KRN5b区间内开发的标记进行分子标记辅助选择,获得了以PH6WC、PH4CV、Sheng68、Sheng62为背景的BC4F1材料和以H21为背景的BC3F1材料,改良自交系的表现评估正在进行中。
庞云丽[5]（2020）在《胞浆接头蛋白Dok5的表达纯化》文中提出Dok（downstream of tyrosine kinase/Docking protein）是酪氨酸激酶下游蛋白,在细胞信号转导中至关重要。该家族包含了 Dok1至Dok7共7个成员,它们具有相似的结构特征:N端PH结构域、中央PTB结构域以及C末端区域。PH结构域可以帮助某些蛋白定位于质膜上,中央PTB结构域主要结合磷酸化的酪氨酸,C末端可以结合信号分子调节下游信号通路。Dok5是Dok家族成员之一,已有研究报道,Dok5 可以结合 c-Ret（proto-oncogene encodes receptor tyrosine kinase,Ret）受体,通过 GDNF（Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor,GDNF）信号通路促进神经细胞分化;同时也是受体酪氨酸激酶中的原肌球蛋白相关激酶（tropomyosin-related kinase,Trk）受体的底物,能通过PTB结构域的酪氨酸磷酸化与 TrkB/C 结合,并激活 MAPK（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路,参与神经细胞的分化和凋亡;并且可以被胰岛素受体磷酸化,参与胰岛素信号通路。这些信号通路均在神经系统的发育中发挥重要功能,因此,推测Dok5是一个神经发育相关蛋白。但目前关于Dok5在机体内的功能和分子机制研究未见报道。首先,我们对Dok5基因的序列和编码的氨基酸序列进行了分析。Dok5长度为921 bp,含8个外显子和7个内含子。编码306个氨基酸,包含PH结构域、PTB结构域和C末端区域。其相对分子质量为35.453 kDa,理论pI为9.0,其氨基酸序列在不同物种中高度保守。SignalP信号肽和TM跨膜域预测结果显示Dok5既没有信号肽结构,也没有跨膜区。通过ProtParam和Protscale在线分析显示,Dok5的不稳定系数为42.69,总平均亲水性系数为-0.519,尽管C端富含疏水区,但整体上仍是一个稳定的亲水性蛋白。NetPhos3.1 Server在线预测显示,Dok5含有50个潜在的磷酸化位点,其中包含33个丝氨酸磷酸化位点,14个苏氨酸磷酸化位点,3个酪氨酸磷酸化位点。作为一个信号蛋白,Dok5的众多磷酸化位点很可能作为信号分子的停泊位点,激活下游信号通路。这些基本信息为后续的蛋白表达提供指导意义。一方面,为了寻找Dok5的相互作用蛋白以揭示其在信号转导过程中的分子机制,我们在原核表达系统进行了 Dok5不同结构域蛋白的表达。分析了用PCR方法分别扩增编码Dok5全长（FL）、PTB/PH/C结构域的cDNA,并将其克隆入表达载体pGEX 6p-1中,获得了原核表达质粒pGEX 6p-1-Dok5 FL、pGEX 6p-1-Dok5 PH、pGEX 6p-1-Dok5 PTB、pGEX 6p-1-Dok5 C。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,筛选高效表达GST融合蛋白的菌株。在0.1mM IPTG、16℃条件下,在大肠杆菌BL21中获得Dok5 FL、Dok5 PH、Dok5 PTB蛋白的表达,并进行了Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化。用Dok5特异性抗体进行Western blot检测,结果表明所表达纯化的融合蛋白与Dok5抗体具有良好的反应性,为后续通过GST pull down寻找Dok5相互作用蛋白奠定了实验基础。另一方面,原核表达蛋白缺少翻译后修饰,不能得到正确折叠的活性蛋白。为了进行Dok5在体水平的功能研究,获得能特异性识别Dok5的抗体至关重要。目前规模化生产的抗体均是用C末端的部分合成多肽免疫动物所得的多克隆抗体,能够识别原核表达的蛋白,但在哺乳动物细胞和动物组织中没有良好的特异性。而昆虫表达系统由于具有翻译后修饰功能,所获得的蛋白更接近于天然蛋白,以此为抗原制备的抗体能够特异识别天然蛋白。因此,我们在昆虫细胞表达系统中进行了 Dok5 FL和C端蛋白的表达,以作为抗原在后续工作中进行抗体的制备。将Dok5 FL和C端分别克隆到pFastBac1载体上,构建了 pFastBac1-Dok5 FL、pFastBac1-Dok5 C质粒。将重组质粒转化DH10感受态细胞,通过蓝白斑筛选得到高效产Bacmid的菌株,用Bacmid转染昆虫细胞SF21,分别获得P1/P2/P3病毒;用P3病毒感染High Five细胞,以期获得大量胞内表达的目的蛋白。同时,由于Dok5没有信号肽结构,我们在pFastBac1载体上引入了 Hemolin信号肽,构建了pFastBac1-Hemolin-Dok5 FL、pFastBac1-Hemolin-Dok5 C质粒,以尝试使蛋白能够分泌表达,提高蛋白表达纯化的效率,从而为制备Dok5特异性抗体提供活性蛋白抗原。
祁楠[6]（2020）在《菠菜SpoPH1基因克隆及其高温应答功能分析》文中指出菠菜（Spinacia oleracea L.）是我国重要的经济型绿叶蔬菜之一,营养价值丰富,在全世界及我国范围内广泛种植。菠菜具有耐冷但不耐热的特性,高温胁迫严重影响菠菜的生长发育和产量,本文以耐热型菠菜Sp75和热敏感型菠菜Sp73为研究材料,利用分子生物学手段研究菠菜Spo PH1参与高温胁迫应答的分子机制,对提高菠菜产量及培育耐热菠菜新品种具有重要意义。PH结构域（Pleckstrin homology domain）,由100-120个氨基酸组成的功能性区域,是一种存在于多种信号蛋白和细胞骨架相关蛋白中的功能性区域,参与细胞信号传递,细胞骨架的构成,膜转运等。研究Spo PH1对高温应答调控作用将为深入解析植物高温应答分子机制提供重要参考依据。1.对菠菜全基因组数据库的分析发现,在菠菜基因组中存在2个编码PH蛋白的基因。利用分子PCR技术,克隆到了Spo PH1基因,其最大开放阅读框为450bp,共编码150个氨基酸,理论分子质量为17.4k Da。2.利用同源序列比对分析发现,Spo PH蛋白与多种植物的PH蛋白同源性都较高,都含有一个较为保守的PH结构域,说明PH结构域在进化中较为保守。3.实时荧光定量RT-q PCR对Spo PH1进行表达模式分析。经37℃高温处理后,Spo PH1基因的表达在菠菜耐热材料Sp75叶片中随着处理时间的延长整体呈上升趋势,然而在菠菜热敏感材料Sp73叶片中整体为下降趋势,表明高温胁迫下Spo PH1基因在Sp75和Sp73中响应模式不同。在菠菜六叶期和抽薹期,分别检测不同器官中Spo PH1基因的表达。结果显示,在六叶期时,Spo PH1基因在侧根中的基因表达量最高,在主根中的基因表达量最低,在叶片中子叶的表达量要高于三对真叶。在抽薹期,Spo PH1基因在侧根中的表达量最高,在叶中的表达量最低。4.通过构建p BI121-Spo PH1-GFP植物表达载体,导入烟草（Nicotiana tabacum）叶片细胞中进行烟草瞬时表达分析,结果表明,Spo PH1蛋白定位于细胞质。5.通过构建p YES2-Spo PH1酵母表达载体,转入野生型酵母,获得Spo PH1转基因酵母,并进行高温表型分析。结果表明,在37℃高温处理条件下,与野生型酵母菌株相比与,Spo PH1转基因酵母更耐高温,这说明高温胁迫下Spo PH1基因在酵母细胞中起正调控作用。6.通过构建p ET32a-Spo PH1原核表达载体,诱导并纯化得到His-Spo PH1融合蛋白,通过蛋白免疫印迹法验证了蛋白质纯度,并利用磷脂酰肌醇体外结合实验,初步证实了Spo PH1蛋白具有结合磷脂酰肌醇的能力。7.通过构建p BI121-Spo PH1植物表达载体,并利用农杆菌侵染法获得了Spo PH1过表达拟南芥植株。利用农杆菌侵染法获得Spo PH1突变体回补株系。根系表型分析结果表明,与野生型拟南芥相比,Spo PH1过表达拟南芥的根长最长,At PH1拟南芥突变体的根长最短,Spo PH1纯合拟南芥突变体回补株系的根长较突变体的根长有一定的恢复,证明Spo PH1有可能影响拟南芥根长的生长。
王猛[7]（2020）在《shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究》文中进行了进一步梳理目的:1、研究肌动蛋白丝相关蛋白1相似蛋白1（AFAP1L1）在非小细胞肺癌（NSCLC）表达的临床意义。2、探讨shRNA沉默AFAP1L1对肺腺癌A549细胞增殖、细胞周期、凋亡和侵袭的影响,并初步探讨AFAP1L1参与调控肺癌发生进展的分子机制。3、通过构建慢病毒表达载体介导shRNA沉默AFAP1L1基因,观察其对肺癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,为肺癌的基因治疗提供实验依据。方法:1、应用Max Vision免疫组化技术分别检测84例癌组织和69例正常组织中AFAP1L1蛋白的表达水平,分析AFAP1L1蛋白在癌组织和正常组织的表达差异及其与患者临床病理特征、病理分期的关系。2、利用shRNA干扰技术敲减肺腺癌细胞株A549中的AFAP1L1基因,抑制其在细胞内的转录翻译水平。随后使用Celigo图像细胞仪检测细胞增殖,应用流式细胞术评估细胞周期,以Annexin V（锚定蛋白）作为标记,测定细胞凋亡水平。通过Transwell实验研究AFAP1L1敲减肺腺癌细胞侵袭能力。进一步通过Path Scan细胞内信号转导阵列分析AFAP1L1敲减A549细胞的下游癌症信号蛋白。3、构建重组AFAP1L1基因的shRNA慢病毒表达载体。通过裸鼠成瘤实验体内验证AFAP1L1敲减对肺腺癌细胞增殖侵袭能力的影响。结果:1、通过Max Vision免疫组化法我们在84例NSCLC癌组织中检测62例AFAP1L1的不同程度表达（73.8%）,而在69例正常组织中仅检测到16例（23.2%）。AFAP1L1在NSCLC癌组织中高表达,在正常组织中低或无表达（χ2=38.84且P<0.005）,具有显着统计学差异。2、进一步分析发现,AFAP1L1的表达与肺癌病理分期相关。在I期、II期NSCLC患者组织标本中分别检测到53.8%和65.6%存在AFAP1L1的表达,而在III期+IV期NSCLC病人中AFAP1L1的表达率为88.5%。具有明显统计学差异（χ2=5.596且P<0.05）。3、AFAP1L1的表达水平与肺癌淋巴结转移、胸膜侵犯和脉管浸润相关。存在淋巴结转移的患者标本的AFAP1L1表达阳性率为85.1%,而不存在淋巴结转移的患者标本的AFAP1L1表达阳性率为62.2%。组间对比结果为χ2=4.653且P<0.05,存在统计学差异。有胸膜侵犯组和无胸膜侵犯组的阳性率分别为82.5%和61.4%,差异有统计学意义（χ2=4.416,P<0.05）。有脉管浸润组和无脉管浸润组的阳性率分别为82.1%和57.1%,有统计学差异（χ2=4.811,P<0.05）。此外,AFAP1L1蛋白的表达水平与患者的病理类型、性别、年龄无统计学差异（P>0.05）。4、成功构建AFAP1L1-shRNA慢病毒表达载体。研究发现敲低肺腺癌A549细胞AFAP1L1基因后明显抑制其增殖和侵袭能力;在细胞周期方面研究发现敲低AFAP1L1基因促进细胞周期向G1和G2/M期转变,G1和G2/M期细胞比例增加;与阴性对照的shRNA转染细胞相比,细胞凋亡在AFAP1L1-shRNA转染的细胞中的增加。Transwell测定结果显示,与空白对照组和质粒对照组相比,干扰实验组穿膜的细胞数明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。使用Path Scan细胞内信号转导阵列分析,我们发现AFAP1L1的下调显着激活了P38和caspase3,并抑制PRAS40活化。5、利用活体成像技术通过裸鼠成瘤实验对移植瘤的生长情况分析显示,空白对照组、实验组肿瘤体积分别为:619.80±278.97mm3、289.50±47.07mm3,差异有显着性差异。空白对照组、实验组肿瘤重量分别为:0.966±0.185g、0.583±0.057g,实验组肿瘤重量明显低于空白对照组。此外,通过对实验组和空白对照组进行活体成像,结果显示相比空白对照组,实验组荧光表达量降低（P<0.05）。结论:1、AFAP1L1蛋白表达水平在NSCLC癌组织中显着高于正常组织,并且与NSCLC的病理分期、胸膜侵犯、淋巴结转移、脉管浸润密切相关,与性别、年龄、肿瘤类型无统计学意义。2、AFAP1L1加速肺腺癌细胞周期进程,抑制肺癌细胞凋亡,促进肺癌细胞的侵袭。3、RNA干扰作为一种高效基因编辑技术,可以沉默肺癌细胞目的基因的表达。构建稳定表达靶基因RNA干扰的慢病毒载体（shRNA-AFAP1L1-LVs）进行后续实验发现,于在体内外特异地抑制人肺癌细胞系中AFAP1L1基因的表达,可以抑制人肺腺癌细胞A549细胞株的生长增殖侵袭能力。利用活体成像技术,验证了沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞生物学行为的影响。为进一步研究肺癌细胞的恶性行为奠定基础,为揭示肺癌发生发展的分子机制提供更多证据,AFAP1L1有成为肺癌基因疗法中作用靶点的潜力。
王鹏[8]（2020）在《OPTN基因表达对卵巢癌和宫颈癌细胞耐药性的影响》文中进行了进一步梳理目的:通过构建敲减、敲除、过表达OPTN基因的SKOV3和Hela细胞系,研究OPTN基因表达影响SKOV3和Hela细胞对抗癌药物DDP的敏感性。方法:针对人OPTN基因序列设计sh RNA（敲减）、sg RNA（敲除）、LV-OPTN（过表达）的序列,构建慢病毒表达载体,转染293T细胞获得慢病毒上清,并感染SKOV3、Hela细胞,经过筛选获得稳定的敲低、敲除、过表达的SKOV3、Hela细胞系。PCR检测敲除OPTN基因,RT-PCR检测敲减、过表达前后OPTN基因表达量的变化;Western blot检测敲低、敲除、过表达OPTN基因的SKOV3和Hela细胞OPTN蛋白表达的变化;MTT法检测DDP对敲低、敲除、过表达OPTN的SKOV3、Hela细胞增殖的影响;流式细胞仪检测OPTN的表达对SKOV3、Hela细胞凋亡的影响;q RT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因caspase3、Bax、Bcl-2、PI3K、AKT、m TOR、MDR1、ERCC1、BRCA1的基因表达量（m RNA和蛋白质）的变化,探讨其对PI3K-AKT-m TOR信号通路、凋亡和耐药相关基因表达的影响。结果:1、成功构建敲减、敲除、过表达OPTN基因的SKOV3、Hela细胞系。2、MTT结果显示,在DDP作用下,敲减和敲除组两种癌细胞的增殖抑制率与对照组相比下降,而过表达组的细胞增殖抑制率与对照组相比上升。3、流式结果显示,在DDP作用下,敲减和敲除组两种癌细胞的凋亡率与对照组相比下降,过表达组的细胞凋亡率与对照组细胞相比上升。4、q RT-PCR结果显示敲减和敲除组细胞caspase3、Bax的基因表达量相比于对照组下降,Bcl-2、PI3K、AKT、m TOR、MDR1、ERCC1、BRCA1基因的表达量相比于对照组上升,而过表达组细胞的上述基因表达的m RNA变化相反。5、Western blot结果显示敲减和敲除组细胞Cleavedcaspase3、Procaspase3、Bax的蛋白表达量相比于对照组下降,Bcl-2、PI3K-AKT-m TOR信号通路相关蛋白、MDR1、ERCC1、BRCA1的蛋白表达量相比于对照组上升,过表达组细胞的蛋白表达量变化相反。结论:OPTN基因的表达促进了SKOV3、Hela细胞的凋亡和对抗癌药物DDP的敏感性,可能的机制是通过调节PI3K-AKT-m TOR信号通路,进而调节了Bax/Bcl-2凋亡基因的表达,同时OPTN的表达下调了MDR1、ERCC1、BRCA1等耐药相关基因的表达而促使细胞耐药性的下降,可能的机制也是通过调节PI3K-AKT-m TOR信号通路来实现的。
姜文兵[9]（2019）在《蛋白激酶Cβ2信号通路介导对比剂诱导糖尿病肾小管上皮细胞损伤的机制研究》文中研究指明背景:造影剂肾病（Contrast medium-induced nephropathy,CIN）是住院患者急性肾损伤的第三大常见原因,预防CIN仍然具有挑战性,迫切需要新的有效的CIN预防策略。糖尿病是CIN的独立危险因素,而糖尿病患者造影剂肾病的发病机制仍知之甚少。研究目的:本研究旨在观察造影剂泛影葡胺导致的糖尿病肾小管上皮细胞损害,并探讨其分子机制。进一步观察灯盏花素对其是否具有保护作用。研究方法:1.在体动物实验共设7个组:对照组、糖尿病组、CIN组、糖尿病+CIN组、糖尿病+灯盏花素组、CIN+灯盏花素组和糖尿病+CIN+灯盏花素组。链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导糖尿病小鼠模型。采用HE染色、RT-PCR、免疫蛋白印记法分析肾脏组织的collagen I、CTGF、TGF β1的mRNA和蛋白质水平。2.通过晚期糖基化终产物（Advanced Glycation End-Products,AGEs）孵育肾小管上皮细胞模拟糖尿病离体环境,观察泛影葡胺对肾小管上皮细胞的形态、增殖和凋亡的影响,共聚焦荧光显微镜以及透射电镜下观察细胞自噬程度,RT-PCR检测肾损伤分子（kidney injury molecule 1,KIM-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质转运蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）的表达水平,蛋白质免疫印迹检测Bcl2、Bax、Caspase3、Beclin-1、LC3、P62、p-PKCβ2、PKCβ2、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38 和 p38 的表达。3.使用siPKCβ2、PKCβ2抑制剂LY333531及自噬抑制剂3-MA观察肾小管上皮细胞的凋亡、自噬及系列分子表达,探讨PKCβ2/Akt/c-JNK1/p38磷酸化信号传导通路在其中的保护作用。研究结果:1.糖尿病小鼠模型中,灯盏花素降低糖尿病+CIN小鼠的蛋白尿和血清肌酐水平。灯盏花素可逆转糖尿病+CIN组管状萎缩和纤维化以及肾小球毛细血管基底膜的糖原积累。灯盏花素显着减少糖尿病+CIN组collagen Ⅰ、CTGF和TGFβ1的蛋白及RNA表达。2.糖尿病小鼠模型中,糖尿病组和糖尿病+CIN组PKCβ2磷酸化的表达均升高,而灯盏花素可以下调PKCβ2磷酸化。糖尿病组、糖尿病+CIN组Akt、c-JNK以及p38的磷酸化显着增加,而灯盏花素可以下调糖尿病+CIN小鼠的Akt、c-JNK1/2和p38磷酸化表达水平。提示灯盏花素通过PKCβ2/Akt/c-JNK1/2/p38磷酸化信号传导在保护肾功能方面发挥了至关重要的作用。3.肾小管上皮细胞离体培养实验中,泛影葡胺组及AGEs组的HK-2细胞的存活能力显着下降,泛影葡胺组、AGEs组以及泛影葡胺+AGEs组都显着促进了肾小管上皮细胞的凋亡,泛影葡胺+AGEs组肾小管上皮细胞的凋亡率最显着。泛影葡胺和AGEs促进肾小管上皮细胞中凋亡标志物caspase3的表达。RT-qPCR实验结果显示泛影葡胺和AGEs促进KIM-1和NGAL的mRNA表达水平。4.肾小管上皮细胞离体培养实验中,AGEs环境下泛影葡胺处理肾小管上皮细胞的Beclin-1的蛋白质表达水平以及LC3 Ⅱ转位比例最高。同时,泛影葡胺组、AGEs组以及泛影葡胺+AGEs组肾小管上皮细胞p62的表达明显降低,且泛影葡胺+AGEs组下降最明显。PKCβ2以及p-PKCβ2在泛影葡胺+AGEs组表达明显升高。5.AGEs环境下,细胞流式仪结果显示泛影葡胺导致肾小管上皮细胞的凋亡率显着上升,而siPKCβ2使肾小管上皮细胞的凋亡率明显下降,PKCβ2抑制剂LY333531也能够改善凋亡。在AGEs环境下,泛影葡胺导致肾小管上皮细胞促凋亡因子Caspase3和Bax表达明显上升,而凋亡抑制因子Bcl-2的表达下降。蛋白质免疫印迹结果显示抑制PKCβ2可降低AGEs环境下泛影葡胺诱导的肾小管上皮细胞ERK/JNK/p38通路的活性,促进自噬相关因子如Beclin-1和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ表达。6.在AGEs环境下,泛影葡胺诱导肾小管上皮细胞PKCβ2mRNA表达及蛋白表达升高,加入自噬抑制剂3-MA后,PKCβ2和磷酸化的PKCβ2的表达被抑制。PKCβ2抑制剂LY333531能促进肾小管上皮细胞的自噬。结论:1.灯盏花素可以改善糖尿病小鼠CIN的发展,此归因于其通过抑制PKCβ2/Akt/JNK1/2/p38信号传导通路抑制肾纤维化、及减少细胞凋亡。2.造影剂泛影葡胺显着抑制AGEs孵育环境下肾小管上皮细胞的增殖,并促进细胞的凋亡以及抑制保护性自噬。3.PKCβ2在造影剂泛影葡胺诱导糖尿病肾脏损伤中,可能起到关键信号通路作用。
谭永安[10]（2019）在《磷脂酶C、E75在绿盲蝽蜕皮激素信号传导中的功能分析》文中认为绿盲蝽寄主范围广泛,可以危害林木、果树和多种经济作物。昆虫蜕皮激素（20E）信号传导通路的研究现已成为昆虫学研究的热点,磷脂酶C（Phospholipases C,PLC）参与调节多种激素和神经递质信号的转导,但其基因特征及在绿盲蝽（Apolygus lucorum）20E信号传导中的功能尚不清晰。E75是20E信号通路重要的下游应答基因,该基因的生物学特性及其在20E调控绿盲蝽繁殖中的功能尚不明确。因此,本论文采用iTRAQ分析、RACE、RNAi等研究手段,分析绿盲蝽20E信号通路中的PLC、E75的生化特征,并对其在20E信号传导中的功能进行了研究。主要研究结果如下:1.为在蛋白质组学层面阐明PLC可介导20E信号通路的传递,采用iTRAQ法对四种不同处理（20E、20E+U73122、U73122和丙酮）的绿盲蝽中肠温育样本进行了分析,明确了PLC参与了20E信号传导。发现20E处理与丙酮相比有差异表达的蛋白达100种,其中19种蛋白表达上调,81种蛋白表达下调;磷脂酶抑制剂U73122处理与丙酮处理相比,差异蛋白有261种,其中42种蛋白上调,219种蛋白下调;20E vs丙酮与U73122 vs丙酮比较发现,这两组有20种共同差异蛋白,这些蛋白在各自组内表达模式相反;20E vs丙酮、U73122 vs丙酮和20E+U73122 vs丙酮的三组处理分析发现,有20种共同差异蛋白,但其表达方式相反的是5个核糖体蛋白;Venn图结果发现,20E vs丙酮和U73122 vs丙酮两组内有13个相同蛋白,包含表达方式相反的5个核糖体蛋白,在20E+U73122 vs丙酮比较组内有7个相同蛋白。根据上述差异蛋白表达结果并结合已报道的相关研究,推测20E可调控PLC表达,激活其下游通路IP3-TOR-EcR/USP-Myc-核糖体生物合成。2.为在基因层面研究PLC在20E传导中的功能,在前期获得绿盲蝽cDNA文库的基础上,利用RACE法获得了绿盲磷脂酶C（AlPLCγ）基因全长序列,qRT-PCR明晰了绿盲蝽AlPLCγ基因不同日龄的表达量情况,利用Northern Blot分析了不同组织和不同时期的AlPLCγ基因mRNA表达量,获得了具有酶活力的重组蛋白,阐明了该重组蛋白的酶学性质,最后制备了高特异性AlPLCγ的单克隆抗体,为在蛋白水平上解析AlPLCγ的功能奠定基础。AlPLCγ的开放阅读框含有3267 bp的核苷酸,编码1088个氨基酸,预测分子量为124.87 kD,理论等电点预测为6.11。AlPLCγ基因在绿盲蝽表皮、中肠和脂肪体均可表达,在若虫蜕皮、羽化时呈现出高表达特征。重组蛋白AlPLCγ可表达一个约79 kDa的蛋白,并以包涵体形式存在,经过变性及复性获得具有了纯化蛋白,该蛋白酶促反应最适温度为57℃（179.54±3.962 nmol/μg/min）,最佳反应pH为8.7（374.99±2.838 nmol/μg/min）。Western blot分析显示,制备的单克隆抗体不仅能与绿盲蝽总蛋白结合,还可与AlPLCγ重组蛋白结合,表明AlPLCγ单克隆抗体特异性较好。3.为进一步阐明AlPLCγ可介导绿盲蝽20E信号通路的传导,在获得AlPLCγ基因全长及抗体的基础上,对20E、20E+U73122、U73122及丙酮4个处理后的中肠组织中的AlPLCγ酶活、mRNA表达量及蛋白表达量,第二信使（IP3和DAG）的含量进行分析,并对20E信号通路中的6个下游基因的mRNA表达量的变化趋势进行了研究。结果表明:20E可诱导AlPLCγ酶活及基因表达量,而磷脂酶C抑制剂U73122处理下的AlPLCγ酶活及基因表达量显着下降;Western blot表明不同处理对AlPLCγ蛋白含量的影响与上述结果一致。20E可显着提高IP3和DAG的含量,在处理后1.5 h后达到峰值（3.82 ng/μg和29.63 pmol/L）,反之U73122处理后的IP3和DAG含量显着下降。Tre-1、Tre-2、E75A、E75D、EcR-A和EcR-B是20E信号通路中的下游基因,20E可显着提高这6种20E应答基因mRNA的表达,而U73122可显着抑制6种20E应答基因mRNA的表达。表明AlPLCγ可参与20E信号通路,可以调控其下游基因的转录与表达。4.E75是昆虫蜕皮级联反应中的早期转录因子之一,也是AlPLCγ影响20E信号通路中的重要下游基因。蜕皮激素可调控昆虫繁殖,因此,我们进一步阐明了E75是否在绿盲蝽繁殖中发挥功能。AlE75A的开放阅读框含有2241 bp的核苷酸,预测分子量为69.04 kD。qRT-PCR表明AlE75A在雌成虫7日龄时高表达,检测的5个组织中AlE75A均可表达,在脂肪体和卵巢中表达量最高。Northern blot结果表明,6个组织中AlE75A基因可检测到一个长度为3.2 kb的mRNA。分别在AlE75A基因的A/B域和D域设计了RNAi靶点,RNAi试验结果表明,与对照相比（Negative control）相比,初始羽化的雌成虫注射siRNA后,雌虫寿命及产卵量显着下降,卵孵化率也呈现出显着降低的趋势。为解析上述内在机制,选择绿盲蝽卵黄元蛋白（AlVg）进行研究,发现AlVg基因的mRNA表达模式和AlE75A相似,也可受20E诱导;当将AlE75A基因表达量下调后,AlVg基因mRNA及蛋白表达量显着下降。说明20E在调控绿盲蝽繁殖过程中,可通过其应答基因AlE75A来调控AlVg的表达而影响繁殖。5.为丰富绿盲蝽E75基因在20E信号通路中的功能,利用RACE法克隆绿盲蝽20E下游基因AlE75D全长,qRT-PCR法分析绿盲蝽不同日龄成虫（1-16 d）及7日龄雌成虫6种组织（脂肪体、飞行肌、卵巢、马氏管、中肠和表皮）中该基因的mRNA表达水平,进行了特异性表达重组AlE75D蛋白,制备该重组蛋白的单克隆抗体,通过Western blot验证该抗体的特异性。从绿盲蝽中克隆获得了20E下游基因AlE75D,其开放阅读框1911 bp,编码636个氨基酸,预测分子量为75.68 kD;该基因编码蛋白具有E75D的典型特征,由A/B域（23 aa）、D域（85 aa）、E域（190 aa）和F域（338 aa）组成,但缺失C域;绿盲蝽AlE75D的氨基酸序列与半翅目蝽科的豆荚草盲蝽Lygus hesperus的E75D基因序列一致性最高（为98%）。AlE75D基因在成虫期均有表达,在7日龄雌成虫中达到峰值;此外,AlE75D在雌成虫6个组织中均有表达,在脂肪体及卵巢中高表达。双酶切后的重组克隆载体可成功亚克隆到pCzn1载体上;IPTG可成功诱导pCzn1-AlE75D重组质粒特异性表达一个约75 kD的蛋白,以Ni-NTA琼脂糖树脂凝胶纯化的重组蛋白为抗原,获得了一株能稳定传代并分泌抗AlE75D蛋白单克隆抗体的细胞株,该单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及AlE75D重组蛋白特异性结合。AlE75D在绿盲蝽体内的表达具有发育阶段特异性和组织特异性;获得的重组蛋白的单克隆抗体具有高特异性,为在蛋白水平上分析该基因的功能奠定基础。
二、重组信号分子GRF的PH结构域抑制蛋白激酶C活性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组信号分子GRF的PH结构域抑制蛋白激酶C活性（论文提纲范文）
（1）PLCG2基因P645L和N798S突变在儿童炎症性肠病中的致病机制初探（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究框架 |
| 引言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 PLCG2基因及其信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间参与课题情况 |
| 硕士期间参与会议及获奖情况 |
（2）外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 Dvl3在RA患者以及小鼠CIA模型关节滑膜中的表达情况 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 外泌体Dvl3 mRNA对RA-FLS增殖、凋亡、迁移以及炎症因子分泌的影响 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 外泌体Dvl3 mRNA对胶原诱导关节炎小鼠模型关节炎症的影响 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 外泌体Dvl3 mRNA通过调控Wnt途径参与影响RA-FLS生物学行为 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 复杂Wnt信号通路网络中的舞者：Dvl蛋白 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表和参与科研工作情况 |
| 致谢 |
（3）Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及调控机制研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 Drp1在缺血缺氧损伤中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 创伤休克血管低反应性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）玉米穗行数QTL qKRN5b的克隆和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 玉米穗部性状的遗传调控 |
| 1.1.1 玉米花序发育的主要特征 |
| 1.1.2 玉米分支系统的形态建成、遗传调控及驯化 |
| 1.1.3 玉米花器官有限性及性别分化的遗传调控 |
| 1.1.4 玉米花序分生组织维持的遗传调控 |
| 1.2 玉米穗行数调控的遗传基础 |
| 1.2.1 连锁作图解析穗行数遗传基础 |
| 1.2.2 结合关联分析挖掘穗行数相关位点 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子标记开发 |
| 2.2.2 qKRN5近等基因系的构建 |
| 2.2.3 qKRN5近等基因系的遗传效应分析 |
| 2.2.4 qKRN5在不同遗传背景下的遗传效应评估 |
| 2.2.5 q KRN5与KRN4 的互作分析 |
| 2.2.6 qKRN5的精细定位 |
| 2.2.7 qKRN5a和 qKRN5b互作分析 |
| 2.2.8 qKRN5b的精细定位 |
| 2.2.9 qKRN5b候选基因克隆与序列分析 |
| 2.2.10 KRN5b的表达分析 |
| 2.2.11 KRN5b启动子活性分析 |
| 2.2.12 KRN5b的蛋白结构和系统进化分析 |
| 2.2.13 KRN5b磷酸肌醇磷酸酶体外验证 |
| 2.2.14 KRN5b遗传转化载体构建 |
| 2.2.15 KRN5b突变体的表型分析 |
| 2.2.16 I(1,4,5)P3含量测定 |
| 2.2.17 KRN5b过表达遗传转化载体构建 |
| 2.2.18 qKRN5b有利等位基因的分子标记辅助选择 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 qKRN5近等基因系遗传背景评估 |
| 3.2 qKRN5近等基因系间的表型差异 |
| 3.3 不同遗传背景下qKRN5的遗传效应 |
| 3.4 q KRN5和KRN4 间的遗传互作 |
| 3.5 qKRN5的精细定位及剖分 |
| 3.6 q KRN5a与 q KRN5b的遗传互作 |
| 3.7 qKRN5b的精细定位 |
| 3.8 qKRN5b候选基因克隆及序列分析 |
| 3.9 KRN5b的表达分析 |
| 3.10 KRN5b启动子活性分析 |
| 3.11 KRN5b蛋白和玉米5PTase家族的系统进化 |
| 3.12 KRN5b的磷酸酶活性分析 |
| 3.13 KRN5b突变系的表型 |
| 3.14 KRN5b活性影响玉米雌穗的I(1,4,5)P3 水平 |
| 3.15 KRN5b参与光合系统膜调控和非生物刺激的表达调控 |
| 3.16 分子标记辅助选择改良玉米穗行数 |
| 4 讨论 |
| 4.1 玉米染色体5.02bin是一个影响玉米产量性状的热点 |
| 4.2 qKRN5b是一个穗行数的加性位点 |
| 4.3 qKRN5连锁位点的育种应用策略 |
| 4.4 KRN5b可用于玉米籽粒产量的遗传改良 |
| 4.5 KRN5b通过参与磷酸肌醇途径调节花穗发育 |
| 4.6 qKRN5b的功能位点 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 CTAB法提玉米叶片小样DNA |
| 附录2 SSR标记PCR体系 |
| 附录3 聚丙烯凝胶电泳 |
| 附录4 碱裂解法提玉米籽粒DNA |
| 附录5 引物序列 |
| 附录6 Trizol法提植物总RNA |
| 附录7 原位杂交 |
| 附录8 大肠杆菌质粒提取 |
| 附录9 qKRN5NX531和q KRN5SIL8 幼穗中的差异表达基因 |
| 附录10 qKRN5NX531 中下调表达基因的GO显着富集结果 |
| 附录11 作者简介及在读期间发表的文章 |
| 致谢 |
（5）胞浆接头蛋白Dok5的表达纯化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1. 细胞信号转导与酪氨酸激酶 |
| 2. Dok家族蛋白 |
| 3. Dok5与c-Ret受体 |
| 4. Dok5与TrkB/C受体 |
| 5. Dok5与NSR受体 |
| 第二章 实验材料 |
| 1. 菌株 |
| 2. 细胞株 |
| 3. 质粒载体 |
| 4. 细胞培养基及试剂 |
| 5. DNA引物 |
| 6. 常用试剂及耗材 |
| 7. 主要仪器和设备 |
| 8. 软件及网络资源 |
| 第三章 实验方法 |
| 1. 基因的基本信息分析 |
| 2. 基因的克隆与质粒构建 |
| 2.1 PCR扩增 |
| 2.2 PCR产物回收 |
| 2.3 双酶切载体和目的片段 |
| 2.4 目的片段与载体连接反应 |
| 2.5 目的片段与载体同源重组 |
| 2.6 转化 |
| 2.7 菌液PCR鉴定 |
| 2.8 质粒提取 |
| 2.9 酶切与测序鉴定 |
| 3. 昆虫细胞培养与传代 |
| 3.1 细胞复苏 |
| 3.2 细胞传代 |
| 3.3 细胞冻存 |
| 3.3.1 High5细胞冻存 |
| 3.3.2 SF21细胞冻存 |
| 4. 原核表达系统 |
| 4.1 原核表达质粒的构建与鉴定 |
| 4.2 最适诱导菌株的筛选 |
| 4.3 最适诱导温度的确定 |
| 4.4 最适IPTG诱导浓度的确定 |
| 4.5 重组蛋白的分离纯化 |
| 4.6 重组蛋白的鉴定 |
| 5. 昆虫细胞蛋白表达系统 |
| 5.1 重组pFastBac1质粒的构建 |
| 5.2 重组pFastBac1质粒转化DH10 Bac感受态细胞 |
| 5.3 重组Bacmid的提取 |
| 5.4 重组Bacmid的鉴定 |
| 5.5 转染SF21细胞 |
| 5.6 P1-P3病毒制备 |
| 5.7 目的蛋白表达检测 |
| 第四章 实验结果 |
| 1. Dok5基因和蛋白结构分析 |
| 1.1 Dok5基因结构分析 |
| 1.2 Dok5蛋白结构分析 |
| 2. Dok5蛋白的原核表达 |
| 2.1 Dok5原核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2 Dok5重组蛋白在原核表达系统中的表达 |
| 2.3 Dok5重组蛋白在原核表达系统中的大量表达及纯化鉴定 |
| 3. Dok5蛋白的昆虫细胞表达 |
| 3.1 Dok5重组pFastBac1质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 重组Bacmid的鉴定 |
| 3.3 Dok5重组蛋白在昆虫细胞表达系统中的检测 |
| 第五章 结果讨论 |
| 第六章 展望 |
| 第七章 小结 |
| 附件 |
| 个人简历 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）菠菜SpoPH1基因克隆及其高温应答功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 高温胁迫对植物生长的影响 |
| 1.2.1 高温胁迫影响植物的抗氧化系统 |
| 1.2.2 高温胁迫影响植物渗透调节 |
| 1.2.3 高温胁迫影响植物光合作用 |
| 1.3 植物耐热机制的蛋白质组学进展 |
| 1.4 植物耐热机制的分子生物学进展 |
| 1.5 菠菜高温胁迫应答研究进展 |
| 1.5.1 菠菜高温胁迫应答的信号通路 |
| 1.5.2 菠菜高温胁迫应答的ROS清除途径 |
| 1.5.3 高温胁迫诱导菠菜转录因子的调控与蛋白加工 |
| 1.6 PH基因的生物学研究进展 |
| 1.6.1 PH结构域 |
| 1.6.2 PH结构域的功能 |
| 1.6.3 含有PH结构域蛋白的功能 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株及质粒载体 |
| 2.1.3 实验试剂盒 |
| 2.1.4 实验所需试剂及培养基的配制 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验材料培养与处理 |
| 2.2.2 菠菜SpoPH1 基因全长的克隆 |
| 2.2.3 菠菜SpoPH1 生物信息学研究 |
| 2.2.4 RT-qPCR |
| 2.2.5 载体构建 |
| 2.2.6 农杆菌介导的烟草瞬时表达 |
| 2.2.7 SpoPH1 转基因酵母耐热性分析 |
| 2.2.8重组蛋白(His)6-SpoPH1 纯化和磷脂酰肌醇结合实验 |
| 2.2.9 植物表达载体质粒转化农杆菌 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 菠菜SpoPH1 基因全长的克隆 |
| 3.1.1 叶片RNA的提取 |
| 3.1.2 菠菜SpoPH1 基因的克隆 |
| 3.2 菠菜SpoPH1 基因的生物信息学分析 |
| 3.2.1 SpoPH1 基因全长的序列分析 |
| 3.2.2 PH蛋白的系统发育树分析 |
| 3.2.3 PH蛋白家族多重序列比对 |
| 3.2.4 SpoPH1 蛋白三维立体模型的构建 |
| 3.3 菠菜Sp73和Sp75 高温处理下SpoPH1/SpoPH2 基因表达水平分析 |
| 3.4 菠菜SpoPH1 不同发育时期的基因表达 |
| 3.4.1 菠菜六叶期SpoPH1 在不同器官中的表达 |
| 3.4.2 菠菜抽薹期SpoPH1 在不同器官中的表达 |
| 3.5 SpoPH1 蛋白的亚细胞定位 |
| 3.5.1 植物表达载体pBI121-SpoPH1-GFP的构建 |
| 3.5.2 pBI121-SpoPH1-GFP质粒转化农杆菌 |
| 3.5.3 SpoPH1 蛋白在烟草中的瞬时表达 |
| 3.6 SpoPH1 转基因酵母的高温表型分析 |
| 3.6.1 pYES2-SpoPH1 酵母表达载体的构建 |
| 3.6.2 酵母表达载体pYES2-SpoPH1 转化野生型酵母 |
| 3.6.3 SpoPH1 转基因酵母的高温表型分析 |
| 3.7 菠菜SpoPH1 蛋白与磷脂酰肌醇的结合分析 |
| 3.7.1 原核表达载体pET32a-SpoPH1 的构建 |
| 3.7.2 SpoPH1 蛋白与磷脂酰肌醇的结合 |
| 3.8 SpoPH1 过表达拟南芥的筛选 |
| 3.8.1 植物表达载体pBI121-SpoPH1 的构建 |
| 3.8.2 植物表达载体pBI121-SpoPH1 转化农杆菌 |
| 3.8.3 SpoPH1 过表达拟南芥的筛选 |
| 3.9 AtPH1 突变体的纯合验证 |
| 3.10 SpoPH1 回补拟南芥AtPH1 突变体的鉴定 |
| 3.11 菠菜SpoPH1 基因对拟南芥表型的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 菠菜SpoPH1的PH结构域特征 |
| 4.2 菠菜SpoPH1 蛋白定位于细胞质 |
| 4.3 菠菜SpoPH1 蛋白结合磷脂酰肌醇参与细胞信号转导 |
| 4.4 菠菜SpoPH1 参与高温胁迫应答 |
| 4.5 菠菜SpoPH1 影响拟南芥根的生长 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、AFAP1L1 在 NSCLC 中的表达及临床意义 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 AFAP1L1在NSCLC组和正常肺组织组中的表达 |
| 1.2.2 AFAP1L1 表达与 NSCLC 患者临床病理特征及病理分期的关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、shRNA 沉默 AFAP1L1 对肺癌细胞功能影响的体外研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 AFAP1L1基因在肺癌细胞系中的表达 |
| 2.2.2 shRNA靶点设计和AFAP1L1 基因慢病毒载体构建 |
| 2.2.3 RT-PCT检测AFAP1L1 m RNA表达 |
| 2.2.4 Western Blot检测AFAP1L1 的蛋白表达 |
| 2.2.5 shRNA沉默AFAP1L1 导致A549 细胞增殖降低 |
| 2.2.6 shRNA沉默AFAP1L1 抑制A549 细胞周期进程 |
| 2.2.7 shRNA沉默AFAP1L1 促进A549 细胞凋亡 |
| 2.2.8 shRNA沉默AFAP1L1对A549 细胞侵袭能力的影响 |
| 2.2.9 Path Scan细胞内信号转导阵列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 AFAP1L1的结构与功能 |
| 2.3.2 RNA干扰及对AFAP1L1 基因的沉默作用 |
| 2.3.3 慢病毒载体介导的 RNA 干扰 AFAP1L1 表达对肺癌细胞 A549 生物学功能的影响 |
| 2.3.4 AFAP1L1抑制肿瘤生长的作用机制探讨 |
| 2.4 小结 |
| 三、AFAP1L1抑制肺腺癌细胞生长的体内试验研究 |
| 3.1 对象及方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 慢病毒转染A549细胞 |
| 3.2.2 MTT 检验细胞增殖能力 |
| 3.2.3 移植瘤的生长情况及活体成像情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 裸鼠移植瘤模型的建立 |
| 3.3.2 慢病毒载体及其介导的RNA干扰应用 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 APAP家族:结构、功能及在肿瘤中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）OPTN基因表达对卵巢癌和宫颈癌细胞耐药性的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| PI3K-AKT-mTOR 信号通路与肿瘤细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）蛋白激酶Cβ2信号通路介导对比剂诱导糖尿病肾小管上皮细胞损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 灯盏花素通过PKC/Akt/MAPK信号通路改善糖尿病小鼠造影剂肾病 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 晚期糖基化终产物环境下泛影葡胺引起的肾小管上皮细胞损伤 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 PKCβ2信号通路介导糖尿病肾小管上皮细胞自噬和凋亡的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 探讨蛋白激酶CP2以及自噬在造影剂肾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词英汉对照表 |
| 博士期间发表论文及参加课题 |
| 致谢 |
（10）磷脂酶C、E75在绿盲蝽蜕皮激素信号传导中的功能分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 概述 |
| 2 昆虫蜕皮激素传导的基因组途径 |
| 3 蜕皮激素的核受体及其功能 |
| 4 昆虫蜕皮激素传导的非基因组途径 |
| 5 PLC生物学特性及功能 |
| 6 蜕皮激素级联反应 |
| 6.1 20E诱导的转录因子 75 |
| 6.2 20E 诱导的转录因子 74 |
| 6.3 变态起始因子 |
| 7 同重同位素相对与绝对定量(iTRAQ) |
| 8 研究目的意义和研究内容 |
| 8.1 研究意义 |
| 8.2 研究内容 |
| 第二章 基于i TRAQ分析绿盲蝽磷脂酶C基因Al PLC在蜕皮激素传导中的功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 样品准备 |
| 2.3 蛋白质提取和消化 |
| 2.4 iTRAQ标签 |
| 2.5 高pH Reversce反相分配色谱法分离 |
| 2.6 LC-ESI-MS/质谱分析 |
| 2.7 iTRAQ蛋白质鉴定和定量 |
| 2.8 生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 20 E处理绿盲蝽后不同差异蛋白表达分析 |
| 3.2 磷酯酶C抑制剂处理后绿盲蝽后不同差异蛋白表达的分析 |
| 3.3 20 E和 U73122 处理绿盲蝽后共同差异蛋白表达分析 |
| 3.4 20 E、U73122和20E+U73122 处理绿盲蝽后差异蛋白表达分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 第三章 绿盲蝽磷脂酶C基因Al PLCγ的克隆、表达、酶学性质及单克隆抗体的制备 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 绿盲蝽总RNA的分离及cDNA第一链的合成 |
| 2.3 Al PLCγ基因5’端序列的克隆 |
| 2.4 Al PLCγ基因3’端序列的克隆 |
| 2.5 Al PLCγ基因全长的拼接 |
| 2.6 不同日龄绿盲蝽总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.8 Northern Blot分析 |
| 2.9 表达载体的构建 |
| 2.10 融合蛋白的原核诱导表达 |
| 2.11 融合蛋白的变复性 |
| 2.12 融合蛋白的Ni柱亲和纯化 |
| 2.13 重组AlPLCγ蛋白的酶学特性 |
| 2.14 AlPLCγ单克隆抗体的制备 |
| 2.14.1 免疫 |
| 2.14.2 建立杂交瘤细胞株 |
| 2.14.3 制备腹水 |
| 2.14.4 抗体的纯化 |
| 2.14.5 Western-blot检测单克隆抗体的特异性 |
| 2.15 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 绿盲蝽AlPLCγ基因的克隆及序列分析 |
| 3.2 绿盲蝽AlPLCγ基因的系统发育分析 |
| 3.3 绿盲蝽AlPLCγ基因表达特性分析 |
| 3.4 重组AlPLCγ的表达、复性及纯化 |
| 3.5 重组蛋白AlPLCγ磷脂酶活力的检测 |
| 3.6 不同温度下重组蛋白AlPLCγ的酶活测定 |
| 3.7 不同pH下重组AlPLCγ蛋白的酶活测定 |
| 3.8 AlPLCγ单克隆抗体的制备与特异性检测 |
| 4 结论与讨论 |
| 第四章 绿盲蝽AlPLCγ对20E下游应答基因表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 样品处理 |
| 2.3 AlPLCγ酶活、mRNA表达量及蛋白含量 |
| 2.4 第二信使IP_3 分析 |
| 2.5 第二信使DAG含量 |
| 2.6 绿盲蝽蜕皮激素响应基因mRNA表达量的分析 |
| 2.7 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同处理对绿盲蝽AlPLCγ酶活性、基因mRNA表达量的影响 |
| 3.2 不同处理对绿盲蝽AlPLCγ蛋白含量的影响 |
| 3.3 不同处理对第二信使IP_3和DAG含量的影响 |
| 3.4 不同处理对20E下游应答基因mRNA表达量的影响 |
| 4 结论与讨论 |
| 第五章 蜕皮激素受体E75在绿盲蝽繁殖中的功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 Al E75A基因克隆 |
| 2.3 体外翻译 |
| 2.4 Al E75A基因mRNA表达谱 |
| 2.5 Northern Blot分析 |
| 2.6 siRNA注射 |
| 2.7 RNAi效果检测 |
| 2.8 Western blot分析 |
| 2.9 Al Vg表达谱分析 |
| 2.10 20 E处理 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 绿盲蝽Al E75A基因全长序列特征 |
| 3.2 AlE75A表达谱分析 |
| 3.3 体内敲除AlE75A基因对繁殖力的影响 |
| 3.4 20 E对绿盲蝽AlVg基因表达量的影响 |
| 3.5 AlE75A RNAi对 AlVg基因表达的影响 |
| 3.6 AlE75A RNAi对AlVg蛋白水平的影响 |
| 4 结论与讨论 |
| 第六章 绿盲蝽蜕皮激素响应基因E75D的克隆及表达特性 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 绿盲蝽Al E75D全长基因的克隆 |
| 2.3 荧光定量PCR反应 |
| 2.4 AlE75D基因在大肠杆菌Arctic Express中的表达 |
| 2.5 重组AlE75D蛋白的纯化 |
| 2.6 单克隆抗体的制备 |
| 2.6.1 免疫 |
| 2.6.2 建立杂交瘤细胞株 |
| 2.6.3 制备腹水 |
| 2.7 单克隆抗体的鉴定 |
| 2.7.1 抗体的纯化 |
| 2.7.2 Western-blot检测单克隆抗体的特异性 |
| 2.8 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AlE75D的克隆与序列分析 |
| 3.2 AlE75D基因的表达特性 |
| 3.3 AlE75D的原核表达 |
| 3.4 重组蛋白的Ni柱亲和纯化 |
| 3.5 抗AlE75D蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.6 AlE75D蛋白单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 4 结论与讨论 |
| 第七章 全文总结 |
| 1 主要研究结果 |
| 1.1 iTRAQ法明确了PLC可参与绿盲蝽蜕皮激素信号的传导 |
| 1.2 明确了绿盲蝽Al PLCγ的生化特征 |
| 1.3 阐明了Al PLCγ在20E及U73122诱导下的应答反应 |
| 1.4 明确了绿盲蝽E75在20E调控绿盲蝽繁殖中的功能 |
| 2 主要创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 附表 |
| 参考文献 |
四、重组信号分子GRF的PH结构域抑制蛋白激酶C活性（论文参考文献）
- [1]PLCG2基因P645L和N798S突变在儿童炎症性肠病中的致病机制初探[D]. 杨惠芳. 汕头大学, 2021(02)
- [2]外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制[D]. 谭卫星. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究[D]. 段晨阳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [4]玉米穗行数QTL qKRN5b的克隆和功能研究[D]. 申晓蒙. 华中农业大学, 2020
- [5]胞浆接头蛋白Dok5的表达纯化[D]. 庞云丽. 北京协和医学院, 2020(05)
- [6]菠菜SpoPH1基因克隆及其高温应答功能分析[D]. 祁楠. 上海师范大学, 2020(07)
- [7]shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究[D]. 王猛. 天津医科大学, 2020(06)
- [8]OPTN基因表达对卵巢癌和宫颈癌细胞耐药性的影响[D]. 王鹏. 安徽医科大学, 2020(02)
- [9]蛋白激酶Cβ2信号通路介导对比剂诱导糖尿病肾小管上皮细胞损伤的机制研究[D]. 姜文兵. 苏州大学, 2019(06)
- [10]磷脂酶C、E75在绿盲蝽蜕皮激素信号传导中的功能分析[D]. 谭永安. 南京林业大学, 2019(05)