一、鸡传染性法氏囊病新型疫苗的研制策略（论文文献综述）
秦颖[1]（2021）在《传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析》文中提出传染性法氏囊病（Infectious bursal disease）又称甘布洛病（Gumboro disease）,是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus）引起的鸡的急性、高度接触性、传染性疾病,严重危害养禽业发展。传染性法氏囊病主要感染3-6周龄雏鸡,引起严重的免疫抑制。近年来出现的新型变异株主要变现为法氏囊萎缩,虽不致死,但导致鸡的严重免疫抑制。由于传染性法氏囊病病毒由相对独立的两个节段组成,其不同毒株重组的可能性极高,导致不同毒株之间重组病毒的出现。超强毒株持续流行,变异株以及重组病毒的不断出现对传染性法氏囊病的防控形成了巨大的挑战。本研究分离鉴定了两株传染性法氏囊病病毒,对其进行遗传进化树及氨基酸序列分析,并针对VP2蛋白通过原核表达以及杆状病毒表达两种表达系统分别进行表达,将表达产物粗提纯后免疫SPF鸡,验证其免疫原性,为传染性法氏囊病的防控以及疫苗的研发提供了数据参考。1传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定本研究从临床上发生严重法氏囊萎缩的送检病料中用鸡胚接种分离出两株传染性法氏囊病病毒,该病毒可以在鸡胚上增殖;利用传染性法氏囊病特异性引物对其中一株进行全基因测序,对另一株VP1及VP2基因进行扩增测序,并通过生物信息学软件进行遗传进化树和氨基酸序列分析,结果表明两株分离株一株为新型重组病毒,一株为新型变异株。分离的新型重组病毒VP2基因属于超强毒株分支,而VP1基因属于非超强毒株分支。氨基酸序列分析发现该分离株VP2基因编码的氨基酸具有超强毒株所特有的氨基酸序列,和超强毒株同源性最高（99%-99.4%）,VP1基因编码的氨基酸具有弱毒株所特有的氨基酸序列,和弱毒株同源性最高（99.3%-99.8%）,遗传进化树和氨基酸分析结果表明该分离株为超强毒株和弱毒株的重组病毒。分离的新型变异株和中国分离的新型变异株同属于新型变异株分支,与新型变异株同源性达96.2%-98.2%,氨基酸序列分析该分离株具有新型变异株同源性氨基酸序列。本研究分离的两株传染性法氏囊病病毒为传染性法氏囊病的流行趋势以及防控提供了参考。2不同表达系统表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白传染性法氏囊病病毒的防控主要依赖于疫苗免疫预防,疫苗的研发是传染性法氏囊病防控的基础。本研究采用原核表达系统和杆状病毒表达系统分别表达VP2蛋白,将VP2基因成功克隆到原核表达载体pET-28a以及杆状病毒表达质粒中,构建了原核表达载体pET-28a-VP2和重组杆状病毒re-Bac-1-GP67-VP2,两种表达系统均成功表达了 VP2蛋白,原核表达系统主要以包涵体形式表达在裂解后的沉淀中,表达量约占蛋白总量的33%,杆状病毒表达系统以可溶性形式分泌到培养上清中,表达量约占总蛋白量的11%,优化表达条件后收集表达的蛋白,表达的蛋白均可与VP2单抗发生反应,具有一定的生物活性,为后续免疫原性试验提供了基础。3两种VP2重组蛋白免疫原性比较将上述重组蛋白大量表达,经粗提纯后混合佐剂制备疫苗,按照免疫程序免疫SPF鸡,免疫后采血测血清抗体效价,并于免疫后21天进行攻毒保护试验,剖检观察法氏囊大体变化,通过病理组织学分析法氏囊病理变变化,测定排毒量和病毒载量。试验结果表明,杆状病毒表达重组蛋白效果明显优于大肠杆菌表达重组蛋白免疫效果,其法氏囊病理损伤程度较低,血清学抗体水平高于原核表达产物免疫的抗体水平,病毒载量和排毒量相较于原核表达产物免疫较低,免疫程序对免疫效果也有明显影响,免疫两次效果优于免疫一次。本研究结果为传染性法氏囊病亚单位疫苗研制提供了数据参考。
项瑞[2]（2021）在《鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒重组蛋白的免疫保护效果研究》文中研究指明新城疫、禽流感以及鸡传染性法氏囊病是具有高度传染性的疾病,对多种家禽和野生鸟类均有不同程度的影响,对商品鸡和散养鸡农户都造成了巨大的损失。使用疫苗是控制这些疾病的最主要方法。目前临床上主要使用新流法灭活疫苗进行免疫防控,根据临床调查发生,疫苗免疫,存在免疫效率低,需反复接种等问题。本实验利用实验室已制备鉴定的新城疫重组蛋白（HN、NP、M、F）;禽流感重组蛋白（HA、NA、M1）。同时构建传染性法氏囊VP2蛋白的表达载体p RSFduet1-sumo-VP2（BC6/85）并在大肠杆菌系统中表达,为验证重组蛋白的免疫保护效果,首先分别使用新城疫、禽流感和VP2重组蛋白进行预实验,验证其免疫原性。根据试验结果再制备三联抗原液,检测鸡群免疫后的血清抗体水平。在免疫后第四周,使用新城疫SZ株、传染性法氏囊BC6/85株分别攻毒两组鸡群,本论文的主要研究结果如下。1.传染性法氏囊VP2蛋白的表达及检验将扩增的VP2基因克隆至p RSFduet1-sumo载体,获得p RSFduet1-sumo-VP2重组质粒。经过测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达VP2蛋白。并利用亲和层析镍柱纯化VP2蛋白,最后切割sumo标签。将重组蛋白产物经SDS-PAGE分析,获得目的蛋白条带。经Western-blotting进一步鉴定,VP2蛋白与IBDV阳性血清具有较好的反应性。经双向琼脂扩散实验测得VP2蛋白的AGP效价为1:64。经血凝试验测得NDV重组蛋白的血凝效价为26,AIV重组蛋白产生的血凝效价为29。2.重组蛋白的免疫原性实验先将表达的VP2蛋白与本实验室保存的新城疫、禽流感重组蛋白分别与白油佐剂进行乳化制备抗原液,分别免疫30日龄SPF鸡。再将三种蛋白共同乳化制备抗原液,共同免疫鸡群。在免疫后第14天、21天、28天进行采血分离血清,利用血凝抑制实验和双向琼脂扩散实验测定抗体效价。结果表明:免疫新城疫重组蛋白的鸡群HI效价为3.4log2;免疫禽流感重组蛋白的鸡群HI效价为7.9log2;VP2蛋白免疫组在第4周抗体达到高峰,最高AGP效价为1:128。免疫4周后,100%的鸡群获得有效免疫。三联抗原液免疫实验中,80%的鸡群产生对新城疫的抗体;90%鸡群产生对禽流感的抗体;100%的鸡群产生对传染性法氏囊的抗体。3.新城疫及传染性法氏囊的攻毒实验三联重组蛋白免疫鸡群后28天分别皮下注射新城疫SZ株20μL(含105.0EID50);传染性法氏囊BC6/85株0.2 m L（病毒含量大于100BID-法氏囊感染剂量）进行攻毒实验。结果表明:NDV重组蛋白保护率为90%,IBDV VP2保护率为70%。小结:本研究成功表达了传染性法氏囊VP2蛋白,同时制备了新城疫（基因Ⅶ型）、禽流感（H9亚型）、传染性法氏囊（BC6/85株）三联抗原液,动物试验表明其具有良好免疫保护效果,为后续新流法基因工程亚单位疫苗的研发提供了材料和数据支撑。
范林进[3]（2020）在《鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株的鉴定及疫苗株构建》文中进行了进一步梳理鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的雏鸡的急性、高度接触性、致死性传染病,是危害养禽业最重要的免疫抑制病。IBDV超强毒（Very virulent IBDV,vvIBDV）的感染在我国正逐渐被控制。然而,最近IBD出现了新情况:部分免疫鸡群不断被检出IBDV阳性,虽然不致死鸡,却导致鸡群严重免疫抑制和生产性能下降,造成了严重经济损失,现地称其为非典型IBD。非典型IBD已经成为养禽业健康发展的新威胁,然而其病原特征和流行情况尚不明确。针对养禽业面临的这一严峻问题,本研究开展了流行病学调查,率先鉴定了非典型IBD的病原是IBDV新型变异株,其正在我国主要养禽地区不断蔓延。进而以SHG19株为代表毒株,分别在蛋鸡和肉鸡上评估了IBDV新型变异株的致病性。SHG19株能引起感染鸡急性发病,严重损害中枢免疫器官法氏囊。SHG19感染后4 d,对试验鸡分别免疫禽流感灭活疫苗和新城疫活疫苗,发现试验鸡的HI抗体产生受到明显抑制。另外,SHG19株感染还导致肉鸡增重明显下降,出栏体重比对照鸡减重16%。IBDV新型变异株正在我国免疫鸡群中流行。为了揭示其原因,本研究评估了针对vvIBDV的疫苗对IBDV新型变异株的免疫保护效果,发现所检测的3种不同类型的vvIBDV疫苗对IBDV新型变异株保护效果均不理想。血清交叉中和试验显示,IBDV新型变异株与vvIBDV存在明显的抗原性差异。进一步研究了IBDV新型变异株和vvIBDV的抗原性差异及其分子基础,结果显示,IBDV新型变异株与vvIBDV存在不同的单抗反应谱,2-5C-6F等7株单抗只识别vvIBDV但不识别IBDV新型变异株。抗原表位鉴定结果显示,中和性单抗2-5C-6F识别的抗原表位为VP2的317SGGQAGDQMSWSASGSLAVT336,IBDV新型变异株和vvIBDV在该表位存在两个氨基酸差异,即G318D和D323E。G318D/D323E双点突变使vvIBDV Gx不再能够被单抗2-5C-6F识别,而D318G和（或）E323D突变能使原本不被识别的IBDV新型变异株SHG19获得被单抗2-5C-6F识别的能力。D318G/E323D双点突变还使原本不能被中和的IBDV新型变异株SHG19被单抗2-5C-6F中和。这证明,VP2的318和323位氨基酸突变是IBDV新型变异株逃匿vvIBDV抗体中和活性的关键因素之一。针对新疫情的防控需求,本研究构建并拯救了1株IBDV新型变异株反向遗传疫苗候选株rGtVarVP2,其以弱毒疫苗株Gt的基因组为骨架,用新型变异株SHG19的主要保护性抗原基因替换其相应区段。初步结果显示,IBDV新型变异株反向遗传疫苗候选株rGtVarVP2能够对野毒攻击提供100%免疫保护。靶向养殖业疫病防控急需解决的问题,本研究率先鉴定了非典型IBD的病原是IBDV新型变异株;明确了其组织损伤、免疫抑制、免疫干扰等致病特点;揭示了IBDV新型变异株正在免疫鸡群中蔓延的主要原因;阐明了IBDV新型变异株与vvIBDV的抗原性差异及其分子基础;并初步构建了具有良好免疫效果的候选疫苗株。本研究对于IBD的综合防控和健康养殖具有重要意义。
陈果[4]（2019）在《传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究》文中研究表明传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种危害青年鸡的急性、高度接触性传染病。IBD可直接造成鸡只发病死亡,更重要的是雏鸡的早期感染将引起严重的长期的免疫抑制,导致继发其他疾病及疫苗应答水平降低。因此,该病对养禽业具有重要的经济学意义。目前,免疫预防是控制该病的主要手段。IBDV根据抗原性和致病性的不同,分为致弱毒株（Attenuated）、经典毒株（Classical）、变异毒株（Variant）和超强毒株（vv IBDV）。由于病毒基因组的突变和毒株间的重组,导致IBDV的流行出现新的特点,给免疫防控带来新的挑战。因此本研究对2012-2015年广西IBDV流行株进行分子流行病学研究,以阐明广西IBDV的流行情况。在此基础上,选取1990-2017年分离自中国的IBDV流行株进行时空动态进化分析,以阐明IBDV在中国的时空进化特点。最后,针对IBDV流行的优势基因型毒株进行了新型疫苗的研究。1.2012-2015年广西IBDV分子流行病学研究本研究在2012年9月-2015年12月间从广西疑似IBD发病鸡群中分离鉴定IBDV分离株29株。对IBDV分离株的v VP2基因、VP1b基因进行基因扩增、序列测定和分析。29株分离株v VP2、VP1b基因序列间均具有较高的相似性（≥89.6%（nt）、≥92.4%（aa））。比较v VP2基因序列,29株分离株中有27株分离株与vv IBDV参考毒株间的相似性（≥94.9%（nt）、≥97.5%（aa））高于non-vv IBDV（Variant、classical、attenuated）参考毒株间的相似性（≤94.1%（nt）、≥96.8%（aa））。比较VP1b基因序列,29株分离株与vv IBDV参考毒株间的相似性（86.8%-98.2%（nt）、93.7%-99.6%（aa））和non-vv IBDV参考毒株间的相似性（89.4%-99.9（nt）、95.3%-100%（aa））没有显着差异。基于v VP2、VP1b基因序列绘制系统进化树,29株分离株可以分为4个基因型:vv-A/Att-B、vv-A/Uniq-B、Classical-A/Uniq-B和Att-A/Uniq-B。其中以vv-A/Uniq-B为优势基因型占75.9%（22/29）。2.中国IBDV流行株时空进化分析本研究通过Gen Bank数据库查询、查阅文献、结合本研究第1部分获得的29株IBDV分离株v VP2基因序列,构建了一个包含1990-2017年国内255株IBDV v VP2基因序列的数据集。运用贝叶斯法对该数据集进行进化分析。结果显示255株IBDV v VP2基因序列被分为3个大的进化分支。Cluster 1包含217株毒株,为vv IBDV株。Cluster 2包含15株毒株,又细分为2个分支,其中一个分支为variant株,另一个分支为classical株。Cluster3包含23株毒株,为attenuated株。同时,经分析IBDV v VP2基因的碱基替代速率为7.9001×10-4碱基替代/位点/年。基于IBDV v VP2基因序列数据集绘制的种群动态分布图（Bayesian skyline plots）,IBDV种群经历了平缓（1950-1988）、快速增长（1989-1992）、平缓增长（1993-2008）、极速下降（2009-2012）和再平缓（2013-2017）的过程。3.泛素介导的IBDV及IBDV-IBV二联核酸疫苗的研究本研究将泛素基因（Ub）与广西IBDV优势基因型毒株NN1172的VP2、VP1基因以及广西IBV优势基因型毒株GX-YL5的N、S1基因融合获得重组质粒p VAX1-VP2,p VAX1-Ub-linker-VP2,p VAX1-Ub-linker-VP2-VP1和p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2。重组质粒经PCR、双酶切和序列测定进行了鉴定。4个重组质粒经体外转染Vero细胞对其m RNA和蛋白表达进行了检测。RT-PCR检测表明4个重组质粒瞬时转染Vero细胞均能够正确表达目的基因的m RNA。间接免疫荧光试验（IFA）表明4个重组质粒能够正确表达目的蛋白。动物试验表明,4个重组质粒免疫组血液中CD4+、CD8+T淋巴细胞数量、B淋巴细胞数量、抗IBDV抗体水平以及p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2免疫组抗IBV抗体水平均高于空载体对照组和PBS对照组。攻毒试验结果表明,p VAX1-Ub-linker-VP2免疫组可以抵御IBDV的攻击,p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2免疫组可以同时抵御IBDV和IBV的攻击。4.IBDV B87疫苗株反向遗传学改造及拯救本研究对IBDV B87疫苗株基因组进行分段扩增获得了IBDV全基因组的c DNA克隆。通过多片段融合的方法获得了B87疫苗株基因组A、B节段真核表达质粒,基因组节段的两端分别引入了锤头状核酶结构（Ham Rz）和丁肝病毒核酶结构（Hdv Rz）。随后分别在B87疫苗株基因组A、B节段引入了分子标签Eco R V和Pst I,获得感染性克隆p VAX1-m B87A和p VAX1-m B87B。将重组质粒共转染CEF细胞,经SPF鸡胚传代、RT-PCR、IFA和测序鉴定获得拯救病毒r B87。采用多片段融合的方法,对B87基因组B节段进行了改造,最终获得了5个拯救病毒r B87A-NN1172B、r B87A-NN1172VP1、r B87A-NN1172VP1N、r B87A-NN1172VP1M和r B87A-NN1172VP1C。所有拯救病毒均能使CEF产生CPE、SPF鸡胚死亡。所有拯救病毒感染CEF后,经IFA鉴定均能检测到绿色荧光。体外复制动力学分析表明亲本病毒B87、r B87和r B87A-NN1172VP1C在CEF上的复制曲线相似。r B87A-NN1172VP1在CEF上的平均滴度最高,其次为r B87A-NN1172VP1M。r B87A-NN1172VP1C在CEF上的平均滴度最低。结论:广西IBDV流行株主要通过基因突变、基因重排的方式进化。广西IBDV流行株优势基因型为vv-A/Uniq-B基因型。IBDV种群动态经历了平缓-快速增长-平缓增长-极速下降-平缓的过程。泛素介导的IBDV核酸疫苗可以有效抵抗IBDV的攻击。泛素介导的IBDV-IBV二联多基因核酸疫苗可以同时抵抗IBDV和IBV的攻击。vv IBDV基因组B节段VP1基因能够增强病毒复制能力。
张园[5]（2019）在《锚定IBDV-VP2蛋白重组乳酸菌构建及其免疫效果评价》文中指出其安全性世界公认的（GRAS）,由于乳酸菌自身的调节免疫功能和辅助其他疫苗等特点,世界上许多研究学者开始以乳酸菌做为活载体从而表达外源蛋白,研制口服和注射疫苗。目的:构建重组乳酸菌IBDV-VP2活载体疫苗,为乳酸菌活载体疫苗的研发完善技术平台和研究其免疫机制。方法:（1）r-L.Lactis-USP45-VP2-RCK-AcmA2的构建及免疫效果的评价:本研究利用NZ3900作为活载体,以IBDV超强毒株的VP2基因为目的基因,与沙门氏菌侵袭蛋白RCK基因和锚定蛋白AcmA相连接,利用同源重组技术将VP2-RCK基因和AcmA2基因插入到食品级载体pNZ8149中,通过电转转入NZ3900菌株,得到重组菌株为r-L.Lactis-USP45-VP2-RCK-AcmA2。利用体外检测和动物实验对其免疫效果进行评价。动物实验共设计2个实验组（口服免疫组、注射免疫组）和2个对照组（空白组、空菌株组）,实验组的免疫剂量1×109 CFU/羽,免疫是在鸡群7日龄和14日龄时进行的,均在28日龄攻毒（1000ELD50/羽）。（2）优化OmpH主动递呈重组乳酸菌活载体平台:以肠道中的M细胞作为递呈抗原乳酸菌的靶细胞（M细胞是肠道中递呈和摄取抗原的细胞）,目的是增强抗原蛋白被机体摄取和递呈的概率。本研究首次构建了乳酸菌表达载体质粒pNZ8149-VP2-2OmpH、pNZ8149-OmpH-VP2-OmpH、pNZ8149-2OmpH-VP2-2OmpH,以实现VP2与OmpH蛋白的融合表达,并采用乳酸乳球菌NZ3900菌株与配套的NICE的表达系统,通过体外检测融合蛋白的表达量,并分析蛋白的稳定性和利用正交实验法对其诱导条件进行优化。（3）高水平母源抗体下重组乳酸菌r-L.Lactis-VP2-RCK的免疫效果:本研究利用ELISA方法检测商品蛋鸡母源抗体,选取在母源抗体的最高峰时期,通过动物实验对重组乳酸菌r-L.LactisVP2-RCK和B87（法匹克）在带有母源抗体的鸡群进行免疫效果对比评价,研究其重组乳酸菌r-L.Lactis-VP2-RCK诱导机体免疫机制。结果:（1）通过nisin进行诱导表达,经WB验证蛋白VP2-RCK-AcmA2在重组乳酸菌中正确表达,具有较高的稳定性,并对其表达定位进一步验证。通过流式细胞仪分析,结果表明有将近20%的重组乳酸菌能够将VP2–RCK蛋白展示在细胞壁上。通过WB实验和蛋白定量试剂盒,对所表达的目的蛋白进行定量分析,检测到融合蛋白的表达量达到12.4μg/mL。动物实验结果:注射和口服组的血清中和抗体为阴性;与对照组对比,发现口服组口咽部位黏膜s Ig A抗体滴度没有显着性差异;口服和注射组鸡群全部死亡,攻毒保护率为0。（2）经Western Blot检测发现r-L.Lactis-VP2-2OmpH、r-L.Lactis-OmpH-VP2-OmpH和r-L.Lactis-2OmpH-VP2-2OmpH实现蛋白表达。通过蛋白稳定性实验证明三株重组乳酸菌表达的外源蛋白都可以在4℃条件下稳定表达一周以上。通过BCA总蛋白试剂盒和薄层凝胶扫描实验,对所表达蛋白定量分析,融合蛋白的表达量分别为98.846μg/m L、411.8084ug/m L和93.2552ug/m L。这三株重组乳酸菌中r-L.Lactis-OmpH-VP2-OmpH表达量最高。（3）本研究首次研究重组乳酸菌r-L.Lactis-VP2-RCK免疫具有高水平的母源抗体的商品雏鸡,通过与活疫苗B87进行比较,发现r-L.Lactis-VP2-RCK活载体疫苗抗原递呈方式及免疫应答不受母源抗体干扰的机制。通过对血清中和抗体实验分析,重组乳酸菌r-L.Lactis-VP2-RCK比B87要更快产生中和抗体,并且血液中的成熟的B细胞数量没有减少,法氏囊不受损伤,发育正常。结论:进一步完善乳酸球菌表达系统平台,同时完成将IBDV-VP2蛋白和沙门氏菌RCK蛋白锚定在重组乳酸菌细胞壁上的构建。本研究揭示r-L.Lactis-VP2-RCK重组乳酸菌活载体疫苗抗原递呈方式及免疫应答不受母源抗体干扰的机制,还揭示重组乳酸菌疫苗诱导机体免疫机制的不同于常规疫苗免疫应答。
杨宵玥,陈玲,宋亚芬,蒋桃珍[6]（2018）在《鸡传染性法氏囊病新型疫苗的研究进展》文中研究指明鸡传染性法氏囊病（IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的雏鸡的一种高度接触性传染病,自1962年报道以来,世界上主要养禽国家和地区均有流行,给养禽业带来严重经济损失。目前,IBD防控的主要方法是采用疫苗接种,使易感雏鸡获得主动或被动免疫保护,因此疫苗的质量对临床上IBD的防控起着至关重要的作用。虽然各国均有较好的商品化疫苗,但随着IBDV毒株的不断变异,商品化疫苗的抗原性与流行毒株不能完全匹配,临床上免疫失败时有发生,因此迫切需要研发与临床流行毒株相匹配的新型疫苗用于IBD的防控。对近期IBD的基因缺失苗、亚单位疫苗、DNA疫苗以及活载体疫苗等新型疫苗的研究进展进行概述,以此为IBD新型疫苗的研究提供参考。
星东[7]（2017）在《ND-IBD二联灭活苗对商品蛋雏鸡免疫效果及机制研究》文中研究表明传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）与新城疫（Newcastle disease,ND）的防控仍然是国内家禽养殖业面临的两大难题。IBD和ND疫苗在蛋鸡的应用已经取得一定的成效,但是在生产中其免疫效果仍达不到预期效果,而且经常由于苗毒毒力过强造成免疫器官损伤。而ND-IBD二联灭活苗经生产工艺改进,提高了抗原含量,且可以减少免疫次数,能够有效的避免活苗的缺陷。ND-IBD二联灭活苗在商品蛋雏鸡的免疫效果及机体对该疫苗的免疫反应仍然有待进一步的研究。因此,本试验比较了 ND-IBD二联灭活疫苗对1、7日龄商品蛋鸡的免疫效果,并比较了 ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活苗对7日龄商品蛋鸡的免疫效果,同时结合实时荧光定量PCR分析了 ND-IBD二联灭活疫苗免疫后免疫因子mRNA表达量的变化情况。研究结果为ND-IBD二联灭活疫苗在蛋鸡生产上的应用提供了重要依据。具体内容如下:方法:1、ND-IBD二联灭活苗对1、7日龄商品蛋雏鸡免疫效果研究。选取体重、日龄相近的健康的1日龄商品蛋雏鸡360只,随机分成A、B和C三个处理组。A组为空白对照组,接种生理盐水;B组为1日龄疫苗免疫组,雏鸡1日龄时颈部皮下注射0.3mlND-IBD二联灭活疫苗;C组为7日龄疫苗免疫组,于雏鸡7日龄时颈部皮下注射0.3mlND-IBD二联灭活疫苗。试验期56d,免疫后每7d采血分离血清,采用血凝抑制试验检测ND抗体水平;并采用中和试验检测IBD抗体水平;同时采集法氏囊和脾脏,采用TRIzol法提取总RNA,反转录出cDNA,用实时荧光定量PCR检测CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量。然后每7d对各组鸡进行IBDV攻毒保护试验,攻毒剂量0.2ml/羽,并于攻毒后72h剖检,观察法氏囊病变情况,并计算攻毒保护率。2、ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活苗对商品蛋鸡免疫效果比较研究。选取体重、日龄相近的健康的1日龄商品蛋雏鸡240只分成3个处理组。A组为空白对照组,接种生理盐水;B组为IBD活苗免疫组,雏鸡7日龄时颈部皮下注射0.3mlIBD活疫苗;C组为ND-IBD二联灭活疫苗免疫组,于雏鸡7日龄时颈部皮下注射0.3mlND-IBD二联灭活疫苗。试验期42d,免疫后每7d采血分离血清,采用中和试验检测IBD抗体水平;同时采集法氏囊和脾脏,采用TRIzol法提取总RNA,反转录出cDNA用实时荧光定量PCR法检测CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量。然后每7d对各组鸡进行IBDV攻毒保护试验,攻毒剂量0.2ml/羽。攻毒后72h剖检,观察法氏囊病变情况,并计算攻毒保护率。结果:1、ND-IBD二联灭活苗对1、7日龄商品蛋雏鸡免疫效果研究。抗体检测结果表明:在28～56日龄,C组的IBD和ND抗体水平显着高于A组与B组（P<0.05）;35日龄前,C组攻毒保护率显着优于A组,且相差10%。实时荧光定量PCR法检测结果表明:在法氏囊与脾脏中,28～56日龄时,C组基因CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量,相比A组与B组显着升高（P<0.05）。2、ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活苗对7日龄商品蛋鸡的免疫效果比较研究。抗体检测结果表明:28～42日龄,C组IBD体水平显着高于B组与A组（P<0.05）;35日龄前,C组攻毒保护效果高于B组与A组。实时荧光定量PCR结果表明:21～42日龄时,法氏囊与脾脏中基因CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量,C组显着高于B组与A组（P<0.05）。结论:1.ND-IBD二联灭活苗免疫7日龄商品蛋雏鸡可显着提高IBD与ND抗体水平和免疫器官中细胞因子的mRNA表达量,增强机体免疫功能。2.ND-IBD二联灭活苗免疫7日龄商品蛋雏鸡,免疫效果优于IBD弱毒苗。
赖隆永[8]（2017）在《ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究》文中指出传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD）是由双股核糖核酸病毒科的传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）引起的以感染雏鸡为主的免疫抑制性、高度接触性传染病;新城疫（Newcastle Disease,ND）是由副黏病毒科鸡新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起鸡的急性、高度接触性和致死性传染病,不同年龄、品种以及性别的鸡均能感染ND,但是幼雏的发病率和死亡率明显更高。研究发现国内对ND-IBD二联灭活苗的研发及其对种母鸡免疫效果研究较少,因此,针对这种情况,对ND-IBD二联灭活苗对种母鸡免疫效果研究仍需要进一步研究;同时在生产临床实践中或者科研试验研究中,血清学方法监测雏鸡抗体水平在一定程度上,都会引起雏鸡应激,影响其生长性能和经济效益。通过从鸡蛋中提取ND和IBD卵黄抗体间接预估ND和IBD血清抗体,获取样品方便,减少雏鸡的反复应激,考虑到ND和IBD卵黄抗体与子代雏鸡ND和IBD血清抗体的关系尚不明确,因此通过测定ND和IBD卵黄抗体与ND和IBD血清抗体,进行ND和IBD卵黄抗体与子代ND和IBD血清抗体的相关性分析;另外,研究表明在临床实践中,机体内存在IBDV野毒和苗毒的感染,引起法氏囊病变和免疫失败,因此建立一种高效简便的IBDV野毒与疫苗毒的鉴别诊断方法具有重要意义。本研究拟对100日龄种母鸡进行皮下注射ND-IBD二联灭活苗,对其ND和IBD抗体水平进行检测,观察种母鸡及其子代的免疫效果,此外,对提取的种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平与子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平进行相关性分析,最后建立一种高效简便的IBDV野毒与疫苗毒的鉴别诊断方法。本试验的研究内容及结果如下:1.ND-IBD二联灭活苗对100日龄种母鸡的免疫效果研究。本试验通过对100日龄种母鸡进行皮下注射ND-IBD二联灭活苗,分别于免疫前、免疫后每隔15 d采血分离血清,利用血清学方法检测其ND和IBD抗体水平,并对其抗体水平进行分析,结果表明种母鸡接种ND-IBD二联灭活苗之后产生了较高的ND和IBD抗体水平,种母鸡得到了很好的免疫保护,并且其免疫保护力能够持续120d。可见,种母鸡免疫ND-IBD二联灭活苗,不仅可以有效地提高种母鸡的抗体水平,也可以提高子代的母源抗体水平。2.ND和IBD卵黄抗体与子代ND和IBD血清抗体的相关性分析。本试验通过检测种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平及其子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平,结合SPSS 18.0软件的分析,得到免疫组种蛋ND卵黄抗体与子代ND血清抗体水平关系的最优方程为y=0.923+0.701x;免疫组种蛋IBD卵黄抗体与子代IBD血清抗体水平关系的最优方程为y=2.365+0.7x。3.IBDV强弱毒株鉴别诊断方法的建立。根据NCBI中不同毒株的VP2共保守区段序列比对分析设计两对引物（片段长度为856bp和1356bp）和选择限制性内切酶BamHI和PstI进行RT-PCR扩增,并选择片段长度为856 bp的PCR产物,胶回收其目的基因进行限制性内切酶酶切,最后验证其特异性、敏感性和重复性,建立了IBDV强弱毒株鉴别诊断的RT-PCR-RFLP方法。综上,种母鸡免疫接种ND-IBD二联灭活苗后种母鸡及其子代获得较高抗体水平;此外,分析免疫组种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平与子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平的相关性,获得了它们之间的最优方程;最后建立了一种高效简便的IBDV野毒与苗毒的鉴别诊断RT-PCR-RFLP方法,为临床和生产实践制定科学的免疫程序提供科学依据和提供高效便利的监测手段;同时,为IBD的流行病学和诊断治疗研究提供了一种新的手段。
蒋大伟[9]（2016）在《鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的可溶性表达及其免疫特性的研究》文中认为鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease virus,IBDV）引起的一种严重危害雏鸡免疫器官,致使雏鸡免疫失败,造成B淋巴细胞严重受损的高发性、高接触性的病毒性传染病。其主要特征是IBDV侵袭雏鸡的中枢免疫器官法氏囊,并在法氏囊B淋巴细胞中大量增殖,对该细胞造成严重杀伤,从而导致严重的免疫抑制,使机体免疫力下降,使疫苗免疫失效,给养禽业的疫病防控带来很大的困难。该病于上世纪八十年代开始在我国广泛流行,给我国的养禽业带来了巨大的经济损失。因此该病的防治防控对养殖业具有重要的价值和意义。VP2位于IBDV基因组中的A节段,是主要免疫保护性抗原,在其高变区含有主要的中和性抗原表位,因此被作为研发预防IBD亚单位疫苗的主要蛋白。目前,科研人员通过不同的表达系统表达VP2蛋白,其中以真核表达系统为主,该系统有很多优势,如表达水平较高,表达产物有翻译后加工修饰,表达产物纯度高利于后期纯化等,但由于真核表达成本高,操作也更繁琐,因此该系统并不利于大量表达VP2蛋白。尽管原核表达系统大肠杆菌表达IBDV VP2蛋白可溶性表达量较低,其主要表达产物是无活性的包涵体,且背景蛋白较多限制了其后期的纯化。但大肠杆菌表达系统的最大优势在于成本低,操作简单,为亚单位疫苗产业化提供了可能。因此,本研究主要利用大肠杆菌表达VP2蛋白,分别构建9种含有不同可溶性标签的表达载体,探讨不同可溶性标签对VP2蛋白的可溶性表达及纯化的影响。此外,本研究从技术方法上优化VP2的可溶性表达条件,明显提高了VP2蛋白的可溶性表达,利用亲和层析、分子筛和蔗糖梯度离心纯化VP2蛋白,并用电镜观察VP2蛋白形成的病毒样颗粒（VLPs）。最后,将表达的VP2蛋白及纯化形成的VLPs制备成亚单位疫苗进行免疫保护试验,结果显示制备的亚单位疫苗具有良好的免疫原性,其免疫保护作用明显高于目前的IBDV商业化疫苗。本研究为研发新型IBDV基因工程亚单位疫苗奠定了坚实基础,提供了高效的亚单位候选疫苗。1、为了解决VP2在原核大肠杆菌中可溶性表达量较低且难以纯化的技术问题,本试验将9种不同可溶性标签插入原核表达载体p ET21b,构建9种可溶性表达载体,并与VP2连接后转化至大肠杆菌进行融合表达,其中Grifin,MBP,SUMO,Thioredoxin,γ-crystallin,Ars C和Ppi B这7种标签可有效改善与VP2的可溶性表达。将这7种融合蛋白进一步通过亲和层析的方法纯化,结果显示,融合蛋白γ-crystallin-VP2的回收率最高,融合蛋白MBP-VP2的纯度最高,可达到90%以上的纯度。为了验证融合VP2蛋白和切除标签后的VP2蛋白是否存在活性,利用琼扩试验（AGP）检测这7种纯化后的融合蛋白。融合VP2蛋白和被切除标签的VP2蛋白都均能与IBDV的阳性血清抗体结合发生沉淀反应,表明含有标签的融合蛋白及被切除标签的VP2蛋白均具有活性。此外,电镜观察结果显示,融合蛋白MBP-VP2切除MBP标签后的VP2蛋白可观察到大小为25～50nm的颗粒,暗示切除标签后的VP2蛋白仍具有形成病毒样颗粒（VLPs）的能力。2、为了研究相关方法对VP2蛋白表达的影响,构建了重组表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）p Lys S（p ET28a-VP2）,通过优化表达条件,使VP2的可溶性表达有了明显提高,经琼脂扩散试验检测表达VP2含量,琼扩效价可达到1:64。利用亲和层析方法、亲和层析结合分子筛纯化及亲和层析结合蔗糖梯度离心纯化,三种方法均能对VP2起到较好的纯化作用,其中镍柱纯化产物的纯度可达90%。经电镜观察,大肠杆菌表达的VP2蛋白经纯化后可组装成与天然IBDV构象类似的VLPs。亲和层析纯化后形成的VLPs含量高于亲和层析方法结合蔗糖梯度离心纯化后形成的VLPs含量。动态光散射分析,自组装成的VLPs均一度很高,直径为25nm的颗粒。本试验明显改善了VP2可溶性表达量,初步摸索了VP2形成VLPs的条件,为进一步制备基因工程亚单位疫苗奠定了基础。3、为了对上述VP2蛋白及其形成的VLPs进行免疫原性研究,用中等毒力B87株和超强毒力0504株分别制备纯化和未纯化免疫原各6种,按一定比例加油佐剂,共制备了12种不同抗原含量的基因工程亚单位疫苗。按生物制品标准进行理化检验和无菌检验,结果均符合要求。安全试验表明所制疫苗安全性好、无不良反应。用检验合格的疫苗分别免疫SPF鸡群,并设立对照,定期采血测定各组的免疫抗体滴度并进行比较。结果显示各组呈现不同的免疫抗体水平,自制的亚单位疫苗具有良好的免疫原性,可有效提高鸡群的体液免疫水平。免疫攻毒保护试验结果显示,各组均呈现了不同程度的免疫保护作用,自制疫苗可产生良好的免疫保护作用,尤其是B87株和0504株纯化组高含量VLPs和B87株未纯化组的中琼扩效价VP2亚单位疫苗其免疫保护率均可达90%,0504株未纯化组的低琼扩效价VP2亚单位疫苗其免疫保护率高达100%,因此,确定这4种IBDV亚单位油乳剂为候选疫苗。总之,筛选的4种候选疫苗其抗体水平和免疫保护率均显着高于目前商业化基因工程亚单位疫苗和中等毒力活疫苗,且抗体水平略高于商业化的全病毒灭活苗。本研究确定的候选疫苗具有良好的免疫保护作用、安全可靠,能有效地预防鸡传染性法氏囊病的发生,对养禽业的发展具有重要的意义和价值,同时也为制备最佳性价比的亚单位疫苗奠定了坚实的基础。关于候选疫苗的免疫期、保存期及其相关免疫程序的制定等问题,有待今后进一步深入研究。
陆有飞,韦平,阳秀英,黄志永,胡凤梅[10]（2008）在《鸡传染性法氏囊病疫苗及其应用的进展》文中指出传染性法氏囊病（IBD）仍然是世界养禽业影响最大的传染病之一。疫苗接种是目前控制IBD最有效的措施。本文主要从病原特征,目前流行病学的新特点,传统疫苗、新型疫苗的种类、特点,影响疫苗免疫效果的主要因素,目前应用中存在的问题及其未来解决的思路等进行了阐述。认为传统疫苗在世界许多国家IBD的防控中发挥了重要作用,发展新型疫苗的研究也已经兴起,但是新型疫苗在相当长的一段时间内还是无法取代传统疫苗。提出安全和有效防控是IBD疫苗研制与应用的根本出发点。
二、鸡传染性法氏囊病新型疫苗的研制策略（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡传染性法氏囊病新型疫苗的研制策略（论文提纲范文）
（1）传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 传染性法氏囊病文献综述 |
| 1 传染性法氏囊病病毒病原学 |
| 1.1 病毒形态 |
| 1.2 基因组结构 |
| 2 传染性法氏囊病流行病学 |
| 2.1 易感动物 |
| 2.2 流行特点 |
| 2.3 临床症状 |
| 2.4 IBDV分子流行病学 |
| 3 传染性法氏囊病的诊断 |
| 3.1 临床诊断 |
| 3.2 实验室诊断 |
| 4 传染性法氏囊病的防控 |
| 5 传染性法氏囊病疫苗研究进展 |
| 5.1 传统疫苗 |
| 5.2 新型基因工程疫苗 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 病料信息 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 病毒RNA的提取 |
| 2.2 RT-PCR检测病毒 |
| 2.3 NT2020-8株VP2基因及VP1部分基因片段扩增及载体连接 |
| 2.4 NP2104株全基因测序 |
| 2.5 遗传进化树分析 |
| 2.6 氨基酸变异分析 |
| 2.7 同源性分析 |
| 2.8 病毒在鸡胚上培养 |
| 2.9 动物回归实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病料RT-PCR检测结果 |
| 3.2 NT2020-8株VP2及VP1部分基因扩增结果 |
| 3.3 NT2020-8株VP2及VP1基因遗传进化树分析结果 |
| 3.4 NT2020-8株VP2及VP1部分基因编码氨基酸变异分析结果 |
| 3.5 NT2020-8株同源性分析结果 |
| 3.7 NP2104株全基因扩增结果 |
| 3.8 NP2104株遗传进化分析结果 |
| 3.9 NP2104株氨基酸序列分析结果 |
| 3.10 NP2104株同源性分析结果 |
| 3.11 鸡胚培养结果 |
| 3.12 NP2104株动物回归实验结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 第三章 不同表达系统表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要化学试剂 |
| 1.2 主要试剂配制 |
| 1.3 主要生物材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 IBDV超强毒株JS株总RNA的提取 |
| 2.2 原核表达VP2基因的扩增 |
| 2.3 VP2基因与原核表达载体连接 |
| 2.4 原核表达重组质粒的小量诱导表达及鉴定 |
| 2.5 重组转移载体pFast-Bac-1-GP67-VP2的构建 |
| 2.6 杆状病毒转移载体转座DH10 Bac感受态细胞 |
| 2.7 重组杆状病毒质粒的提取 |
| 2.8 重组杆状病毒质粒鉴定 |
| 2.9 重组杆状病毒质粒转染sf9细胞 |
| 2.10 收获P1代重组杆状病毒及鉴定 |
| 2.11 重组杆状病毒表达鉴定 |
| 2.12 重组杆状病毒表达条件优化 |
| 2.13 重组杆状病毒大量表达及收获蛋白 |
| 3 结果 |
| 3.1 原核表达载体pET-28a-VP2酶切鉴定 |
| 3.2 原核表达重组蛋白SDS-PAGE分析及最佳表达菌株的筛选 |
| 3.3 原核表达重组蛋白Western Blot分析 |
| 3.4 原核表达诱导表达条件优化 |
| 3.5 大量诱导表达及包涵体提取效果 |
| 3.6 杆状病毒转移载体pFast-Bac-1-GP67-VP2的酶切鉴定 |
| 3.7 重组杆状病毒质粒的鉴定 |
| 3.8 P1代重组杆状病毒的收获及鉴定 |
| 3.9 重组杆状病毒表达鉴定 |
| 3.10 测定重组杆状病毒TCID50 |
| 3.11 重组杆状病毒表达条件优化 |
| 3.12 重组杆状病毒优化表达条件后蛋白表达结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 第四章 两种VP2重组蛋白免疫原性比较 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 毒株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要生物材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫原制备 |
| 2.2 SPF鸡免疫方案 |
| 2.3 IFA抗体检测 |
| 2.4 中和抗体检测 |
| 2.5 琼扩抗体检测 |
| 2.6 攻毒保护试验 |
| 2.7 法氏囊组织病理学评价 |
| 2.8 荧光定量PCR方法检测法氏囊病毒载量及泄殖腔排毒量 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清IFA抗体效价 |
| 3.2 血清中和抗体效价 |
| 3.3 血清琼扩抗体效价 |
| 3.4 攻毒保护试验结果 |
| 3.5 法氏囊组织病理学评价结果 |
| 3.6 法氏囊病毒载量及肛拭子排毒量结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒重组蛋白的免疫保护效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡新城疫及其疫苗研究进展 |
| 1.1.1 新城疫概述 |
| 1.1.2 新城疫在我国的流行现状 |
| 1.1.3 新城疫疫苗研究进展 |
| 1.1.3.1 传统疫苗 |
| 1.1.3.2 载体疫苗 |
| 1.1.3.3 利用Toll样受体配体作为佐剂的疫苗 |
| 1.1.3.4 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.1.4 新城疫防控措施 |
| 1.2 禽流感及其疫苗研究进展 |
| 1.2.1 禽流感概述 |
| 1.2.2 H9 亚型禽流感在我国流行现状 |
| 1.2.3 H9 亚型禽流感疫苗研究进展 |
| 1.2.4 禽流感防控措施 |
| 1.3 鸡传染性法氏囊病及其疫苗研究进展 |
| 1.3.1 鸡传染性法氏囊病概述 |
| 1.3.2 传染性法氏囊病流行现状 |
| 1.3.3 传染性法氏囊病毒蛋白结构和功能相关研究 |
| 1.3.4 鸡传染性法氏囊病疫苗研究进展 |
| 1.3.5 鸡传染性法氏囊病防控措施 |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第二章 传染性法氏囊VP2 蛋白的制备及检验 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 毒株 |
| 2.1.2 主要试剂及配制 |
| 2.1.2.1 主要试剂 |
| 2.1.2.2 主要溶液的配制 |
| 2.1.2.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 传染性法氏囊VP2 蛋白的制备 |
| 2.2.2 传染性法氏囊VP2 蛋白的纯化 |
| 2.2.3 VP2 蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.2.4 重组蛋白的Western Blot分析 |
| 2.2.5 传染性法氏囊VP2 蛋白的滴度测定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 VP2 片段的PCR扩增结果 |
| 2.3.2 VP2 片段PCR扩增产物回收结果 |
| 2.3.3 克隆质粒的菌液PCR鉴定结果 |
| 2.3.4 VP2 蛋白的SDS-PAGE分析结果 |
| 2.3.5 VP2 蛋白的Western Blot鉴定结果 |
| 2.3.6 VP2 蛋白滴度测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 免疫保护效果研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 新城疫及禽流感重组蛋白的滴度测定 |
| 3.2.2 抗原液的制备及检验 |
| 3.2.2.1 单抗原液的制备 |
| 3.2.2.2 三联抗原液的制备 |
| 3.2.2.3 抗原液的检验 |
| 3.2.3 单个抗原的免疫保护效果研究 |
| 3.2.3.1 新城疫及禽流感的抗体检测 |
| 3.2.3.2 传染性法氏囊的抗体检测 |
| 3.2.4 三联抗原液的免疫保护效果研究 |
| 3.2.4.1 新城疫及禽流感的抗体检测 |
| 3.2.4.3 传染性法氏囊抗体检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 新城疫、禽流感重组蛋白血凝效价测定结果 |
| 3.3.2 单个抗原的免疫保护效果研究结果 |
| 3.3.2.1 新城疫及禽流感的抗体检测结果 |
| 3.3.2.2 新城疫的攻毒试验结果 |
| 3.3.2.3 传染性法氏囊的抗体检测与攻毒试验结果 |
| 3.3.3 多抗原液的免疫保护效果研究结果 |
| 3.3.3.1 新城疫及禽流感的抗体检测结果 |
| 3.3.3.2 新城疫的攻毒试验结果 |
| 3.3.3.3 传染性法氏囊的抗体检测与攻毒试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株的鉴定及疫苗株构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 传染性法氏囊病病毒 |
| 1.1.1 IBDV病原学 |
| 1.1.2 IBDV基因组结构 |
| 1.1.3 IBDV基因组编码的蛋白 |
| 1.1.3.1 VP1蛋白 |
| 1.1.3.2 VP2蛋白 |
| 1.1.3.3 VP3蛋白 |
| 1.1.3.4 VP4蛋白 |
| 1.1.3.5 VP5蛋白 |
| 1.2 IBDV的遗传变异 |
| 1.2.1 IBDV经典株 |
| 1.2.2 IBDV变异株 |
| 1.2.3 IBDV超强毒 |
| 1.3 IBD疫苗和防控 |
| 1.3.1 IBD疫苗 |
| 1.3.1.1 传统活疫苗和灭活疫苗 |
| 1.3.1.2 亚单位疫苗 |
| 1.3.1.3 活载体疫苗 |
| 1.3.1.4 免疫复合物疫苗 |
| 1.3.1.5 DNA疫苗 |
| 1.3.2 IBD防控 |
| 1.4 非典型IBD新疫情 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 非典型IBD病原的鉴定及致病性研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 临床病料及处理 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 SPF鸡胚及试验动物 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.1.5 样品检测及IBDV VP2 基因代表区段的扩增 |
| 2.1.5.1 样品RNA的提取 |
| 2.1.5.2 样品cDNA的合成 |
| 2.1.5.3 PCR |
| 2.1.6 IBDV VP1 代表区段的扩增 |
| 2.1.7 IBDV遗传演化分析 |
| 2.1.8 IBDV新型变异株代表毒株(SHG19)的分离鉴定 |
| 2.1.8.1 IBDV VP2 基因检测 |
| 2.1.8.2 外源病毒检测 |
| 2.1.8.3 病毒效价检测 |
| 2.1.9 IBDV新型变异株的致病性研究 |
| 2.1.10 IBDV新型变异株的免疫抑制研究 |
| 2.1.10.1 对蛋鸡的免疫抑制研究 |
| 2.1.10.2 对商品肉鸡的免疫抑制研究 |
| 2.1.11 数据统计分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 IBDV的检测及基因扩增结果 |
| 2.2.2 IBDV的遗传演化分析结果 |
| 2.2.3 IBDV新型变异株代表毒株SHG19 的分离鉴定结果 |
| 2.2.4 IBDV新型变异株的致病性研究结果 |
| 2.2.5 IBDV新型变异株对蛋鸡的免疫抑制研究结果 |
| 2.2.6 IBDV新型变异株对商品肉鸡的免疫抑制研究结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 非典型传染性法氏囊病的病原是IBDV新型变异株 |
| 2.3.2 IBDV新型变异株严重损坏鸡的中枢免疫器官 |
| 2.3.3 IBDV新型变异株导致严重免疫抑制 |
| 第三章 IBDV新型变异株的抗原变异研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 质粒、毒株、细胞、单抗和疫苗 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 引物的设计与合成 |
| 3.1.5 IBDV超强毒疫苗对IBDV新型变异株的免疫保护试验 |
| 3.1.6 IBDV新型变异株与超强毒的血清交叉中和试验 |
| 3.1.6.1 IBDV的 TCID50测定 |
| 3.1.6.2 血清交叉中和试验 |
| 3.1.7 IBDV新型变异株与超强毒的单抗反应谱检测 |
| 3.1.8 SHG19株的全基因组克隆及分析 |
| 3.1.8.1 SHG19株的全基因组克隆 |
| 3.1.8.2 全基因组序列分析 |
| 3.1.9 VP2抗原表位鉴定 |
| 3.1.10 SHG19抗原变异相关位点的鉴定 |
| 3.1.10.1 VP2及其突变体重组真核表达质粒的构建 |
| 3.1.10.2 VP2及其突变体的真核表达 |
| 3.1.10.3 单抗识别VP2及其突变体的检测 |
| 3.1.11 SHG19突变体病毒的拯救及鉴定 |
| 3.1.11.1 SHG19及其突变体感染性克隆的构建 |
| 3.1.11.2 SHG19及其突变体病毒的拯救 |
| 3.1.12 SHG19突变体病毒的单抗反应谱检测 |
| 3.1.13 单抗2-5C-6F对SHG19突变体病毒的中和活性检测 |
| 3.1.14 数据统计分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 IBDV超强毒疫苗对IBDV新型变异株的免疫保护评价结果 |
| 3.2.2 IBDV新型变异株与超强毒的血清交叉中和试验结果 |
| 3.2.3 IBDV新型变异株与超强毒的单抗反应谱检测结果 |
| 3.2.4 SHG19的全基因组克隆及分析结果 |
| 3.2.5 VP2单抗的抗原表位鉴定结果 |
| 3.2.5.1 单抗7D4识别的抗原表位 |
| 3.2.5.2 单抗2-5C-6F识别的抗原表位 |
| 3.2.6 SHG19抗原变异相关位点的鉴定结果 |
| 3.2.7 SHG19突变体病毒的拯救及鉴定结果 |
| 3.2.8 SHG19突变体病毒的单抗反应谱检测结果 |
| 3.2.9 单抗2-5C-6F对SHG19突变体病毒的中和活性检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 IBDV超强毒疫苗对IBDV新型变异株保护效果不理想 |
| 3.3.2 IBDV新型变异株与超强毒株抗原性差异明显 |
| 3.3.3 IBDV新型变异株抗原变异关键氨基酸的鉴定 |
| 第四章 IBDV新型变异株的反向遗传疫苗候选株的构建 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 质粒、病毒和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 引物的设计与合成 |
| 4.1.5 IBDV新型变异株反向遗传疫苗侯选株感染性克隆的构建 |
| 4.1.6 IBDV新型变异株反向遗传疫苗侯选株的拯救与鉴定 |
| 4.1.7 IBDV新型变异株攻毒模型的建立 |
| 4.1.7.1 半数感染量(BID50)的测定 |
| 4.1.7.2 SHG19株IBDV的最小攻毒剂量的确定 |
| 4.1.8 IBDV新型变异株反向遗传疫苗侯选株的安全性和有效性评价 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 IBDV新型变异株反向遗传疫苗侯选株的拯救与鉴定 |
| 4.2.2 IBDV新型变异株的攻毒模型 |
| 4.2.3 IBDV新型变异株反向遗传疫苗侯选株的安全性评价结果 |
| 4.2.4 IBDV新型变异株反向遗传疫苗侯选株的有效性评价结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 IBDV新型变异株的攻毒模型 |
| 4.3.2 IBDV新型变异株反向遗传疫苗 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述:传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗研究进展 |
| 1.1 传染性法氏囊病病毒概述 |
| 1.1.1 传染性法氏囊病病毒病原学 |
| 1.1.2 传染性法氏囊病病毒基因组结构及编码蛋白 |
| 1.2 传染性法氏囊病病毒分子流行病学研究进展 |
| 1.2.1 传染性法氏囊病流行病学 |
| 1.2.2 传染性法氏囊病病毒分子流行病学 |
| 1.2.3 分子进化与系统发育重建 |
| 1.3 传染性法氏囊病病毒新型疫苗研究进展 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 基因工程亚单位疫苗 |
| 1.3.3 免疫复合物疫苗 |
| 1.3.4 基因工程活载体疫苗 |
| 1.3.5 核酸疫苗 |
| 1.3.6 反向遗传重组疫苗 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 2012-2015年广西传染性法氏囊病病毒分子流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 鸡胚 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 临床样品的采集与处理 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取及RT-PCR鉴定 |
| 2.2.3 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.4 vVP2与VP1b基因扩增及序列测定 |
| 2.2.5 vVP2与VP1b基因序列分析 |
| 2.2.6 vVP2与VP1b基因重组分析 |
| 2.2.7 vVP2与VP1b基因选择压力分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离与鉴定 |
| 2.3.2 基因序列分析 |
| 2.3.3 系统进化树分析 |
| 2.3.4 vVP2与VP1b基因重组分析 |
| 2.3.5 vVP2、VP1b基因选择压力分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 中国传染性法氏囊病病毒株时空进化分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株序列信息来源 |
| 3.1.2 数据处理软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集的构建 |
| 3.2.2 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集最佳核苷酸替代模型分析 |
| 3.2.3 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集系统进化和种群动态分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集重组分析及饱和度检测 |
| 3.3.2 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集最佳核苷酸替代模型检测 |
| 3.3.3 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集碱基替换速率分析 |
| 3.3.4 传染性法氏囊病病毒系统进化分析 |
| 3.3.5 中国传染性法氏囊病病毒种群动态分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 泛素介导的传染性法氏囊病病毒及传染性法氏囊病病毒-鸡传染性支气管炎病毒二联核酸疫苗的研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株、疫苗与单克隆抗体 |
| 4.1.2 鸡胚及试验动物 |
| 4.1.3 细胞、菌株、载体及质粒 |
| 4.1.4 主要分子生物学试剂 |
| 4.1.5 主要生化试剂及标准阳性血清 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 Ub、Ub-N-S1、VP2和VP1 基因的扩增 |
| 4.2.3 Ub-linker-VP2 基因的扩增 |
| 4.2.4 pVAX1-VP2, pVAX1-Ub-linker-VP2, pVAX1-Ub-linker-VP2-VP1和pVAX1-Ub-linker-N-S1-VP2重组质粒的构建 |
| 4.2.5 重组质粒体外转染及其表达产物的检测 |
| 4.2.6 重组质粒免疫应答效果的检测 |
| 4.2.7 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Ub、Ub-N-S1、VP2和VP1 基因扩增结果 |
| 4.3.2 Ub-linker-VP2 基因扩增结果 |
| 4.3.3 重组质粒的构建与鉴定 |
| 4.3.4 重组质粒体外瞬时转染VP2基因的表达 |
| 4.3.5 重组质粒体外瞬时转染N-S1基因的表达 |
| 4.3.6 动物免疫保护试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 传染性法氏囊病病毒B87疫苗株反向遗传学改造及拯救 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 质粒、病毒、鸡胚和细胞 |
| 5.1.2 载体和菌株 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 B87疫苗株全基因组扩增 |
| 5.2.2 B87疫苗株全基因组真核表达质粒的构建 |
| 5.2.3 引入分子标签 |
| 5.2.4 B87疫苗株基因组B节段改造 |
| 5.2.5 病毒拯救 |
| 5.2.6 鸡胚感染 |
| 5.2.7 拯救病毒RT-PCR及测序鉴定 |
| 5.2.8 拯救病毒IFA鉴定 |
| 5.2.9 拯救病毒复制动力学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 B87疫苗株全基因组克隆 |
| 5.3.2 B87疫苗株全基因组感染性克隆 |
| 5.3.3 B87疫苗株全基因组分子标签鉴定 |
| 5.3.4 B87疫苗株基因组B节段改造 |
| 5.3.5 B87疫苗株基因组B节段重组病毒的拯救 |
| 5.3.6 拯救病毒感染SPF鸡胚 |
| 5.3.7 拯救病毒RT-PCR鉴定和序列分析 |
| 5.3.8 拯救病毒IFA鉴定 |
| 5.3.9 拯救病毒复制动力学分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）锚定IBDV-VP2蛋白重组乳酸菌构建及其免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要缩写词 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡传染性法氏囊病毒 |
| 1.1.1 IBD的流行病学 |
| 1.1.2 鸡传染性法氏囊病临床症状 |
| 1.1.3 鸡传染性法氏囊病防控 |
| 1.1.4 鸡传染性法氏囊病相关疫苗的研究 |
| 1.2 黏膜免疫 |
| 1.3 乳酸菌概述 |
| 1.3.1 乳酸菌的定义、分类及分布 |
| 1.3.2 乳酸菌的益生特性 |
| 1.4 递呈活载体乳酸菌的研究 |
| 1.4.1 表达外源蛋白的方法 |
| 1.4.2 重组乳酸菌诱导机体免疫应答的机制 |
| 1.5 锚定蛋白AcmA概述 |
| 1.6 母源抗体概述 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 r-L.Lactis-Usp_(45)-VP_2-RCK-AcmA_2的构建及免疫效果的评价 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 目的片段的扩增 |
| 1.2.3 目的基因的回收 |
| 1.2.4 NZ3900菌株感受态细胞的制备 |
| 1.2.5 提取pNZ8149质粒 |
| 1.2.6 载体重组构建 |
| 1.2.7 电转化重组质粒构建重组乳酸菌 |
| 1.2.8 重组菌株的筛选与鉴定 |
| 1.2.9 重组乳酸乳球菌的诱导 |
| 1.2.10 细胞壁上的蛋白提取 |
| 1.2.11 流式细胞仪分析重组乳酸菌的阳性率 |
| 1.2.12 融合蛋白表达含量的测定 |
| 1.2.13 融合蛋白稳定性检测 |
| 1.2.14 动物实验设计 |
| 1.2.15 血清抗体滴度的检测 |
| 1.2.16 中和抗体(血清)检测 |
| 1.2.17 黏膜sIgA抗体滴度的检测 |
| 1.2.19 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因片段 |
| 2.2 重组菌株的筛选与鉴定 |
| 2.3 重组菌株诱导表达的结果 |
| 2.4 流式细胞仪分析重组乳酸菌的阳性率 |
| 2.5 融合蛋白表达含量的检测 |
| 2.6 重组乳酸菌表达融合蛋白的稳定性检测 |
| 2.7 ELISA抗体和中和抗体的检测结果 |
| 2.8 黏膜sIgA抗体滴度的检测结果 |
| 2.9 攻毒保护率 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 试验二 优化OmpH主动递呈重组乳酸菌活载体平台 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 目的片段的扩增 |
| 1.2.3 目的基因PCR产物的纯化回收 |
| 1.2.4 构建重组载体 |
| 1.2.5 重组质粒电转化构建重组乳酸菌 |
| 1.2.6 重组菌株的筛选与鉴定 |
| 1.2.7 重组乳酸乳球菌的诱导 |
| 1.2.8 融合蛋白表达含量的测定 |
| 1.2.9 融合蛋白稳定性检测 |
| 1.2.10 正交实验法在优化重组乳酸乳球菌诱导表达中的应用 |
| 2.结果 |
| 2.1 目的基因片段的扩增 |
| 2.2 重组菌株的筛选与鉴定 |
| 2.3 重组菌株的诱导表达 |
| 2.4 融合蛋白表达含量的检测 |
| 2.5 融合蛋白的稳定性检测 |
| 2.6 重组乳酸乳球菌株表达蛋白的正交实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 试验三 高水平母源抗体下重组乳酸菌r-L.Lactis-VP_2-RCK的免疫效果 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组菌株的诱导及表达 |
| 1.2.2 母源抗体衰减规律的检测 |
| 1.2.3 动物实验设计 |
| 1.2.4 血清抗体滴度的检测 |
| 1.2.5 血清中和抗体滴度的检测 |
| 1.2.8 RNA提取和反转录 |
| 1.2.9 相对荧光定量PCR检测 |
| 1.2.10 淋巴细胞数量检测 |
| 2.结果 |
| 2.1 重组菌株表达 |
| 2.2 母源抗体衰减规律 |
| 2.3 中和抗体的检测结果 |
| 2.4 法氏囊囊体比 |
| 2.5 法氏囊中细胞因子在mRNA水平的差异表达 |
| 2.6 胸腺中细胞因子在mRNA水平的差异 |
| 2.7 脾脏中细胞因子在mRNA水平的差异表达 |
| 2.8 外周血淋巴细胞CD4~+/CD8~+分析结果 |
| 2.9 脾细胞CD4~+/CD8~+分析结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（6）鸡传染性法氏囊病新型疫苗的研究进展（论文提纲范文）
| 1 基因缺失/替换活疫苗 |
| 2 亚单位疫苗 |
| 3 免疫复合物疫苗 |
| 4 DNA疫苗 |
| 5 活病毒载体疫苗 |
| 5.1 禽痘病毒载体 |
| 5.2 禽腺病毒载体 |
| 5.3 新城疫病毒载体 |
| 5.4 火鸡疱疹病毒/马立克载体 |
| 6 展望 |
（7）ND-IBD二联灭活苗对商品蛋雏鸡免疫效果及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩词列表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 ND与IBD研究进展 |
| 2 ND和IBD疫苗的研究进展 |
| 2.1 ND与IBD活苗的研究进展 |
| 2.2 ND与IBD灭活苗的研究进展 |
| 2.3 疫苗佐剂 |
| 2.4 ND与IBD的疫苗免疫研究进展及注意事项 |
| 3 ND-IBD二联灭活苗研究进展 |
| 4 疫苗对免疫因子的影响 |
| 5 本课题研究的目的与意义 |
| 第二章 ND-IBD二联灭活疫苗免疫1、7日龄商品蛋鸡的免疫效果研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 毒株 |
| 1.3 试验用疫苗 |
| 1.4 试剂及试剂盒 |
| 1.5 主要试验仪器 |
| 1.6 试验用饲料 |
| 1.7 试验基地 |
| 1.8 试验数据分析相关软件 |
| 2 试验设计 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 抗体检测 |
| 2.3 攻毒保护试验 |
| 2.4 引物的设计与合成 |
| 2.5 组织RNA抽提 |
| 2.6 cDNA的合成 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 商品蛋鸡血清IBD抗体水平检测 |
| 3.2 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡IBD抗体的影响 |
| 3.3 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡ND抗体的影响 |
| 3.4 攻毒保护试验结果 |
| 3.5 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡法氏囊中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 3.6 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡脾脏中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三章 ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活疫苗免疫7日龄商品蛋雏鸡的效果比较研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 毒株 |
| 1.3 试验用疫苗 |
| 1.4 试剂及试剂盒 |
| 1.5 主要试验仪器 |
| 1.6 试验用饲料 |
| 1.7 试验基地 |
| 1.8 试验数据分析相关软件 |
| 2 试验设计 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 抗体检测 |
| 2.3 攻毒保护试验 |
| 2.4 引物设计与合成 |
| 2.5 组织RNA抽提 |
| 2.6 cDNA的合成 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ND-IBD二联灭活疫苗与弱毒活苗对商品蛋鸡IBD抗体的影响 |
| 3.2 攻毒保护试验结果 |
| 3.3 ND-IBD二联灭活疫苗与弱毒活苗对商品蛋鸡法氏囊中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 3.4 ND-IBD二联灭活疫苗与弱毒活苗对商品蛋鸡脾脏中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 IBD研究进展 |
| 1.1 IBD流行病学特点 |
| 1.2 IBD病原学特征 |
| 1.3 IBDV基因组结构与VP2蛋白 |
| 1.4 IBDV毒株 |
| 1.5 IBDV的诊断 |
| 1.6 IBD的防治 |
| 2 ND研究进展 |
| 2.1 ND流行病学特点 |
| 2.2 ND病原学特征 |
| 2.3 ND的诊断 |
| 2.4 ND的防制 |
| 3 ND和IBD疫苗的研究进展 |
| 3.1 IBD疫苗研究进展 |
| 3.2 ND疫苗研究进展 |
| 3.3 疫苗的基本要求 |
| 3.4 免疫失败的原因 |
| 4 疫苗免疫监测方法 |
| 5 PCR-RFLP研究进展 |
| 5.1 PCR-RFLP的基本原理 |
| 5.2 PCR-RFLP技术的应用 |
| 6 本研究目的和意义 |
| 第二章 ND-IBD二联灭活苗对100日龄种母鸡的免疫效果研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验分组 |
| 2.2 免前抗体水平检测 |
| 2.2.1 HA试验(微量法) |
| 2.2.2 HI试验(微量法) |
| 2.2.3 TCVN(固定病毒稀释血清) |
| 2.3 免后抗体水平检测 |
| 2.4 种蛋的收集 |
| 2.5 子代雏鸡抗体水平检测 |
| 2.6 攻毒保护试验 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 ND-IBD二联灭活苗对种母鸡ND抗体水平的影响 |
| 3.2 ND-IBD二联灭活苗对种母鸡IBD抗体水平的影响 |
| 3.3 四批次孵化雏鸡ND抗体水平的分析 |
| 3.4 四批次孵化雏鸡IBD抗体水平的分析 |
| 3.5 攻毒保护结果 |
| 3.6 中和试验中DF-1细胞病变观察 |
| 4 讨论 |
| 第三章 ND和IBD卵黄抗体与子代血清抗体的相关性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验分组 |
| 2.2 氯仿法提取卵黄抗体 |
| 2.3 HI试验和ELISA试验 |
| 2.4 数据处理 |
| 2.5 结果的比对 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 种蛋ND卵黄抗体与子代血清抗体水平几何均值 |
| 3.2 种蛋IBD卵黄抗体与子代血清抗体水平几何均值 |
| 3.3 免疫组种蛋ND卵黄抗体与子代血清ND抗体水平相关性分析 |
| 3.4 免疫组种蛋IBD卵黄抗体与子代血清抗体水平相关性分析 |
| 3.5 血清抗体水平与卵黄抗体水平比对结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 IBDV强弱毒株鉴别诊断方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 病毒RNA提取 |
| 2.3 RT-PCR以及PCR扩增 |
| 2.4 PCR产物测序 |
| 2.5 琼脂糖凝胶回收目的基因 |
| 2.6 限制性内切酶BamHI和PstI进行酶切 |
| 2.7 特异性试验 |
| 2.8 敏感性试验 |
| 2.9 重复性试验 |
| 2.10 病料检测 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 BC6-85和B87 VP2基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 BC6-85和B87酶切结果 |
| 3.3 特异性试验结果 |
| 3.4 敏感性试验结果 |
| 3.5 重复性试验结果 |
| 3.6 病料PCR-RFLP检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（9）鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的可溶性表达及其免疫特性的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 鸡传染性法氏囊病的概述 |
| 1.2 传染性法氏囊病病毒的生物学特性 |
| 1.3 IBDV的基因组 |
| 1.4 IBDV的编码蛋白 |
| 1.5 IBDV的毒力及致病性研究 |
| 1.6 IBDV VP2蛋白的B细胞表位研究进展 |
| 1.7 IBD的诊断 |
| 1.8 IBD疫苗的研究进展 |
| 1.9 目前存在的问题及本研究的目的意义 |
| 2 9种标签对IBDV VP2蛋白可溶性表达及纯化的影响 |
| 引言 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的原核表达与纯化 |
| 引言 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 IBDV VP2 蛋白免疫原性的研究 |
| 引言 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（10）鸡传染性法氏囊病疫苗及其应用的进展（论文提纲范文）
| 1 病原简介 |
| 2 流行病学新特点 |
| 3 疫苗的种类 |
| 3.1 传统疫苗 |
| 3.1.1 囊组织灭活疫苗 |
| 3.1.2 胚组织灭活疫苗 |
| 3.1.3 细胞培养病毒灭活疫苗 |
| 3.1.4 病毒低毒力活疫苗 |
| 3.1.5 病毒中等毒力活疫苗 |
| 3.1.6 高毒型疫苗 |
| 3.2 新型疫苗 |
| 3.2.1 亚单位疫苗 |
| 3.2.2 VLP疫苗 |
| 3.2.3 重组活载体疫苗 |
| 3.2.4 高压力失活疫苗 |
| 3.2.5 VP5基因缺失疫苗 |
| 3.2.6 核酸疫苗 |
| 4 疫苗的免疫 |
| 4.1 科学地选择和使用疫苗 |
| 4.2 选择正确的免疫程序 |
| 5 问题与展望 |
| 5.1 存在的主要问题 |
| (1) 盲目选用疫苗或免疫程序不合理是存在的主要问题。 |
| (2) 疫苗的研制方法本身决定了疫苗的局限性。 |
| 5.2 展望 |
四、鸡传染性法氏囊病新型疫苗的研制策略（论文参考文献）
- [1]传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析[D]. 秦颖. 扬州大学, 2021(02)
- [2]鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒重组蛋白的免疫保护效果研究[D]. 项瑞. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株的鉴定及疫苗株构建[D]. 范林进. 中国农业科学院, 2020
- [4]传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究[D]. 陈果. 广西大学, 2019(02)
- [5]锚定IBDV-VP2蛋白重组乳酸菌构建及其免疫效果评价[D]. 张园. 石河子大学, 2019(01)
- [6]鸡传染性法氏囊病新型疫苗的研究进展[J]. 杨宵玥,陈玲,宋亚芬,蒋桃珍. 中国兽药杂志, 2018(05)
- [7]ND-IBD二联灭活苗对商品蛋雏鸡免疫效果及机制研究[D]. 星东. 福建农林大学, 2017(01)
- [8]ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究[D]. 赖隆永. 福建农林大学, 2017(01)
- [9]鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的可溶性表达及其免疫特性的研究[D]. 蒋大伟. 河南农业大学, 2016(06)
- [10]鸡传染性法氏囊病疫苗及其应用的进展[J]. 陆有飞,韦平,阳秀英,黄志永,胡凤梅. 广西农业生物科学, 2008(04)