一、DISTRIBUTION PATTERNS OF EXTRACELLULAR MATRICES IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA AND THEIR CLINICAL SIGNIFICANCE（论文文献综述）
钱建新[1]（2020）在《核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究》文中认为根据解剖位置胆管癌分为三类:肝内（intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA）、肝门部（perihilar cholangiocarcinoma,pCCA）以及远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma,dCCA）,其中肝门部胆管癌是最常见类型,占比超过60%。虽然位置不同,各类胆管癌发生的相关风险因素比较类似:原发性硬化性胆管炎（PSC）、胆道内的结石和寄生虫所导致的肝脏疾病。淋巴结浸润和边缘肿瘤细胞是否残留是决定术后预后的最重要因素。根治性手术切除的肝门部胆管癌5年生存率在10%到40%之间,然而,即使是R0切除,其复发率高达50～70%,高侵袭性和高复发性是pCCA两大病理特性。对于肝门部胆管癌发生发展分子机制的探寻以及胆管癌预后预测、治疗靶点筛选等一直是其临床研究重点。核糖体是细胞活动中极为重要的细胞器,负责将“RNA翻译成蛋白质”这一生物合成过程。此外,核糖体蛋白（ribosomal proteins,RPs）可调控细胞周期和细胞生长,促进肿瘤发生和发展。RPL34隶属于核糖体蛋白RPL34E家族成员。RPL34既往主要集中于非人类标本如昆虫和植物中进行研究。近年来,大量数据表明RPL34在不同类型恶性肿瘤如非小细胞肺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌等中表达异常,其主要功能是通过调控细胞周期,促进细胞增殖。这些发现提示RPL34可能参与胆管癌发生发展。然而RPL34及功能在肝门部胆管癌中的研究少见报道。本实验拟研究RPL34在肝门部胆管癌中的表达,并分析其与临床病理参数和复发预后之间的相关性。进一步通过细胞学和动物实验探寻其在肝门部胆管癌中功能作用,最后利用高通量筛选寻找RPL34调控或者相关的靶基因。通过本课题的一系列研究,探索RPL34及其靶基因是否能够成为一种预测pCCA复发及预后的有效标志物,以及其能否成为pCCA潜在的临床治疗研究靶点。第一部分肝门部胆管癌病理特征与核糖体蛋白表达分析及其临床意义目的:检测核糖体蛋白在人pCCA中的表达谱系,并统计分析其与临床病理参数以及复发和预后的相关性,初步探寻核糖体蛋白在人pCCA发生发展中的潜在意义。方法:收集肝门部胆管癌以及部分癌旁非肿瘤性样本,首先从形态学观察肝门部胆管癌的病理特征;其次收集新鲜肝门部胆管癌样本,RT-PCR检测RPs家族成员在肿瘤样本中的表达谱系情况;然后采用组织芯片（tissue microarray,TMA）技术结合免疫组化（immunohistochemistry,IHC）技术,从蛋白水平针对RPL34蛋白检测其在pCCA细胞和癌旁非肿瘤组织中的表达;进而总结分析统计染色结果,并与临床病理信息、复发以及总生存时间相关联,探寻RPL34在人肝门部胆管癌中的表达和临床价值。结果:（1）肝门部胆管癌的临床病理学分析:肿瘤细胞呈不规则腺管样排列,可见筛状结构,浸润性生长。肿瘤细胞核异型明显,可见核仁,核分裂像或病理性核分裂像多见。间质可见明显的促结缔组织反应。根据肿瘤间质比（tumor-stroma ratio,TSR）=50%的最佳截断值,将患者分为“stroma-rich,间质丰富”和“stroma-poor,间质贫乏”,本研究中85例（70.2%）患者为间质贫乏,36例（29.8%）患者为间质丰富。TSR低（间质丰富）的肝门部胆管癌患者更加易于发生淋巴结转移和疾病进展迅速。TSR高（间质贫乏）的患者中位无复发生存期为1.5年,TSR低的患者中位无复发生存期为0.5年,P=0.073。TSR高的患者中位生存期为1.7年,TSR低的患者中位生存期为1.0年,P=0.028。神经侵犯（perineural invasion,PNI）是肝门部胆管细胞癌的另一个显着的病理特征。本研究中94例（77.7%）组织样本中存在神经侵犯,27例（22.3%）患者组织样本中未见明显的神经侵犯,PNI更常见于伴有淋巴结转移和晚期肝门部胆管癌患者。（2）RPs家族成员在肝门部胆管癌中表达均出现不同程度的上调,提示该家族主要成员在肝门部胆管癌发生中可能起重要的作用。其中RPSA（P=0.0266）、RPS2（P=0.0309）、RPL34（P=0.0034）、RPL37（P=0.0584）、RPP0（P=0.0345）在肿瘤组织中的表达要明显高于癌旁非肿瘤组织中的表达,RPL34最为显着。（3）在pCCA癌旁非肿瘤上皮细胞中RPL34不表达或呈微弱表达,pCCA肿瘤组织中RPL34染色定位于细胞浆和细胞核,呈棕黄色或深褐色。RPL34在pCCA肿瘤组织中表达率为77.7%（94/121）。（4）pCCA肿瘤细胞中RPL34表达与肿瘤细胞分化不良和淋巴结转移高度相关。主要表现为:肿瘤细胞的分化程度越低,RPL34表达越高;低分化组的阳性率（82%）要显着高于中、高分化组（30%）（P=0.001）。RPL34表达与淋巴结的转移率呈正相关（淋巴结转移阳性组vs淋巴结转移阴性组为84.6%vs 69.6%,P=0.049）。RPL34阳性与患者年龄、性别、肿瘤体积以及临床分期均没有统计学关联（P>0.05）。（5）单因素分析显示,边缘阳性（P=0.024）、区域淋巴结（P=0.015）、晚期（P=0.023）与pCCA肿瘤复发相关。与RPL34阴性表达的患者相比,RPL34阳性的患者中位无复发生存期更短（1.46年vs 3.73年,P<0.001）。在Cox模型中,RPL34表达是肿瘤复发的独立预测因素。单因素生存分析表明肝门部胆管癌患者的不良预后与手术切缘阳性（P=0.013）、T分期（P=0.019）、淋巴结转移（P=0.001）、TSR（P=0.028）、TNM分期（P=0.003）以及组织分化程度（P=0.025）呈正相关。与RPL34阴性表达的患者相比,RPL34阳性的患者中位生存期更短（1.70年vs 3.63年,P<0.001）。在多因素模型中,RPL34表达和TSR是肝门部胆管癌的独立预后预测因子。结论:肝门部胆管癌具有显着异常的TSR和PNI,两者均与pCCA的淋巴结转移和疾病进展迅速相关。RPs在pCCA中泛化表达,提示核糖体生物发生在肝门部胆管癌发生发展中起到重要作用。RPL34在pCCA中高表达,其表达与疾病进展和淋巴结转移相关,RPL34的高表达患者更加易于复发,并伴随不良转归。本研究结果提示了RPL34在肝门部胆管癌中具有促癌的作用。第二部分核糖体蛋白RPL34对肝门部胆管癌细胞侵袭生长的影响目的:为探索RPL34在肝门部胆管癌中的促癌作用及机制,观察其对癌细胞增殖、侵袭和体内成瘤及转移能力的影响。方法:合成RPL34-shRNA,包装慢病毒颗粒,靶向肝门部胆管癌细胞内源性RPL34,Western blotting检测RPL34的表达,CCK8法观察其对pCCA细胞增殖的影响,Transwell检测RPL34-sh RNA对pCCA细胞侵袭能力的改变,裸鼠成瘤实验观察RPL34-shRNA对pCCA细胞体内成瘤和转移能力的影响。结果:慢病毒载体携带shRNA成功对RPL34基因进行敲减,内源性RPL34的下降表达能够抑制肝门部胆管癌细胞的生长和迁移能力,同时也能够降低肿瘤细胞的体内成瘤能力以及向肝脏转移能力。结论:在肝门部胆管癌中RPL34可能起到促癌基因的功能,其促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长,主要通过增强pCCA细胞转移和增殖能力。第三部分核糖体蛋白RPL34促肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用机制目的:应用基因芯片检测RPL34-shRNA感染敲减RPL34的肝门部胆管癌细胞QBC939与对照胆管癌细胞的基因表达差异,初步探寻RPL34促进肿瘤侵袭生长的分子机制。方法:（1）Western blotting检测RPL34-shRNA感染后部分EMT相关指标和代谢相关指标的表达;（2）收集感染空白对照的肝门部胆管癌细胞和感染RPL34-sh RNA的肝门部胆管癌细胞,Trizol保存,送至基因检测平台;（3）利用Affymetrix?人类基因组U219微阵列检测感染RPL34-shRNA后基因表达的改变情况。Gene ontology和KEGG通路分析确定基因敲减后影响的信号通路和/或基因;（4）选择部分关键基因,进行Western blotting验证、利用TMA+IHC进行临床验证和统计分析;（5）构建了全长BCAS2（breast carcinoma amplified sequence 2）的质粒,并在RPL34敲减细胞中过表达BCAS2,采用CCK8检测细胞增殖、Transwell检测侵袭能力的改变。结果:（1）RPL34敲减后引起E-cadherin的表达上调,提示RPL34可能通过影响EMT促进肝门部胆管癌细胞的侵袭。而代谢相关指标未发生明显变化。（2）基因芯片结果显示160个基因在敲减内源性RPL34后发生显着改变。功能分类显示排名前八位的信号通路分别是:钾离子跨膜运输、核小体组装、心脏传导、细胞蛋白质代谢过程、蛋白质分解代谢、非同源端接双链修复、通过端粒酶端粒维持和信使RNA剪接等。前5位下调差异基因包括:SETD2（SET domain containing 2）（Fold change=-2.20,P=0.043）、COA6（cytochrome c oxidase assembly factor 6）（Fold change=-2.05,P=0.035）、TSEN15（tRNA splicing endonuclease subunit 15）（Fold change=-1.94,P=0.011）、BCAS2（breast carcinoma amplified sequence 2）（Fold change=-1.94,P=0.039）和HNRNPLL（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-like）（Fold change=-1.92,P=0.00029）。经过生物信息学分析,发现BCAS2和HNRNPLL两个基因与肿瘤相关。（3）RPL34调控蛋白BCAS2定位于细胞核和细胞浆,在非肿瘤上皮中呈弱表达,在肿瘤组织中呈强表达,肿瘤中的表达率为76.0%（92/121）。其表达与肿瘤分化呈正相关。与BCAS2阴性的患者相比,BCAS2阳性的患者中位无复发生存期更短（1.69年vs3.14年,P=0.012）。（4）敲减RPL34后肝门部胆管癌细胞的侵袭生长能力下降,当过表达BCAS2后,癌细胞的侵袭生长能力有所恢复。提示BCAS2能够部分逆转RPL34敲减所致的异常生物学行为。结论:本部分研究从机制上初步揭示了RPL34促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的潜在机制:RPL34可能通过EMT促进肿瘤侵袭生长;RPL34敲减后基因分析结果提示RPL34通过影响细胞核的翻译、转录、剪切和组装等功能,增强肝门部胆管癌细胞侵袭生长能力;基因芯片筛选出的RPL34相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达,其阳性表达与肝门部胆管癌的恶性生物学行为和不良预后密切相关,过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞侵袭生长能力的下降,提示RPL34可能通过BCAS2发挥促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用。总结RPL34在肝门部胆管癌中显着高表达,具有促肝门部胆管细胞侵袭生长作用。基因芯片检测、生物信息分析和蛋白免疫印迹验证提示RPL34可能通过EMT以及多种信号传导通路促进肝门部胆管癌的侵袭生长。高通量筛选所发现相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达,过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞增殖能力和侵袭能力的下降,提示BCAS2是RPL34可能的下游分子。RPL34有望成为一种预测肝门部胆管癌复发和预后的肿瘤标志物,靶向RPL34介导的信号通路可能成为pCCA潜在的治疗策略。
王维伟[2]（2020）在《LncRNA BZRAP1-AS1介导THBS1甲基化在肝细胞癌血管生成中的机制研究》文中进行了进一步梳理背景:肝细胞癌是最常见的原发性肝癌,死亡率很高。长链非编码RNA（LncRNA）最近已出现作为癌症发展和进程中的调节剂,并可作为新的治疗靶标。在本研究中,我们旨在探讨LncRNA BZRAP1-AS1与肝细胞癌血管生成的关系。方法:采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测临床肝细胞癌组织样本及肝细胞癌细胞系中LncRNA BZRAP1-AS1的表达情况;荧光原位杂交（FISH）、核质分离法检测BZRAP1-AS1在肝细胞癌细胞内的定位;小管形成实验显示体外血管生成情况;鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成试验显示体内血管生成情况。qRT-PCR检测基因表达表达,甲基化特异性PCR（MSP）、亚硫酸盐修饰测序法（BSP）、RNA Pull-down、RNA免疫共沉淀（RIP）、双荧光素酶报告基因实验、染色质免疫共沉淀（ChIP）检测BZRAP1-AS1、DNMT3b、THBS1的相互作用关系。采用BALB/C裸鼠构建肝癌细胞移植瘤模型;苏木素伊红（HE）染色观察肿瘤组织病理学改变;免疫组织化学染色、免疫荧光染色技术检测体内血管生成情况。结果:LncRNA BZRAP1-AS1在肝细胞癌组织及肝细胞癌细胞系中高表达,FISH、核质分离结果显示BZRAP1-AS1主要定位于细胞核。小管形成实验、CAM实验显示过表达BZRAP1-AS1提高血管生成能力;进一步探讨其机制发现,qRT-PCR结果显示过表达BZRAP1-AS1下调THBS1 mRNA,甲基化转移酶抑制剂5-Aza可减弱这种作用;MSP、BSP结果显示过表达BZRAP1-AS1增加THBS1甲基化程度;RIP、RNA Pull-down的结果显示BZRAP1-AS1与DNMT3b相互结合;双荧光素酶报告基因实验和ChIP结果显示BZRAP1-AS1、DNMT3b可富集在THBS1启动子区。在肝癌荷瘤体内模型中,HE染色结果显示过表达BZRAP1-AS1移植瘤组织血管增多;免疫组织化学染色、免疫荧光染色结果显示过表达BZRAP1-AS1移植瘤瘤体微血管密度增加、CD31表达水平增加。结论:长链非编码RNA BZRAP1-AS1与DNMT3b相互作用并将DNMT3b募集到THBS1启动子,导致CPG位点高甲基化和基因沉默,正向调控肝细胞癌的血管生成。
田萍[3]（2020）在《CBX7通过ITGβ3/TGFβ1/AKT信号通路在宫颈癌进展中的作用机制研究》文中研究说明目的:探讨色素框同源物7（CBX7）在宫颈癌中的作用,对化疗药物敏感性的影响,论证CBX7通过整合素β3（ITGβ3）/转化生长因子β1（TGFβ1）/蛋白激酶B（AKT）信号通路干扰宫颈癌上皮间质转化（EMT）的发生、宫颈癌的进展和化疗药物治疗的敏感性。方法:免疫组织化学法（IHC）检测人宫颈癌组织中CBX7及肿瘤相关基因ITGβ3、TGFβ1、磷酸化磷酯酰肌醇-3激酶（PI3K）、AKT、上皮细胞钙粘蛋白（E-cad）和波形蛋白（VIM）,回顾性收集患者临床病理信息。分析CBX7和肿瘤相关基因在癌组织与癌旁非瘤组织中表达的差异;分析CBX7与临床病理参数、肿瘤相关基因的关系;采用生存分析,评价CBX7表达对宫颈癌患者生存的影响。利用Lentivirus载体系统转染He La、Si Ha细胞,构建CBX7过表达和下调的稳定转染细胞系。将稳定转染Si Ha细胞暴露于顺铂,应用敲低CBX7 Si Ha（si CBX7 Si Ha）细胞建立移植瘤模型。采用MTT、克隆形成实验方法检测细胞生长情况;伤口愈合实验、Transwell侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭情况;流式细胞仪技术检测细胞凋亡情况;检测转染不同水平CBX7细胞的成瘤率、移植瘤体积及重量;IHC、实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）检测移植瘤模型中CBX7及肿瘤相关基因的表达水平。利用RNAi的方法下调稳定转染细胞株中TGFβ1表达,抑制ITGβ3/TGFβ1轴;将稳定转染Si Ha细胞暴露顺铂,检测上述细胞生长、侵袭能力和凋亡情况;检测转染与未转染sh RNA TGFβ1细胞中,暴露与未暴露顺铂中CBX7及肿瘤相关基因的m RNA和蛋白的表达变化。结果:（1）CBX7的表达水平与临床分期、淋巴结转移,脉管浸润显着负相关,并随着组织分化的消除而表达下降;（2）CBX7与宫颈癌生存率呈正相关;（3）IHC检测CBX7在宫颈癌组织中阳性表达率低于癌旁非瘤组织并与ITGβ3、TGFβ1、PI3K、AKT、p-AKT和VIM负相关,与E-cad正相关;（4）稳定转染细胞的生物学行为检测,敲低CBX7促进了宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,凋亡能力明显减弱;上调CBX7提高了顺铂对Si Ha细胞的增殖抑制和凋亡作用;敲低CBX7提高了裸鼠成瘤率,增加了移植瘤模型的体积和体重;（5）IHC分析移植瘤组织结果显示,CBX7、E-cad在si CBX7组阳性表达率低于对照组;VIM高于对照组;ITGβ3、TGFβ1在si CBX7组阳性表达水平高于对照组;（6）移植瘤中ITGβ3、TGFβ1、PI3K和AKT m RNA高于对照组;（7）沉默TGFβ1的细胞生物学行为检测,沉默TGFβ1消弱了si CBX7对细胞增殖的促进作用和对凋亡的抑制作用;（8）敲低CBX7升高了ITGβ3、TGFβ1、PI3K、AKT、VIM m RNA和蛋白等表达,降低了E-cad表达;采用sh RNA TGFβ1转染逆转了si CBX7对ITGβ3、TGFβ1、PI3K、AKT、VIM m RNA和蛋白的升高,抑制了对E-cad的降低;（9）Si Ha细胞暴露于顺铂,过表达CBX7调低了ITGβ3/TGFβ1信号通路及VIM的m RNA和蛋白表达,升高了E-cad的表达。结论:CBX7在人宫颈癌组织中表达降低,CBX7是宫颈癌预后的预测因子之一;CBX7的低表达可促进宫颈癌细胞生长、迁移和侵袭,抑制凋亡,CBX7过表达提高了宫颈癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性;si CBX7调控ITGβ3/TGFβ1轴调节宫颈癌EMT的发生,沉默TGFβ1,可以部分逆转宫颈癌细胞EMT表征;CBX7通过ITGβ3/TGFβ1轴调节PI3K/AKT信号通路影响EMT的发生和化疗药物敏感性;证明CBX7在宫颈癌中是抑癌基因,可能是治疗宫颈癌的一个潜在因子,通过CBX7抑制ITGβ3/TGFβ1信号通路可能成为提高宫颈癌疗效的一种新的治疗途径。
廖小莉[4]（2019）在《THBS2在肝细胞癌表达的临床意义及其生物学功能的初探》文中研究说明原发性肝癌（Primary Liver Cancer,,PLC,简称肝癌）是全球最常见恶性肿瘤之一,发病率居第六位,死亡率居第四位,PLC中约90%是肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）。全球一半肝癌的发病率和死亡率发生在中国。根治手术治疗是目前肝癌病人获得长期生存的最重要手段之一,但是术后的高复发率仍然是严重影响患者预后的重要因素。临床上观察到即使临床病理特征匹配的肝癌患者,术后无病生存期（disease free survival,DFS）却截然不同,这提示着人体内存在更精细的基因异常。蛋白质是基因功能的最终执行者,疾病发生、发展的根源与编码这些关键基因的蛋白质功能出现异常密切相关。因此本课题选择9对基线特征匹配的肝癌根治术后而术后DFS时间长短明显不同的患者标本,进行440个高通量蛋白质芯片筛选,找到相关的差异表达蛋白THBS2。并对THBS2在恶性肿瘤表达对患者预后的判断价值展开meta分析,在此基础上开展以下实验研究:（1）THBS2表达与肝细胞癌患者临床病理特征及预后的相关性;（2）在体外细胞水平上初步研究THBS2表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭生物学行为的影响。第一部分 高通量蛋白质芯片筛选肝癌根治术后复发转移的潜在标志物:THBS2目的:筛选肝癌患者根治术后影响复发转移的生物标志物。方法:将18例行肝癌根治术的肝细胞癌患者按照手术后不同的无病生存期分为两组:A组DFS>3年,B组DFS<1.5年,每组各9人。两组患者的临床病理基线特征匹配。将这18例患者的手术切除肿瘤组织样本抽提蛋白,用蛋白芯片（RayBiotech,GSH-CAA-440）检测与癌症发生相关的440个蛋白的含量。利用蛋白质组学的手段,对这18例患者中的蛋白表达特征进行了分析和探索。结果:A、B两组HCC患者中位DFS分别为58.0和15.5个月,P<0.001。我们根据火山图筛选出31个差异表达蛋白,其中25个蛋白在B组（易复发组）中高表达,而上调最显着的前五名依次是:MIP-1b、TIMP-2、MIP-1a、THBS2和AFP。热图分析显示THBS2的表达模式和AFP非常相似。GO功能及KEGG富集分析提示:肿瘤转移相关通路的主要调控蛋白有:MIP-1a、MIP-1b、THBS1、THBS2、VCAM-1、ICAM-2 等。蛋白互作分析结果提示:MIP-1a、MIP-1b、THBS1、THBS2均在蛋白互作网络的重要节点上。THBS2蛋白在B组的芯片扫描信号均值为:32969.11,A组为5875.96,B/A表达差异变化倍数为5.5（t=2.9,P=0.019）。THBS1蛋白B/A的表达差异变化倍数为 1.5（t=2.434,P=0.027）。结论:蛋白质组学技术筛选出与肝癌根治术后复发转移相关的潜在生物标志物:THBS2。第二部分 THBS2在恶性肿瘤的表达对患者预后判断价值的meta分析目的:依据单个研究的结果不足以评判THBS2是否可以作为一种有效的预后指标。因此,我们通过meta分析,以评估THBS2在恶性肿瘤的表达对患者预后判断的价值。方法:通过检索Pub-Med、Cochrane系统评论数据库、EM-BASE平台,用Stata15.0软件对文献中的诊断数据进行meta分析。采用危险比（HRs）和95%置信区间（CIs）作为评价标准,全面分析THBS2表达与肿瘤生存预后的相关性。采用Q检验和I2统计学双检验异质性。发表偏倚用漏斗图和Egger线性回归法进行评价。结果:13个研究2664名恶性肿瘤患者关于总生存（OS）的meta分析结果提示,THBS2高表达恶性肿瘤患者不良生存预后的风险是THBS2低表达患者的1.49倍（95%CI:1.34-1.66,P<0.001）。纳入的4篇文献中共含6组数据5000名恶性肿瘤患者关于无病生存（DFS）的meta分析结果提示,总的合并值为（HR=1.22,95%CI:1.11-1.35,P<0.001）,THBS2 表达量的升高与肿瘤患者不良生存预后的终点事件发生明显相关。结论:THBS2高表达与恶性肿瘤患者的不良生存预后明显相关,其可以考虑作为恶性肿瘤患者总生存和无病生存的一个预测指标。第三部分 THBS2表达与肝细胞癌患者临床病理特征及预后的相关性目的:本研究拟扩大样本量,分析THBS2表达与129例HCC患者临床病理特征及预后的相关性。方法:通过ELISA方法检测20例HCC患者癌及配对癌旁组织中THBS2表达,并应用相应的统计学方法分析THBS2的表达情况与129例HCC患者临床病理特征及预后的相关性。结果:THBS2蛋白在20例HCC癌组织中的表达水平显着高于配对癌旁组织（Z=-3.696,P<0.001）。THBS2在129例HCC癌组织中的表达与肿瘤数目（P=0.018）、BCLC分期（P=0.013）有关。THBS2在复发转移时间≤12m组、>12m且≤24m组、>24m组的总体表达差异具有统计学意义,THBS2表达水平越高,复发转移时间越早（χ2=11.758,P<0.05）。Kaplan-Meier生存分析结果提示,THBS2高表达的患者中位DFS、OS均短于THBS2低表达者（P=0.032,P=0.036）。肿瘤最大径>5cm,THBS2高表达患者根治术后出现复发转移时间更早,预后更差（P=0.002）。寿命表及Log-rank法分析结果显示:THBS2高表达组在3年、4年、5年的生存率均较THBS2低表达组差（P值均<0.05）。COX单因素分析提示:THBS2高表达、肿瘤数目>1个、有癌栓、病理恶性程度较高（低/中-低分化）、BCLC分期、TNM分期较晚均是HCC患者术后DFS和OS的不良预后因素（P值均<0.05）。肿瘤数目是影响HCC患者DFS、OS的独立危险因素（P<0.001）。结论:THBS2在HCC癌组织中高表达。THBS2高表达提示HCC患者复发转移风险更高,中位DFS及OS均更短,生存预后更差。第四部分 在体外细胞水平上研究THBS2过表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭生物学行为的影响。目的:探讨过表达THBS2对肝癌细胞HepG2、SMMC-7721生物学行为的影响。方法:通过qRT-PCCR和Western blot对正常人肝细胞LO2、四种人肝癌细胞 HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H、Huh-7 中 THBS2 的表达情况进行检测。用构建的THBS2过表达重组慢病毒载体稳定转染肝癌细胞HepG2、SMMC-7721后,用CCK-8法、平板克隆形成实验、划痕实验和Transwell法测定转染目的基因后细胞的增殖、迁移及侵袭能力的变化。结果:qRT-PCR和Western blot结果显示,THBS2 mRNA和蛋白在肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H、Huh-7中的表达水平高于正常肝细胞LO2（P<0.05）。CCK-8法和平板克隆形成实验结果显示:过表达THBS2能够显着增强肝癌细胞的增殖能力（P<0.05）;划痕实验及Transwell迁移和侵袭实验结果显示:过表达THBS2后肝癌细胞的迁移、侵袭能力也明显增强（P<0.05）。结论:人肝癌细胞中THBS2呈高表达水平。过表达THBS2能明显增强肝癌细胞HepG2、SMMC-7721的增殖、迁移及侵袭能力,提示THBS2与肝癌细胞的恶性生物学行为有关。
陈辉[5]（2017）在《原发性肝细胞癌组织分泌蛋白质组的定量蛋白质组学研究》文中提出目的蛋白质组学技术筛选肝癌病人组织体外培养分泌蛋白,寻找肝癌诊断潜在的候选标志物,通过GO和IPA分析,初步探讨其在肝癌发生发展的分子机制,并结合病人临床资料,验证差异蛋白在肝癌诊断、复发预测及预后评估中的作用。方法1.无血清培养肝癌组织、癌旁组织以及远癌组织,对不同培养时间的组织进行苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE染色）、TUNEL（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling）细胞凋亡及免疫蛋白印迹（Western Blot,WB）检测优化获得分泌蛋白的最佳时间。2.iTRAQ联合2D LC-MS/MS)技术分析肝癌组织体外无血清培养分泌蛋白,筛选差异表达分泌蛋白,初步了解肝癌组织分泌蛋白质组学的特征。3.对筛选到的差异表达分泌蛋白进行GO（Gene Ontology）和IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析。GO分析包括亚细胞定位（Cell component,CC）、分子功能（Molecular Function,MF）及生物过程（Biological Process,BP）分类,IPA分析差异表达蛋白的生物通路和蛋白质相互作用网络。4.收集49例HCC病人术前血清及23例配对健康人血清,平行反应监视（Parallel reaction monitoring,PRM）分析差异分泌蛋白CA2、KRT19在HCC病人和健康人中的血清浓度。受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）比较CA 2、KRT 19单独及联合诊断肝癌的能力。另收集82例肝癌病人术后血清标本,ELISA（Enzyme linked immunosorbent assay,）检测差异表达蛋白CA 2在肝癌病人中的血清浓度,Logistic回归分析HCC病人血清CA 2浓度与临床病理特征的关系和术后复发转移的关系,生存曲线分析HCC病人血清CA2浓度与肝癌复发以及生存率之间的关系。结果1.对肝癌组织进行体外无血清培养并提取分泌蛋白,对不同培养时间的组织进行HE染色,细胞凋亡检测,结果发现肝癌组织培养24小时是提取分泌蛋白的最好时间点。Western Blot检测发现提取的分泌蛋白无胞内蛋白污染。2.iTRAQ联合2D LC-MS/MS技术分析肝癌组织体外无血清培养的分泌蛋白质组学差异,共鉴定出2388种分泌蛋白,这些蛋白符合分泌蛋白的蛋白组学特征。癌组织与远癌组织比较发现36个差异分泌蛋白,其中表达上调14个,表达下调22个;癌旁组织与远癌组织比较发现90个差异分泌蛋白,其中表达上调27个,表达下调63个;两组有24个共同的差异表达蛋白,其中有11个表达上调,13个表达下调。3.对差异分泌蛋白进行GO和IPA分析。癌组织与远癌组织（C/F组）的差异分泌蛋白主要涉及代谢进程、与生长发育相关的进程、肿瘤微环境改变等;癌旁组织与远癌组织（P/F组）的差异分泌蛋白主要涉及代谢进程,特别是含硫化合物的代谢,以及酶抑制等。IPA分析发现C/F组的差异分泌蛋白主要以胞外信号调节激酶（Extracellular signal-regulated kinase,ERK）为中心的调控网络,P/F组的差异分泌蛋白主要以磷脂酰肌醇-3-羟激酶/丝氨酸激酶（Phosphatidylinosit ol 3 kinase/Serine/threonine kinase,PI3K/AKT）为中心的调控网络,两组共同的差异表达蛋白主要以核转录因子κB（Transcription factor nuclear factor-κB,NF-κB）为中心的调控网络。4.PRM分析差异分泌蛋白碳酸酐酶2（Carbonic anhydrase 2,CA2）、细胞角蛋白19（Keratin,type I cytoskeletal 19,KRT19）在HCC病人和健康人中的血清浓度,结果表明CA2和KRT19肝癌病人的血清中的表达量显着高于其在正常人血清中的含量。ROC分析CA2和KRT19诊断肝癌的曲线下面积分别是0.715和0.728,CA2与KRT19联合诊断肝癌的AUC为0.817（P=0.000）,敏感性为67.3%,特异性为87%。ELISA法检测差异表达蛋白CA2在肝癌术后病人中的血清浓度,CA2在肝癌复发病人血清中的浓度显着高于未复发病人（P<0.05）。Logistic回归发现CA2表达与肿瘤数目（P=0.026）和BCLC分期（P=0.042）显着相关,CA2为影响HCC根治性切除术后复发/转移的独立危险因素（P<0.05）。生存曲线分析发现CA2低浓度的肝癌病人的无复发生存率显着高于CA2高浓度的肝癌病人（P<0.05）。结论1.体外培养肝癌组织并提取分泌蛋白的方法可靠。2.iTRAQ联合2D LC-MS/MS技术可以筛选出一系列原发性肝癌组织相关差异分泌蛋白,这些差异蛋白有望成为肝癌诊断潜在的候选标志物。3.含硫氨基酸代谢紊乱与肝癌的早期发生关系密切,乙醇代谢紊乱在肝癌发生、发展中起着重要作用。CA2、KRT19可能通过ERK、AKT/PI3K、NF-k B蛋白-蛋白相互作用网络通路促进肝癌的发生发展。4.CA2和KRT19有望成为肝癌诊断的候选标志物;CA2还可用于肝癌病人术后复发转移的预测及无复发生存率的评估。
钱晓云[6]（2017）在《上皮间质转化（EMT）相关分子标记物在咽喉鳞状细胞癌中的表达及其临床意义》文中指出目的 探讨上皮钙黏蛋白（E-cadherin,ECD）的表达在喉癌中的预后价值。方法 在临床研究中,共有79例接受手术的喉癌患者纳入本研究,通过免疫组织化学染色检测喉癌组织中ECD的表达及其与临床病理因素的关系。在体外研究中,培养ECD上调细胞（Ad-ECD）和ECD下调细胞（sh-ECD）,并采用流式细胞术检测细胞凋亡。在体内研究中,在裸鼠皮下注射Ad-ECD,sh-ECD和Hep-2细胞,测量肿瘤体积并检测脑,肝,肺组织的ECD表达和肿瘤转移情况。结果 临床资料显示,ECD的表达与喉癌患者的生存率有关（p<0.05）,ECD阴性的患者生存率明显低于阳性患者,但其与年龄,性别,淋巴结转移和TNM分期等临床病理特征无显着相关。体外研究中,ECD在sh-ECD细胞中下调,并显着降低Hep-2细胞的凋亡。体内研究中,Ad-ECD组肿瘤生长显着抑制。除肿瘤组织外,脑组织,肝组织和肺组织均未发现明显肿瘤细胞。结论 ECD在喉癌中的下调可能与浸润性肿瘤生长有关,导致预后不良。然而,ECD表达与肿瘤转移无明显相关性。目的 筛选并分析喉癌与癌旁正常组织之间的mRNA表达谱差异,为进一步研究上皮间质转化（EMT）相关基因与喉癌侵袭转移及预后的关系提供线索。方法 收集新鲜冰冻的喉癌组织和癌旁正常喉黏膜标本共6对,采用晶芯mRNA人V4.0表达谱芯片检测,以待检测样品的总RNA为起始,进行体外扩增和荧光标记,标记过程采用晶芯生物芯片通用标记试剂盒。使用Agilent Feature Extraction（vl0.7）软件对杂交图片进行分析并提取数据。然后使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析,计算基因表达差异和统计学显着性P值。当两组样本中mRNA表达差异倍数≥2,且p≤0.05时,定义为差异基因。结果 通过mRNA芯片筛选,我们得到了2253个差异表达的mRNA,其中1014个mRNA表达上调,1149个mRNA表达下调。采用KEGG PATHWAY、PID、Biocarta、Reactome、BioCyc、PANTHER、GO等数据库对差异表达的mRNA进行进一步生物信息学分析,发现与差异表达相关性最高的是细胞外基质相关的信号通路。对基因芯片中与EMT信号通路相关的基因LAMC2（laminin gamma 2）、P-cadherin、ZEB2（zinc finger E-box binding homeobox 2）、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin进行进一步分析,结果表明仅LAMC2、P-cadherin为差异基因。结论 1.基因芯片技术筛选喉癌特征性mRNA表达谱及EMT相关基因是可行的。2.LAMC2、P-cadherin有可能成为喉癌EMT相关的新的特征性分子标记物。目的 研究EMT相关分子标记物E-cadherin、N-cadherin、P-cadherin、β-catenin、LAMC2（laminin gamma 2）、ZEB2（zinc finger E-box binding homeobox 2）、在咽喉鳞状上皮癌及癌旁组织中的表达及其临床意义。方法 收集南京大学医学院附属鼓楼医院耳鼻咽喉头颈外科2007年3月至2013年11月住院治疗并有完整随访资料的原发喉和下咽鳞状细胞癌患者72例,采用免疫组化的方法检测72对咽喉癌及癌旁组织中对LAMC2、P-cadherin、ZEB2（zinc finger E-box binding homeobox 2）、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin的蛋白表达水平并分析其与临床病理因素和预后的关系。结果1.在咽喉癌及癌旁正常组织中LAMC2、P-cadherin、ZEB2、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。2.咽喉癌中LAMC2与T分期相关（P<0.05）;P-cadherin与各临床病理特征均无显着相关性;ZEB2与病理分期、淋巴结转移、分化程度相关（P<0.05）;E-cadherin与病理分期和淋巴结转移相关（P<0.05）;N-cadherin与T分期、病理分期、分化程度相关（P<0.05）;β-catenin与病理分期、淋巴结转移、分化程度相关（P<0.05）。3.单因素生存分析:LAMC2、P-cadherin与预后无相关性;但二者分别与ZEB2、E-cadherin、N-cadherin和β-catenin的联合表达情况与预后均有明显相关性（P<0.05）。4.单因素生存分析:ZEB2、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin的表达与预后相关（P<0.05）;采用COX回归多变量生存分析,病理分期、ZEB2、N-cadherin、β-catenin均可以作为咽喉癌的独立预后指标;结论 EMT相关蛋白在咽喉鳞状细胞癌和癌旁组织中差异表达。EMT介导肿瘤进展,降低咽喉癌的生存率。LAMC2、P-cadherin与其他因子的联合表达与预后有明显相关。病理分期、ZEB2、N-cadherin、β-catenin均可作为咽喉癌的独立预测因子。
陈静[7]（2017）在《循环肿瘤细胞上皮—间质转化表型检测及糖代谢特征分析》文中研究说明背景:肿瘤转移是恶性肿瘤预后不良和致死率升高的首要原因,也是临床肿瘤治疗面临的重大挑战。上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）是指在特定生理或病理条件下,上皮细胞失去原有的极性并转化为可在细胞外基质之间自由移动的间质细胞的现象,肿瘤细胞可通过EMT变得更具侵袭性从而促进肿瘤的转移。细胞代谢重编程（Metabolism Reprogramming）是肿瘤细胞的重要特征,表现为线粒体氧化呼吸障碍、高度依赖有氧糖酵解、磷酸戊糖途径和谷氨酰胺代谢增强。肿瘤细胞通过代谢重组摄入和消耗大量葡萄糖,以保障细胞生长和转移过程中能量消耗和大分子合成的需要。循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells,CTCs）是指来源于肿瘤原发灶或转移灶、因自发或诊疗因素释放到外周血液循环中的肿瘤细胞,CTCs可随血液系统播散至远处器官或组织并定植形成新的转移灶。外周血CTCs的水平与肿瘤患者的疾病进展和转移复发密切相关,CTCs计数和分子特征分析对于患者的临床分期辅助诊断、治疗反应性和预后判断、复发转移监测等方面有重要意义。因此,本研究主要旨在从EMT表型分型和细胞代谢功能状态方面对肿瘤患者外周血CTCs进行特征分析,研究内容包括循环肿瘤细胞EMT分型检测技术应用分析（第二章）、肿瘤转移相关的糖代谢差异基因筛选及验证（第三章）、外周血循环肿瘤细胞代谢特征分析及其临床意义（第四章）三部分（本文第一章为绪论）。方法:本研究主要采用了一种新型的Canpatrol（?）CTCs分型检测平台对肿瘤患者外周血CTCs进行分析。第二章研究中对南方医院2014年12月1日至2016年12月31日期间利用该方法进行CTCs分型检测的551例肿瘤患者血样结果进行总结分析,同时收集患者性别、年龄、肿瘤分期及肿瘤特异性血清标志物等临床病理特征资料,分析CTCs分型检测结果与这些参数的关联性。第三章中主要利用功能分类基因芯片技术比较高转移和低转移前列腺癌细胞株PC-3M 1E8和PC-3M 2B4中糖代谢基因表达谱的差异,并通过荧光定量PCR和Western blot技术同时检测芯片的差异表达基因在其他几种具有不同转移潜能的前列腺癌细胞（LNCAP、PC-3及DU145细胞）中的表达,以筛选肿瘤转移相关的糖代谢特征基因。第四章中利用Canpatrol（?）CTCs检测平台分别检测前期筛选验证的肿瘤转移相关糖代谢基因在肝细胞癌、肺癌、宫颈癌等肿瘤患者外周血CTCs中的表达情况,进一步从中选择高代谢型CTCs的联合检测标志物,用于前列腺癌和乳腺癌患者血液高代谢型CTCs表达特征的分析。结果:第二章研究中共分析了 551例肿瘤患者血样检测结果,主要包括肝细胞癌（195例）、鼻咽癌（38例）、肺癌（114例）、结直肠癌（74例）、骨肉瘤（35例）、肾癌（18例）和其他肿瘤（77例）。以CTCs≥3个/5mL外周血为CTCs阳性判断标准,各肿瘤CTCs阳性率为61%～80%（肝细胞癌75%、肺癌61%、鼻咽癌63%、结直肠癌68%、骨肉瘤80%、肾癌72%、其他肿瘤64%）,CTCs阳性患者的CTCs计数中位数范围为5～10个/5mL,分布范围为3～86个/5mL。此外,在380例CTCs阳性的样本中,检测到3种类型CTCs的例数分别为E型202例、H型338例和M型235例,其总体阳性率分别为E型53%、H型89%、M型62%。同时对肝细胞癌、鼻咽癌等患者CTCs的EMT分型与临床病理特征进行分析,发现外周血CTCs的数量及表达M型标志物CTCs的比例与患者的转移状态、临床分期和血清肿瘤标志物的水平相关。第三章研究中利用功能分类基因芯片筛选了 39个高转移细胞PC-3M 1E8和低转移细胞PC-3M 2B4的差异表达基因,经荧光定量PCR和Western blot验证和在LNCAP、PC-3、DU145三种细胞之间二次筛选,最终确定了 HK2（己糖激酶2）、PDP2（丙酮酸酶磷酸酶催化亚基2）、G6PD（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、PGK1（磷酸甘油酸激酶1）、PHKA1（磷酸酶激酶α1）、PYGL（糖原磷酸化酶）、PDK1（丙酮酸脱氢酶激酶1）、PKM2（M2型丙酮酸激酶）、ALDOA（果糖二磷酸醛缩酶A）和ENO1（烯醇化酶1）十个肿瘤转移相关的代谢特征基因,且它们与几种细胞中EMT相关标志物（Vimentin、β-catenin、N-cadherin）和肿瘤干细胞相关标志物（CD44、CD133、OCT4、ALDH1）的表达水平有一定的关联性。第四章研究中首先检测了上述肿瘤转移相关的代谢特征基因在64例肿瘤患者（包括10例肝细胞癌、21例宫颈癌、8例肺癌、8例鼻咽癌、9例食管癌、8例肾癌）外周血CTCs中的表达情况,结果发现在多种实体肿瘤患者血液中均检测到高表达上述代谢标志物的CTCs,总阳性率为16%至84%,且在不同EMT分型的CTCs中表达特点不一。它们在E型、H型和M型三种类型CTCs中的阳性率分布范围分别为0～100%（G6PD最高,为100%）、21%～96%（G6PD最高,为96%）和0～86%（PYGL最高,为86%）。其中,PGK1、PYGL和PDK1在M型CTCs中的阳性率高于在E型CTCs中的阳性率,且HK2、G6PD、PGK1和PYGL的阳性表达与CTCs的EMT分型关系密切（P<0.05）。进一步利用G6PD+PGK1联合检测CTCs的高代谢状态并初步分析前列腺癌和乳腺癌患者外周血CTCs的代谢特征,发现在伴发远处转移的前列腺癌和乳腺癌患者中,外周血CTCs计数水平高于无转移的患者,且M型CTCs的比例也相对升高。同时,转移性前列腺癌和乳腺癌患者外周血高代谢型（G6PD+PGK1 阳性）CTCs的阳性率在H和M型CTCs中较E型CTCs中高,且与前列腺癌患者的血清tPSA、fPSA水平及肿瘤Gleason评分存在一定的相关性,也与乳腺癌患者的血清CA153、CEA水平及肿瘤组织ki67表达水平存在一定的关联。结论:1.M型标志物在肝细胞癌、肺癌、鼻咽癌等肿瘤患者外周血的CTCs中的表达非常常见,同时检测这部分细胞可以提高CTCs的捕获率和检测准确性。表达M型标志物的CTCs比例升高与肿瘤患者的临床分期和转移相关,分析外周血CTCs的EMT表型特点有助于临床肿瘤患者病情和转移的辅助诊断。2.肿瘤转移相关的糖代谢特征标志物在肝细胞癌、肺癌、鼻咽癌等肿瘤的某些CTCs中呈高表达状态,且与CTCs的EMT表型分型特点相关,而高代谢型CTCs的比例与前列腺癌和乳腺癌患者的转移和血清肿瘤标志物水平存在一定的关系,因此分析CTCs的代谢功能状态可以为肿瘤患者疾病进展和转移监测提供有益信息。
崔诗允[8]（2014）在《肝细胞癌中Aurora-A基因过表达的转录后水平分子调控机制研究》文中提出一、背景与目的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是一种发病率和致死率都很高的恶性肿瘤,复发转移是影响肝细胞癌病人长期生存的根本原因。因此,深入研究肝细胞癌发生、发展和转移的分子机制,筛选预防和治疗肝细胞癌的关键靶点具有十分重要的理论意义和临床价值。Aurora-A是新近发现的丝氨酸/苏氨酸激酶家族的一个重要分子,通过控制中心体复制和分离参与有丝分裂过程的调控,在肝细胞癌等多种恶性肿瘤中均呈高表达状态。前期研究表明:Aurora-A基因的表达水平与肝细胞癌患者的临床分期、淋巴结转移及其预后密切相关,阻断其表达可在体内外有效抑制肝癌细胞增殖和诱导凋亡,显示了其作为肿瘤生物治疗靶点的潜在应用价值。MicroRNA （miRNA）是一类非编码小分子RNA,可在转录后水平上负向调控基因的表达,广泛影响不同的分子信号通路,参与对细胞生长、分化、凋亡及肿瘤生长和转移等过程的调控。本研究旨在探寻miRNA对人肝细胞癌中Aurora-A基因表达的调节作用,利用生物信息学方法和荧光素酶活性试验筛选并验证肝细胞癌中诱导Aurora-A基因过表达的关键microRNA分子,分析其在肝细胞癌组织和细胞中的表达水平及临床意义,并通过体内外实验探索其在肝细胞癌发生发展中的功能和分子机制,为进一步阐明和完善肝细胞癌中Aurora-A基因表达水平升高及其功能异常的分子调控机制,寻找肝细胞癌新的治疗靶点提供实验依据。二、材料、方法与结果第一部分肝细胞癌中负向调控Aurora-A基因表达的miRNA分子的筛选和鉴定方法:1.利用四个不同的miRNA 基因在线分析软件:①TargetScanHuman 6.0（http://www.targetscan.org）、 ② PicTar （http://pictar.mdc-berlin.de/）、 ③microRNA.org（http://www.microrna.org）和 ④ miRNA targets（http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer）,分析Aurora-A基因3’-末端非编码序列中所有潜在的miRNA结合位点,并将预测结果作交集分析。2.合成1中预测出来的60个miRNA的mimics,分别转染含有Aurora-A基因3’-UTR序列的HEK293T细胞,并进行荧光素酶活性测定,根据荧光素酶活性变化筛选能够与Aurora-A基因3’-UTR序列结合的miRNA。3.合成2中鉴定出来的8个miRNA的mimics,运用western blot技术验证它们对Aurora-A的调控作用。结果:1.通过生物信息学软件和交集分析可知,同时被3个及3个以上miRNA/靶基因数据在线分析软件预测到的miRNA共有60个。2.能使荧光强度显着下降的miRNA有8个,分别为let-7a,miR-124,miR-129-3p,miR-140-5p,miR-153-3p,miR-363-3p, miR-885-3p和miR-92a-3p。3.能靶向调控Aurora-A表达的miRNA共有6个,分别为miR-129-3p , miR-140-5p,miR-153-3p,miR-363-3p,miR-885-3p和miR-92a-3p。第二部分miR-129-3p在肝细胞癌中的表达及临床意义方法:1.选定miR-129-3p为研究对象,在转移能力不同的一系列人肝细胞癌细胞（HepG2、BEL-7402、HCCLM3和MHCC97-H）中运用实时定量RT-PCR检测miR-129-3p的表达水平。2.收集88例原发性肝细胞癌组织和对应的癌旁组织,从中选取20例,运用实时定量RT-PCR检测miR-129-3p表达水平,运用实时定量RT-PCR和western blot检测Aurora-A表达水平,并分析两者之间的关系。进一步在全部88例原发性肝细胞癌组织和对应癌旁组织中通过通过免疫组化染色分析Aurora-A的阳性率差异以及其与miR-129-3p表达水平的关系。3.在全部88例原发性肝细胞癌组织中结合临床信息分析miR-129-3p表达水平与临床病理特征和预后的关系。结果:1.在正常肝细胞株HH中,miR-129-3p的表达水平最高,低侵袭性肝癌细胞株HepG2和BEL-7402次之,高侵袭性肝癌细胞株HCCLM3和MHCC970-H中,miR-129-3p的表达水平最低（p<0.01）。2.与对应癌旁组织相比,20例肝细胞癌组织中Aurora-A的mRNA和蛋白表达水平,明显增高,而miR-129-3p表达水平却呈显着下降（p<0.01）; MiR-129-3p与Aurora-AmRNA的表达呈负相关（r =-0.221 ;p=0.0001）。与对应癌旁组织相比,88例肝细胞癌组织中Aurora-A的阳性率明显增高;弱阳性组中miR-129-3p的表达水平显着高于中度阳性或强阳性组（p<0.01 ）。提示肝细胞癌组织中Aurora-A的高表达与miR-129-3p的低表达显着相关。3.在肝细胞癌临床组织样本中,miR-129-3p的表达水平与患者TNM分期（p=0.001）、淋巴结转移（p=0.022）、血管侵袭（p=0.036）以及肿瘤复发（p=0.001）呈显着相关;采用Kaplan-Meier生存曲线分析发现,低miR-129-3p表达水平预示总生存期（p<0.001）和无病生存期（p<0.001）减少。第三部分miR-129-3p对肝细胞癌细胞生物学特性的影响方法:1.通过构建pri-miR-129-3p基因表达载体（pLMP/miR-129-3p）并稳定转染高侵袭性肝癌细胞（HCCLM3和MHCC97-H）,以及合成miR-129-3p单链抑制物（anti-miR-129-3p）并瞬时转染低侵袭性肝癌细胞（HepG2和BEL-7402）,人为改变细胞内miR-129-3p表达水平,运用划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞体外迁移和侵袭能力的差异。2.收集可稳定过表达miR-129-3p的HCCLM3和MHCC97-H细胞（HCCLM3/miR-129-3p和MHCC97H/miR-129-3p）,建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型,10周后处死动物后取肝脏和肺脏组织,HE染色鉴定并比较其与对照组（HCCLM3/miR-NC或MHCC97-H/miR-NC）的肝内转移和肺转移情况的差异;通过建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型并饲养至所有荷瘤鼠死亡,比较其与对照组荷瘤鼠总生存时间的差异。3.运用Western blot和免疫荧光实验检测miR-129-3p表达改变后肝癌细胞中EMT分子标志物表达差异。结果:1.在HCCLM3/miR-129-3p和MHCC97-H/miR-129-3p细胞中,细胞的体外迁移和侵袭能力与对照组（HCCLM3/miR-NC和MHCC97-H/miR-NC）相比明显下降（p<0.01）。相反,在HepG2和BEL-7402细胞中人为下调miR-129-3p表达水平,可促进细胞的体外迁移和侵袭能力（p<0.01）。2.由HCCLM3/miR-129-3p和MHCC97H/miR-129-3p细胞建立的裸鼠原位肝癌模型中,肝内转移和肺转移事件的发生率、肝内转移和肺转移结节的数目与对照组（HCCLM3/miR-NC或MHCC97-H/miR-NC）相比均明显减少,裸鼠的总生存时间增加,提示细胞的体内转移能力受到抑制（p<0.001）。3.在HCCLM3和MHCC97-H细胞中人为上调miR-129-3p表达水平后,细胞中上皮标志物（E-cadherin和β-catenin）表达上升,间质标志物（N-cadherin和Vimentin）表达下降。相反,在HepG2和BEL-7402细胞中人为下调miR-129-3p表达水平后,细胞中上皮标志物（E-cadherin和β-catenin）表达下降,间质标志物（N-cadherin和Vimentin）表达上升。提示miR-]29-3p的表达可影响HCC细胞的EMT过程。第四部分miR-129-3p调控肝细胞癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法:1.通过构建Aurora-A基因干扰质粒（pSil/shAurora-A）并稳定转染HCCLM3和MHCC97-H细胞,人为改变细胞内Aurora-A表达水平,运用划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力的差异;运用Western blot和免疫荧光实验检测细胞EMT分子标志物表达差异。2.收集可稳定干扰Aurora-A表达的HCCLM3和MHCC97-H细胞（HCCLM3/shAurora-A和MHCC97-H/shAurora-A）,建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型,10周后处死动物后取肝脏和肺脏组织,HE染色鉴定并比较其与对照组（HCCLM3/shcontrol或MHCC97-H/shcontrol）的肝内转移和肺转移情况的差异;通过建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型并饲养至所有荷瘤鼠死亡,比较其与对照组荷瘤鼠总生存时间的差异。3.合成Aurora-A基因真核表达载体（pMD-Auro）,与空质粒对照（pMD-NC）分别转染HCCLM3/miR-129-3p细胞,Western blot技术检测Aurora-A表达水平的变化。划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力的差异;Western blot和免疫荧光实验检测细胞EMT分子标志物表达差异。4.收集可稳定过表达 Aurora-A 的HCCLM3/miR-129-3p 细胞（HCCLM3/miR-129-3p/pMD-Auro）,建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型,10周后处死动物后取肝脏和肺脏组织,HE染色鉴定并比较其与对照组（HCCLM3/miR-129-3p/pMD-NC）的肝内转移和肺转移情况的差异;通过建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型并饲养至所有荷瘤鼠死亡,比较其与对照组荷瘤鼠总生存时间的差异。5. Western blot 检测 HCCLM3/miR-129-3p 和 HCCLM3/miR-NC 细胞以及HCCLM3/miR-129-3p/pMD-Auro细胞中 Aurora-A、磷酸化Akt （p-Akt）,磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）, 总Akt和总p38 MAPK,以及MMP-2酶原 （pro-MMP-2）和活化MMP-2（active-MMP-2）的表达。用选择性p38 MAPK抑制剂（SB202190）或Akt抑制剂（LY294002）分别处理转染了anti-miR-129-3p的HepG2细胞,western blot检测磷酸化Akt（p-Akt）,磷酸化p38 MAPK （p-p83 MAPK）,总Akt和总p38 MAPK的表达。6.用选择性p38 MAPK抑制剂（SB202190）或/和Akt抑制剂（LY294002）,单独或联合处理HCCLM3 和 MHCC97-H 细胞,以及转染了 anti-miR-129-3p 的 HepG2 和 BEL-7402细胞,再利用划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。7.用选择性p38 MAPK抑制剂（SB202190）和Akt抑制剂（LY294002）联合处理转染了anti-miR-129-3p的HepG2细胞,通过western blot检测细胞EMT分子标志物表达差异。结果1.与对照组相比,在HCCLM3/shAurora-A和MHCC97-H/shAurora-A细胞中,细胞的体外迁移和侵袭能力明显下降（p<0.05）;细胞中上皮分子标志物（E-cadherin和β-catenin）表达上升,间质分子标志物（N-cadherin和Vimentin）表达下降。提示阻断Aurora-A的表达可以模拟miR-129-3p对HCC细胞的体外生物学效应。2.由HCCLM3/shAurora-A和MHCC97-H/shAurora-A细胞建立的裸鼠原位肝癌模型中,肝内转移和肺转移事件的发生率、肝内转移和肺转移结节的数目与对照组（HCCLM3/shcontrol或MHCC97-H/shcontrol）相比均明显减少,裸鼠的总生存时间增加,提示阻断Aurora-A表达可模拟miR-129-3p遏制细胞体内转移能力的作用（p<0.001）。3.在HCCLM3/miR-129-3p细胞中人为上调Aurora-A表达水平后,可以部分逆转miR-129-3p抑制Aurora-A表达、削弱细胞迁移侵袭能力以及诱导细胞中上皮分子标志物（E-cadherin和β-catenin）表达上升、间质分子标志物（N-cadherin和Vimentin）表达下降的作用。4.由HCCLM3/miR-129-3p/pMD-Auro细胞建立的裸鼠原位肝癌模型中,肝内转移和肺转移事件的发生率、肝内和肺转移结节的数目与对照组（HCCLM3/miR-129-3p/pMD-NC）相比均明显减少,裸鼠的总生存时间增加,提示Aurora-A可部分逆转miR-129-3p抑制细胞体内转移能力的作用（p<0.001）。5.在HCCLM3/miR-129-3p细胞中,Aurora-A表达下降,Akt、p38 MAPK信号通路活化水平降低,MMP-2活化和表达下降;外源性过表达Aurora-A可部分逆转miR-129-3p对Aurora-A、Akt、p38 MAPK信号通路活化和MMP-2表达的抑制作用;在HepG2细胞中,分别抑制PI3K/Akt和p38 MAPK信号通路,可部分逆转anti-miR-129-3p所诱导的对PI3K/Akt和p38 MAPK信号通路活化作用。提示miR-129-3p通过靶向Aurora-A调控Akt和p38 MAPK信号通路的活化以及MMP-2的活化和表达。6.在HCCLM3和MHCC97-H细胞中单独或同时抑制PI3K/Akt和p38 MAPK信号通路,可抑制细胞的迁移和侵袭能力;在HepG2和BEL-7402细胞中单独或联合抑制Akt和p38 MAPK信号通路,可部分逆转anti-miR-129-3p促进细胞迁移和侵袭的作用。提示miR-129-3p对HCC细胞侵袭转移的作用可能是通过调控PI3K/Akt和p38 MAPK两条信号通路来实现的。7.在HepG2细胞中同时抑制P13K/Akt和p38MAPK信号通路,可以部分逆转anti-miR-129-3p诱导的EMT过程,提示miR-129-3p抑制HCC细胞EMT的作用可能是通过调控PI3K/Akt和p38 MAPK两条信号通路来实现的。三、结论与意义1. 6个miRNA: miR-129-3p、miR-140-5p、miR-153-3p、miR-363-3p、miR-885-3p、miR-92a-3p能与Aurora-A基因mRNA 3’-UTR直接结合并参与了对Aurora-A基因表达的调控。2. miR-129-3p在肝细胞癌组织中呈低表达,并与Aurora-A的表达呈负相关。Aurora-A的表达与肝细胞癌患者淋巴结转移相关;miR-129-3p表达水平与肝细胞癌患者淋巴结转移、血行转移、TNM分期、肿瘤复发情况以及临床预后相关。3. MiR-129-3p可在体内、外抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和转移能力,逆转EMT过程。4.通过靶向抑制Aurora-A,调控p38 MAPK和PI3K/Akt信号通路的活化以及MMP-2的表达,可能是miR-129-3p影响肝癌细胞迁移、侵袭、转移和EMT过程的分子机制之一。5.本研究首次筛选和鉴定了靶向调控Aurora-A基因的miRNA分子,并以miR-129-3p为重点研究对象,分析了miR-129-3p在肝细胞癌中的表达以及其与临床病理特征和预后的关系,验证了miR-129-3p对肝癌细胞迁移、侵袭、转移和EMT过程等生物学过程的影响,并探讨了 miR-129-3p在肝细胞癌中发挥作用的分子机制。本实验从转录后水平揭示了肝细胞癌中Aurora-A基因表达紊乱的原因,为肝细胞癌侵袭转移的预防和治疗提供了新的分子靶点和治疗策略。
谭媛[9]（2010）在《肿瘤转移相关基因S100A6、Rab5a在宫颈癌中的表达及其临床意义》文中提出目的淋巴结转移的诊断和处理是宫颈癌治疗过程中的关键影响因素,为了探讨宫颈鳞癌发生淋巴结转移的相关机制,我们选取了肿瘤转移相关基因Rab5a,从mRNA水平和蛋白质水平检测其在宫颈良性病变组（子宫肌瘤全宫切患者）、宫颈癌未合并淋巴结转移组（鳞癌I。到Ⅱb期可手术者）、宫颈癌合并淋巴结转移组（鳞癌Ⅰ。到Ⅱb期可手术者）患者宫颈组织中的表达情况,分析S100A6和Rab5a与宫颈鳞癌的关系及其临床意义。方法本研究分为三组,A组（对照组）：宫颈良性病变组（子宫肌瘤全宫切患者）；B组：宫颈癌未合并淋巴结转移组（鳞癌Ⅰa到Ⅱb期可手术者）；C组：宫颈癌合并淋巴结转移组（鳞癌Ⅰ。到Ⅱb期可手术者）。1、用Trizol一步法提取三组宫颈组织总RNA,后逆转录为cDNA;2、设计S100A6和Rab5a特异性片段的引物,经PCR、扩增、纯化、回收等一系列步骤,将特异性片段与DH-5a载体连接,构建S100A6和Rab5a特异性片段质粒；3、实时荧光定量PCR技术检测三组宫颈组织中的S100A6和Rab5a mRNA的表达量；4、应用免疫组织化学技术检测三组宫颈组织中S100A6和Rab5a蛋白的表达情况,C组同时检测该两种蛋白在宫颈鳞癌原发肿瘤和转移淋巴结中的表达情况；5、记录并整理数据,用SPSS 13.0软件分析实验结果。结果1、成功提取宫颈组织总RNA,1%琼脂糖电泳清晰可见RNA的28S、18S和5S带型。Takara公司逆转录试剂盒,成功将RNA逆转录为cDNA,结果可以观察到清楚明亮的DNA条带；2、通过特异性序列比对及测序,证实成功构建了S100A6特异性片段质粒；3、通过特异性序列比对及测序,证实成功构建了Rab5a特异性片段质粒；4、应用实时荧光定量PCR技术检测三组宫颈组织中S100A6 mRNA的表达情况。A组13例,阳性表达10例,阳性率为76.9%；B组25例,阳性表达22例,阳性率为88%；C组25例,阳性表达23例,阳性率为92%。阳性率三组之间没有显着性差异（P>0.05）,但就mRNA表达量比较,三组之间有显着性差异（P<0.05）；5、应用实时荧光定量PCR技术检测三组宫颈组织中Rab5a mRNA的表达情况。A组13例,阳性表达11例,阳性率为84.6%；B组25例,阳性表达22例,阳性率为88%；C组25例,阳性表达23例,阳性率为92%。阳性率三组之间没有显着性差异（P>0.05）,但就mRNA表达量比较,三组之间有显着性差异（P<0.05）；6、应用免疫组织化学技术检测三组宫颈组织中S100A6蛋白的表达情况,A组10例,阳性表达1例,阳性率为10%；B组30例,阳性表达7例,阳性率为23.3%；C组30例,原发肿瘤阳性表达16例,阳性率为53.3%,转移淋巴结阳性表达11例,阳性率为36.7%。C组中原发肿瘤与转移淋巴结阳性率没有显着性差异（P>0.05）,A组与B组阳性率没有显着性差异（P>0.05）,但A组与C组、B组与C组阳性率有显着性差异（P<0.05）；7、应用免疫组织化学技术检测三组宫颈组织中Rab5a蛋白的表达情况,A组10例,阳性表达0例,阳性率为0%；B组30例,阳性表达4例,阳性率为13.3%；C组30例，原发肿瘤阳性表达11例,阳性率为36.7%,转移淋巴结阳性表达1例,阳性率为3.3%。C组中原发肿瘤与转移淋巴结阳性率有显着性差异（P<0.05）,A组与B组阳性率没有显着性差异（P>0.05）,但A组与C组、B组与C组阳性率有显着性差异（P<0.05）。结论1、S100A6 mRNA的表达量随宫颈病变程度加重而上调,并且与宫颈鳞癌浸润及淋巴结转移呈正相关；2、Rab5a mRNA的表达量上调与宫颈鳞癌的发生发展、浸润及淋巴结转移呈正相关；3、S100A6蛋白在宫颈鳞癌组织表达明显升高,与宫颈病变恶性程度提高、宫颈鳞癌淋巴结转移呈正相关；4、Rab5a蛋白在宫颈组织中的表达与宫颈鳞癌的形成及浸润转移呈正相关；5、S100A6和Rab5a两个基因与宫颈鳞癌发生发展及转移密切相关,可以作为评估宫颈鳞癌浸润、转移及预后的指标之一。6、S100A6和Rab5a两个蛋白的表达与宫颈病变恶性程度提高、宫颈鳞癌淋巴结转移呈正相关,可以作为评估宫颈鳞癌浸润、转移及预后的指标之一。
付员根,黄致治,梁英锐,郑少燕,申延琴[10]（1997）在《肝细胞癌细胞外基质的分布形式及其临床意义》文中进行了进一步梳理目的：了解细胞外基质在肝细胞癌的分布形式，探讨其与肝细胞癌恶性程度的关系。方法：用５种细胞外基质抗体对４０例肝细胞癌作免疫组化染色。结果：显示４种分布形式：连续梁周腺泡周型、断续梁周腺泡周型、血管间质型、胞膜胞浆型。前３型与肿瘤生长方式、细胞分化和增殖程度密切相关。结论：提示细胞外基质在评价肝细胞癌的恶性程度是有用的标志物。
二、DISTRIBUTION PATTERNS OF EXTRACELLULAR MATRICES IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA AND THEIR CLINICAL SIGNIFICANCE（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DISTRIBUTION PATTERNS OF EXTRACELLULAR MATRICES IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA AND THEIR CLINICAL SIGNIFICANCE（论文提纲范文）
（1）核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 肝门部胆管细胞癌病理特征与核糖体蛋白表达分析及其临床意义 |
| 一、肝门部胆管细胞癌的临床病理学分析 |
| 二、核糖体蛋白家族成员在肝门部胆管癌中的表达谱系 |
| 三、RPL34在肝门部胆管癌中的表达及其临床意义 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 核糖体蛋白RPL34对肝门部胆管癌细胞侵袭生长的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果分析 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 核糖体蛋白RPL34促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用机制 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果分析 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 肝门部胆管癌发生发展的分子生物学基础进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（2）LncRNA BZRAP1-AS1介导THBS1甲基化在肝细胞癌血管生成中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分LncRNA BZRAP1-AS1在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 LncRNA BZRAP1-AS1在肝癌组织中表达的临床意义 |
| 2.2 LncRNA BZRAP1-AS1在肝细胞癌细胞内的定位 |
| 2.3 LncRNA BZRAP1-AS1基因在肝细胞癌组织中高表达 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第二部分 LncRNA BZRAP1-AS1、DNMT3b、THBS1的相互作用关系 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 LncRNA BZRAP1-AS1与肝细胞癌的血管生成的关系 |
| 2.2 LncRNA BZRAP1-AS1与DNMT3b、THBS1之间的作用关系 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三部分 LncRNA BZRAP1-AS1在体内对肝细胞癌进展的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 LncRNA BZRAP1-AS1、DNMT、THBS1在肝细胞癌细胞系中的作用 |
| 2.2 LncRNA BZRAP1-AS1在体内促进肝细胞癌血管生成 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述: BZRAP1-AS1在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）CBX7通过ITGβ3/TGFβ1/AKT信号通路在宫颈癌进展中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 CBX7及ITGβ3/TGFβ1 信号通路相关基因在宫颈癌中的表达及其临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 CBX7 在宫颈癌生物学行为中的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞系的选取 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 裸鼠来源和饲养 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 CBX7 调控宫颈癌生物学行为的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞系的选取 |
| 1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 创新点与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 CBX在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（4）THBS2在肝细胞癌表达的临床意义及其生物学功能的初探（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 高通量蛋白质芯片筛选肝癌根治术后复发转移的潜在标志物:THBS2 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 THBS2在恶性肿瘤的表达对患者预后判断价值的meta分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 THBS2表达与肝细胞癌患者临床病理特征及预后的相关性 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 在体外细胞水平研究THBS2过表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭生物学行为的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的学术论文 |
（5）原发性肝细胞癌组织分泌蛋白质组的定量蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 附录 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第1部分 肝癌组织的体外无血清培养体系的构建 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第2部分 肝癌组织分泌蛋白的定量蛋白质组学研究 |
| 第一章 蛋白质组学方法筛选肝癌特异标志物 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 差异蛋白的生物信息学分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第3部分 肝癌预警蛋白的验证及临床意义分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 蛋白质组学在肝细胞肝癌研究领域的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）上皮间质转化（EMT）相关分子标记物在咽喉鳞状细胞癌中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 上皮钙黏蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及在预后中的价值 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 利用基因芯片技术检测喉癌及癌旁组织中mRNA的差异表达 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 上皮间质转化相关分子标记物在咽喉鳞状上皮癌中的表达及其临床意义 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 主要缩略词中英文对照(按字母排序) |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）循环肿瘤细胞上皮—间质转化表型检测及糖代谢特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 循环肿瘤细胞与肿瘤恶性转移 |
| 1.2 循环肿瘤细胞检测技术 |
| 1.3 循环肿瘤细胞检测的临床应用 |
| 第二章 循环肿瘤细胞EMT分型检测技术应用分析 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 肿瘤转移相关的糖代谢差异基因筛选及验证 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 外周血循环肿瘤细胞代谢特征分析及其临床意义 |
| 4.1 研究对象 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 在读期间已发表和待发表论文 |
| 致谢 |
（8）肝细胞癌中Aurora-A基因过表达的转录后水平分子调控机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 肝细胞癌中负向调控Aurora-A基因表达的miRNA分子的筛选和鉴定 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验试剂与设备 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 MiR-129-3p在肝细胞癌中的表达及临床意义 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验试剂与设备 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 MiR-129-3p对肝细胞癌细胞生物学特性的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验试剂和设备 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 MiR-129-3p调控肝细胞癌细胞迁移侵袭的分子机制研究 |
| —、 实验材料 |
| 二、实验试剂和设备 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 文献综述 Aurora-A激酶：肿瘤治疗的新靶点 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（9）肿瘤转移相关基因S100A6、Rab5a在宫颈癌中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 宫颈癌淋巴结转移的临床研究进展 |
| 1. 概述 |
| 2. 淋巴结转移是宫颈癌的一个影响因素 |
| 3. 淋巴系统的生理与解剖 |
| 4. 宫颈癌淋巴结转移的解剖学途径 |
| 5. 宫颈癌转移细胞特性的基础研究 |
| 5.1 肿瘤细胞的运动性 |
| 5.2 肿瘤细胞的粘连性 |
| 5.3 肿瘤细胞的增殖性 |
| 6. 宫颈癌的淋巴结转移过程和分子机理 |
| 6.1 宫颈癌淋巴结转移过程 |
| 6.2 癌细胞进入淋巴结后的情况和淋巴结的反应 |
| 6.3 宫颈癌细胞淋巴结转移的生物学特性 |
| 6.4 恶性肿瘤浸润转移的主要步骤 |
| 6.4.1 原发恶性肿瘤的浸润 |
| 6.4.1.1 细胞转化的和肿瘤细胞的增殖 |
| 6.4.1.2 肿瘤细胞的分离 |
| 6.4.1.3 粘附并破坏细胞外基质和基底膜 |
| 6.4.1.4 肿瘤细胞运动 |
| 6.4.2 恶性肿瘤细胞的迁移 |
| 6.4.2.1 恶性肿瘤细胞粘附到脉管基底膜 |
| 6.4.2.2 穿过脉管壁进入循环系统 |
| 6.4.3 恶性肿瘤细胞的转移 |
| 6.4.3.1 肿瘤细胞逃脱免疫监视在循环系统中生长 |
| 6.4.3.2 肿瘤细胞锚定粘附并破坏脉管壁 |
| 6.4.3.3 转移灶的形成 |
| 6.4.3.4 转移的休眠 |
| 6.4.3.5 肿瘤细胞转移的器官选择性 |
| 6.5 宫颈癌淋巴结转移的分子机理 |
| 7. 肿瘤相关基因 |
| 7.1 肿瘤转移基因(tumer metastatic genes) |
| 7.1.1 MTA1基因 |
| 7.1.2 ras基因 |
| 7.1.3 c met癌基因 |
| 7.1.4 ezrin蛋白 |
| 7.1.5 缺氧诱导因子1(HIF 1) |
| 7.1.6 S100A6基因(详见后述) |
| 7.1.7 Rab5a基因(详见后述) |
| 7.2 肿瘤转移抑制基因 |
| 7.2.1 nm23基因 |
| 7.2.2 MHC基因 |
| 7.2.3 KAI1基因 |
| 7.2.4 CDH1基因 |
| 8. 黏附因子与恶性肿瘤的浸润转移 |
| 8.1 层粘连蛋白 |
| 8.2 钙粘蛋白家族(cadherins) |
| 8.3 整合素(integrins) |
| 8.4 免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily) |
| 8.5 选择素(selectins)家族 |
| 8.6 CD44 |
| 9. 血管的生成与肿瘤的浸润转移 |
| 9.1 血管内皮细胞生长因子(VEGF) |
| 9.2 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) |
| 10. 蛋白溶解酶与恶性肿瘤浸润转移 |
| 10.1 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs) |
| 10.2 纤维蛋白溶解酶及其调节因子 |
| 10.3 组织蛋白酶(cathepsins) |
| 10.3.1 组织蛋白酶D(Cathepsin D,CD) |
| 10.3.2 组织蛋白酶B(Cathepsin B,CB) |
| 10.3.3 组织蛋白酶L(Cathepsin L,CL) |
| 11. 宫颈癌淋巴结转移的诊断 |
| 11.1 超声对转移性淋巴结的诊断价值 |
| 11.2 CT对转移性淋巴结的诊断价值 |
| 11.3 MRI对转移性淋巴结的诊断价值 |
| 11.4 PET对转移性淋巴结的诊断价值 |
| 11.5 淋巴造影对转移性淋巴结的诊断价值 |
| 11.6 放射性免疫显像(radioimmunoimaging,R Ⅱ) |
| 11.7 免疫组化 |
| 11.8 选择性淋巴结活检及系统性淋巴结清除手术 |
| 12. 宫颈癌的治疗 |
| 12.1 手术治疗 |
| 12.1.1 手术适应证 |
| 12.1.2 手术禁忌证 |
| 12.1.3 手术类型 |
| 12.2 放疗 |
| 12.3 化疗 |
| 12.4 淋巴化疗 |
| 12.5 免疫治疗 |
| 12.6 生物治疗 |
| 12.7 基因治疗 |
| 第二章 肿瘤转移相关基因S100A6和RAB5A研究进展 |
| 1. 概述 |
| 2. Rab5a基因的研究进展 |
| 3. S100A6基因研究进展 |
| 4. 主要研究内容及拟解决的问题 |
| 第三章 荧光定量PCR研究宫颈癌S100A6和Rab5a mRNA表达情况 |
| 1. 目的 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 PCR原理和背景 |
| 2.2 宫颈组织来源 |
| 2.3 主要试剂和配制 |
| 2.3.1 主要试剂 |
| 2.3.2 主要试剂的配制 |
| 2.4 实验主要仪器设备 |
| 2.5 用具处理 |
| 3. 实验步骤和方法 |
| 3.1 不同病变分组的宫颈组织总RNA的提取 |
| 3.1.1 原理 |
| 3.1.2 实验步骤 |
| 3.1.3 总RNA的定量及纯度测定 |
| 3.2 cDNA合成 |
| 3.3 引物的设计 |
| 3.4 质粒的构建 |
| 3.4.1 Real-time PCR |
| 3.4.2 DNA测序 |
| 3.4.3 PCR产物的纯化与回收 |
| 3.4.4 测序所得序列在Internet上使用NCBI服务器进行分析比对 |
| 3.4.5 感受态大肠杆菌DH-5α的制备 |
| 3.4.6 目的基因与载体的连接 |
| 3.4.7 产物转化至感受态DH-5a |
| 3.4.8 质粒DNA的快速提取 |
| 3.5 荧光定量PCR |
| 3.6 统计学方法 |
| 4. 结果 |
| 4.1 总RNA的定量及纯度测定 |
| 4.2 扩增S100A6、Rab5a基因,琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况 |
| 4.3 荧光定量PCR检测宫颈标本中S100A6和Rab5a mRNA的表达量 |
| 4.4 PCR产物比对和所构建质粒的测序结果 |
| 4.5 荧光定量PCR检测宫颈组织中S100A6 mRNA的表达阳性率 |
| 4.6 荧光定量PCR检测宫颈组织中的Rab5a mRNA的表达阳性率 |
| 4.7 荧光定量PCR检测宫颈组织中的S100A6 mRNA的表达量 |
| 4.8 荧光定量PCR技术检测宫颈组织中的Rab5a mRNA的表达量 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 第四章 免疫组化技术对宫颈癌S100A6和Rab5a蛋白检验并比较 |
| 1. 目的 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 原理 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 主要试剂和设备 |
| 2.4 Super PicTure法(一步法)免疫组化染色步骤 |
| 3. 结果判定 |
| 4. 结果 |
| 4.1 组织免疫组化结果 |
| 4.2 应用免疫组化检测标本组织中S100A6蛋白的表达情况 |
| 4.3 应用免疫组化检测标本组织中Rab5a蛋白的表达情况 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、DISTRIBUTION PATTERNS OF EXTRACELLULAR MATRICES IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA AND THEIR CLINICAL SIGNIFICANCE（论文参考文献）
- [1]核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究[D]. 钱建新. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [2]LncRNA BZRAP1-AS1介导THBS1甲基化在肝细胞癌血管生成中的机制研究[D]. 王维伟. 郑州大学, 2020(02)
- [3]CBX7通过ITGβ3/TGFβ1/AKT信号通路在宫颈癌进展中的作用机制研究[D]. 田萍. 新疆医科大学, 2020
- [4]THBS2在肝细胞癌表达的临床意义及其生物学功能的初探[D]. 廖小莉. 广西医科大学, 2019(08)
- [5]原发性肝细胞癌组织分泌蛋白质组的定量蛋白质组学研究[D]. 陈辉. 福建医科大学, 2017(04)
- [6]上皮间质转化（EMT）相关分子标记物在咽喉鳞状细胞癌中的表达及其临床意义[D]. 钱晓云. 南京医科大学, 2017(05)
- [7]循环肿瘤细胞上皮—间质转化表型检测及糖代谢特征分析[D]. 陈静. 南方医科大学, 2017(01)
- [8]肝细胞癌中Aurora-A基因过表达的转录后水平分子调控机制研究[D]. 崔诗允. 南京大学, 2014(01)
- [9]肿瘤转移相关基因S100A6、Rab5a在宫颈癌中的表达及其临床意义[D]. 谭媛. 广西医科大学, 2010(10)
- [10]肝细胞癌细胞外基质的分布形式及其临床意义[J]. 付员根,黄致治,梁英锐,郑少燕,申延琴. 临床与实验病理学杂志, 1997(03)