一、Can apoptosis analysis of cumulus granulosal cell evaluatethe potential vitality of replaced embryo?（论文文献综述）
段家昕[1]（2021）在《雌激素对猪卵母细胞自噬的作用及调控》文中研究表明卵母细胞在减数分裂过程中需要不断积累所需营养物质为成熟及胚胎发育作准备。雌激素作为一种重要的生殖激素,在卵母细胞成熟发育过程中起到不可替代的作用。已有证据表明,自噬（Autophagy）作为一种细胞生存机制,在体细胞及颗粒细胞的氧化应激、细胞凋亡及衰老等方面具有重要作用,而有关自噬与卵母细胞发育的研究较少,在此过程中雌激素与自噬之间的联系更是不明确。基于此,本研究利用小分子抑制剂、免疫组织化学、细胞免疫荧光和Western blot等技术与方法,解析自噬在雌激素调控下对卵母细胞成熟和胚胎发育的作用;揭示雌激素对卵母细胞自噬的影响;明确雌激素介导的自噬对成熟卵母细胞氧化应激和早期凋亡的机制;掌握雌激素参与自噬调控的细胞间隙连接通讯的作用途径;探究雌激素受体对自噬的分子途径。以期系统阐明雌激素与自噬对卵母细胞成熟发育的联合调控作用机制,为提高猪卵母细胞质量、增加成熟卵母细胞的胚胎发育能力提供科学依据。本研究获得的主要结果和结论如下:1.在卵母细胞体外成熟过程中添加0.1μM和1μM的17β-雌二醇,成熟率均显着提高（P<0.05）,并且在1μM的17β-雌二醇处理下,成熟率以时间依赖性的方式逐渐上升;自噬主要在猪卵母细胞、卵丘细胞和颗粒细胞中发生;在用自噬抑制剂Autophinib对自噬抑制的过程中,卵母细胞成熟率以剂量依赖的方式下降,通过添加17β-雌二醇可以缓解成熟率下降的趋势;用Autophinib抑制自噬的过程中,卵母细胞的卵裂率也以Autophinib的剂量依赖的方式下降,通过添加17β-雌二醇可以缓解卵裂率以及囊胚率下降的趋势（P<0.05）。这些结果表明,雌激素可以介导自噬参与的卵母细胞成熟以及胚胎发育。2.17β-雌二醇处理后的MII期卵母细胞中,自噬降解蛋白SQSTM1的表达低于空白对照（P<0.05）;在卵母细胞体外成熟早期,17β-雌二醇可以提高自噬标志蛋白LC3-II的表达（P<0.05）,并使SQSTM1的表达处于较低的水平,这些结果表明雌激素促进卵母细胞自噬的发生;用自噬抑制剂Autophinib处理成熟卵母细胞后,LC3-II蛋白的表达以剂量依赖的方式下降,证明Autophinib可以有效抑制猪卵母细胞的自噬;在猪卵母细胞中,17β-雌二醇可以显着提高Autophinib抑制的自噬（P<0.05）。这些发现证明了雌激素参与卵母细胞成熟过程中的自噬反应。3.自噬的抑制导致成熟卵母细胞出现更高ROS水平（P<0.01）和异常线粒体分布（P<0.05）,17β-雌二醇的处理与自噬抑制剂Autophinib处理相比,不仅ROS的水平较低（P<0.01）,而且线粒体的分布更加均匀（P<0.01）,在17β-雌二醇加入自噬抑制剂Autophinib组处理后,可以显着降低ROS的水平（P<0.05）,并且可以修复线粒体的异常分布（P<0.05）。17β-雌二醇处理的成熟卵母细胞内游离Ca2+的含量较低,而自噬抑制剂Autophinib处理后没有显着变化,当共同处理后的Ca2+的含量显着上升（P<0.05）。这些证据说明成熟卵母细胞中雌激素可以降低由自噬抑制导致的氧化应激作用,这一作用可能依赖于上调线粒体的正常分布和Ca2+的含量。通过早期细胞凋亡分析发现,抑制自噬增加了成熟卵母细胞的凋亡率（P<0.01）,这个作用可以被17β-雌二醇显着下调（P<0.05）;伴随着自噬的抑制,成熟卵母细胞中线粒体的功能发生障碍（P<0.01）,而17β-雌二醇具有线粒体功能修复的作用,可以显着改善由自噬抑制导致的线粒体功能障碍;进一步研究揭示,自噬抑制导致的凋亡率上升可能是通过激活caspase-8进而增加caspase-3的裂解所导致（P<0.05）,而17β-雌二醇虽然也可以激活caspase-8（P<0.05）,但对caspase-3的裂解能力显着抑制（P<0.05）,从而进一步降低由自噬抑制介导的caspase-3活性（P<0.05）。这些结果证明17β-雌二醇通过介导凋亡相关蛋白和修复线粒体功能紊乱,从而降低自噬抑制引起的卵母细胞的凋亡。4.在猪卵母细胞成熟过程中,卵丘-卵母细胞的间隙连接细胞通讯（gap junctional intercellular communication,GJICs）以时间依赖的方式降低。17β-雌二醇在体外成熟早期可以显着降低间隙连接通讯（P<0.05）,而自噬的抑制可以显着提高间隙连接（P<0.01）,此外,17β-雌二醇可以下调自噬抑制介导的间隙连接（P<0.05）;通过分析卵丘-卵母细胞亚细胞结构,发现结果与间隙连接一致,即抑制自噬可以显着提高跨带突触（Transzonal projections,TZPs）的数量（P<0.01）,这一过程被17β-雌二醇下调（P<0.05）。进一步研究发现,17β-雌二醇不仅下调连接蛋白Cx43的磷酸化水平（P<0.05）,同时也可以降低自噬抑制导致的Cx43磷酸化修饰（P<0.05）。这些结果说明雌激素下调自噬抑制的猪卵丘-卵母细胞间隙连接通讯可能依赖于下调Cx43的磷酸化修饰。5.GPR30是雌激素位于质膜上的新型受体,在猪卵母细胞体外成熟期间以时间依赖的方式下降,而17β-雌二醇可以保持GPR30在体外成熟过程中的高表达。使用G15（GPR30特异性抑制剂）处理后,完全消除了17β-雌二醇对核成熟的促进作用（P<0.05）。GPR30的失活可以下调17β-雌二醇对MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平（P<0.05）,这表明GPR30通过MEK/ERK通路对猪卵母细胞进行调控。进一步分析显示,MEK1/2和ERK1/2的失活可以促进SQSTM1的表达（P<0.05）,并且通过降低LC3-II的水平来抑制自噬（P<0.05）。这些结果揭示了由17β-雌二醇诱导的GPR30通过MEK/ERK信号通路促进自噬的发生,从而促进猪卵母细胞成熟。综上所述,17β-雌二醇与猪卵母细胞自噬的发生密切相关,17β-雌二醇可以促进猪卵母细胞的自噬,添加适当浓度可以提高卵母细胞成熟和早期胚胎的发育能力,降低由自噬抑制剂Autophinib导致的ROS水平升高和早期凋亡的发生,并且下调猪卵母细胞成熟早期的间隙连接细胞通讯。17β-雌二醇对猪卵母细胞自噬的促进作用可能是通过GPR30/MEK/ERK途径进行,从而促进了卵母细胞的成熟。这些发现可以为猪卵泡闭锁调控机理研究提供新的理论依据。
刘清华[2]（2021）在《排卵信号靶基因的分类分析与功能验证》文中研究说明排卵是指成熟卵泡在促性腺激素刺激下释放具备受精能力的卵母细胞过程。这个过程涉及卵泡中各类细胞的精准互动与命运决定。颗粒细胞（Granulosa cells,GCs）是唯一能识别并响应排卵LH（或HCG）信号的。因此,对LH峰刺激下GCs内基因的分类分析与深入解读是理解排卵的关键。本研究利用RNA-seq、Q-PCR、Western blot、基因敲低、基因敲除等实验手段,在细胞和个体水平,对LH排卵信号调控的基因进行趋势和分类分析,筛选、鉴定了可能参与排卵的基因,并挑选了基因进行功能验证,得到的主要结果如下:（1）首先通过转录组测序技术从基因层面分别筛选出7104和347个可能参与排卵活动的mRNA和长链非编码RNA（Long noncoding RNA,LncRNA）,并根据基因表达划分为激活、抑制和短暂激活3种基因表达模式,并在3种模式中鉴定并列出了可能参与排卵的54个分泌蛋白、62个转录因子、22个阶段性表达特征基因、10个排卵过程功能未知基因、16个LncRNA-靶基因顺式对组合和41个高表达LncRNA;（2）其次以LncRNA Gm12840与Gm20186为基因代表在细胞水平进行了功能研究:结果显示分别敲低Gm12840/20186不仅抑制了颗粒细胞增殖和激素合成,还诱导了细胞凋亡;（3）再次又进一步在在小鼠个体水平研究了LncRNA Gm12840的功能。通过CRISPR/CAS9技术构建了Gm12840-/-鼠:结果分析发现敲除Gm12840显着提高了小鼠有腔卵泡和排卵的数量,同时显着抑制了凋亡卵泡和排卵后未排出的有腔卵泡的数量;敲除Gm12840显着提高了小鼠2-3月龄的产仔数,但也显着抑制了7-9月龄的产仔数;同时敲除Gm12840也显着抑制了11月龄鼠卵巢内生长卵泡的数量。（4）最后对野生型与Gm12840-/-鼠GCs进行转录组测序分析发现,有349个基因差异表达,KEGG富集分析与WB结果显示敲除Gm12840增强了mTOR与MAPK信号。上述结果筛选、鉴定出了在排卵过程中具有潜在研究价值的基因,并以LncRNA Gm12840为例在细胞和个体水平进行了功能验证,为进一步揭示排卵过程提供了借鉴。
严正杰[3]（2021）在《姜黄素延缓卵巢早衰的作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理卵巢储备减退（Diminished ovarian reserve,DOR）约占不孕妇女的10%,其中卵巢早衰（Premature ovarian failure,POF）在育龄妇女中发生率为1-2.8%,大多数DOR患者因不孕在生殖中心就诊。POF与卵巢活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）的急剧增加有关,ROS介导的卵巢氧化应激,影响卵泡发育、卵子成熟和排卵,降低卵母细胞质量和胚胎发育潜能,不仅大大降低自然妊娠率、导致不孕,而且降低辅助生殖的卵母细胞成熟率、受精率、囊胚形成和种植率、妊娠率和活产率,影响辅助生殖的临床结局。因此,POF妇女的生育力低下问题,已经成为临床生殖医学的热点和难点,迫切需要对其发生的分子机制、干预方案和助孕策略进行深入研究。姜黄素（Curcumin,Cur）是姜黄根茎的活性成分,研究表明姜黄素能通过多种途径抑制细胞内氧化应激状态,因此改善疾病的病理状态,产生良好的疗效。卵巢早衰和卵巢ROS急剧增加有关,卵巢微环境的氧化应激是POF的病理生理机制。那么,姜黄素是否通过抗氧化应激的机制发挥卵巢保护作用,并因此延缓POF发生发展?目前,姜黄素对卵巢早衰的作用及其机制尚未见研究报道。在本研究中,我们通过建立D-半乳糖（D-Galactose,D-gal）诱导的POF小鼠模型,观察姜黄素的卵巢保护、延缓卵巢早衰的作用;通过体外培养卵巢颗粒细胞以H2O2诱导的氧化应激模型,探讨姜黄素抗氧化应激机制及其信号通路。本研究阐明姜黄素的卵巢保护和延缓卵巢早衰的作用及其分子机制,拓展了天然抗氧化剂姜黄素的应用,为辅助生殖技术卵母细胞培养的体外应用提供理论依据,也为临床卵巢早衰的治疗应用奠定基础。本研究分为三部分:一、本实验通过对C57BL/6小鼠进行42天注射D-gal的方式建立D-gal造模组,通过对D-gal造模小鼠进行42天注射姜黄素（100mg/kg/day）的方式建立姜黄素治疗组,对照组为未进行D-gal干预或姜黄素干预的普通小鼠组。实验发现D-gal造模组与对照组相比,血清FSH、LH水平显着增加（P<0.05和P<0.01）,血清E2、P水平显着降低（P<0.01）,卵巢AMH mRNA表达量显着降低（P<0.05）,实验证明注射D-gal可以建立POF小鼠模型。姜黄素治疗组在卵泡成熟发育不同阶段的卵泡数量均高于D-gal造模组。与D-gal造模组相比,姜黄素可以显着降低TUNEL阳性细胞数量（P<0.01）。进一步研究姜黄素对卵巢相关信号通路的影响,发现D-gal造模组p-Akt水平明显低于对照组（P<0.01）,姜黄素治疗组显着高于D-gal造模组（P<0.01）,caspase-3和caspase-9水平明显低于D-gal组（P<0.01）。此外,D-gal造模组的Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显低于对照组（P<0.01）,而姜黄素治疗组的Nrf2和HO-1表达水平显着高于D-gal造模组组（分别P<0.05和P<0.01）。由此可以证明姜黄素部分通过激活PI3K/Akt和Nrf2/HO-1途径减轻D-gal诱导的卵巢氧化应激损伤。二、氧化应激与颗粒细胞的凋亡密切相关,氧化应激引起的颗粒细胞凋亡是卵子质量下降的重要原因之一,本实验利用小鼠卵巢颗粒细胞探讨姜黄素对卵巢颗粒细胞的氧化应激的影响。实验分为模型组（H2O2）、干预组（H2O2+Cur）、Nrf2抑制剂组（H2O2+Cur+ML385）和正常对照组（DMSO）,其中H2O2浓度为400yM,Cur浓度为10μM,ML385浓度为5μμM。实验发现与DMSO组比较,H2O2组的细胞总死亡率显着增高（P<0.01）,与H2O2组比较,H2O2+Cur组的细胞总凋亡率则显着降低;而同时加入姜黄素和Nrf2抑制剂（ML385）则显着抑制姜黄素的抗凋亡效果。H2O2组NRF2、HO-1和NQO-1蛋白表达水平明显低于DMSO 组（P<0.01）,Cleaved caspase-3 和 Cleaved caspase-9 水平显着高于 DMSO 组（P<0.01）,而H2O2+Cur组NRF2、HO-1和NQO-1蛋白表达水平显着高于H2O2组（P<0.01）,Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9水平明显低于H2O2组（P<0.01）。同时加入姜黄素和ML385则显着抑制NRF2/HO-1的信号通路相关蛋白的表达。本实验证明H202增加了颗粒细胞中的ROS水平和凋亡信号;而添加姜黄素能够抑制H2O2引起的颗粒细胞的凋亡、ROS水平的升高。姜黄素通过促进颗粒细胞的NRF2/HO-1/NQO-1信号通路来抑制H2O2的氧化应激损伤,降低Cleavedcasase-3和Cleavedcasase-9蛋白表达,而添加NRF2抑制剂ML385能显着逆转姜黄素对氧化应激的抑制效果。三、卵巢氧化应激不仅影响着卵子的生成、卵泡的发育,还能降低卵母细胞的质量以及影响早期胚胎的发育潜能,本实验探讨姜黄素对H2O2造模小鼠卵母细胞受精能力、早期胚胎发育能力的影响。实验分为H2O2组、H2O2+Cur组和DMSO对照组,其中H2O2浓度为400μM,Cur浓度为10μM。实验发现与DMSO组比较,H2O2组的受精率显着下降（P<0.01）;与H2O2组比较,H2O2+Cur组的受精率则明显升高（P<0.01）。与DMSO组比较,H2O2组的二细胞率、囊胚率显着下降（pP<0.01）;与H2O2组比较,H2O2+Cur组的则明显升高（P<0.01）。囊胚质量、囊胚期凋亡细胞数量H2O2组显着下降（P<0.01）;H2O2+Cur组则明显升高（P<0.01）。本实验证明姜黄素可以显着抑制H2O2诱导的胚胎氧化应激,改善受精率、二细胞期率、囊胚率并抑制氧化应激引起的细胞凋亡。本研究结果表明,姜黄素可通过激活PI3K/Akt和Nrf2/HO-1途径减轻D-gal诱导的小鼠卵巢氧化应激、细胞凋亡和卵巢损伤,增加各级卵泡数量,延缓卵巢早衰;姜黄素通过促进Nrf2/HO-1信号通路来抑制H2O2引起的卵巢颗粒细胞的凋亡、ROS水平的升高;在体外受精培养液中添加适量姜黄素能够抑制H2O2诱导的胚胎氧化应激,显着改善受精及胚胎发育潜能,增加囊胚细胞数量,抑制囊胚细胞凋亡。
吴丹丹[4]（2021）在《小鼠不同阶段卵泡同步分离方法的初步建立及评估》文中研究指明目的:卵巢皮质冷冻保存是极具发展潜力的生育力保存策略,能为年轻恶性疾病患者保存生育机会。但卵巢皮质冷冻复苏后再植存在重新引进恶性细胞的可能,因此需要寻求更安全的生育力保存的策略。由于基底膜隔绝血管,可以分离卵巢内的卵泡,经卵泡体外培养、卵母细胞体外成熟、体外受精等技术,获得可利用的卵母细胞、胚胎等,为患者保存生育力。因此,卵泡分离是至关重要的一步。既往卵泡分离方法尚未完善,本研究的目的是初步建立酶消化后多重滤网过滤法同步分离小鼠卵泡,并评估-其分离效率和卵泡质量。方法:运用混合有胶原酶Ⅰ和脱氧核糖核酸酶Ⅰ的消化酶来消化小鼠卵巢预切组织,然后依次通过不同孔径（100μm、40μm、20μm）的滤网以实现不同发育阶段卵泡同步分离的目的,将翻转冲洗100μm滤网得到卵泡记为A组,将翻转冲洗40μm滤网得到的卵泡记为B组,将翻转冲洗20μm滤网得到的卵泡记为C组。通过测量卵泡直径评估滤网同步分离卵泡的效能;评估卵泡基底膜的完整性和跨透明带突起结构来评价卵泡的形态和结构;测定卵泡ATP值及卵泡体外培养,评估分离卵泡的线粒体功能及发育潜能;通过体外成熟、受精等技术,将卵泡转为可利用的卵母细胞和胚胎,保存生育力。结果:酶消化后多重滤网过滤法能够获得大量质量良好的卵泡。按筛孔大小获得的卵泡群依次分为A组（>100μm）、B组（40μm-100μm）、C组（20μm-40μm）。一轮过滤后获得的卵泡是滤网直径选择范围内的占比依次增加,分别为54.36%（A组）、65.95%（B组）和66.67%（C组）,其中A组与C组、B组与C组相比差异具有统计学意义（p=0.0147,p=0.0090）,二轮过滤后,A组卵泡是滤网选择范围内的比例为92.91%。数量上,C组数目最多,A组次之,B组最少;形态上,C组卵泡基底膜完整率（83.66%）高于A组（59.72%,p<0.001）和B组（64.38%,p<0.001）;结构上,A组和B组卵泡的跨透明带突起结构丰富;活力上,A组卵泡的存活率70.59%高于B组51.79%和C组35.90%（p=0.0016,p<0.001）;发育潜能上,经过96小时体外培养,A组卵泡直径由（113.64±2.04）μm增长至（150.95±9.79）μm（p<0.01）,B组卵泡直径由（88.12±1.94）μm增长至（120.61±3.84）μm（p<0.001）。卵母细胞体外成熟培养后,成熟率为56.79%,MⅡ卵母细胞体外受精后二细胞形成率为44.90%。结论:酶消化后多重滤网过滤法能快速、有效、同步分离不同发育阶段小鼠卵泡。一轮过滤后,C组卵泡滤网筛选效能最高,二轮过滤获得的A组卵泡滤网筛选效能最高,二轮过滤能显着改善A组卵泡分离效率;分离得到的A组卵泡的活力、线粒体功能、发育潜能最优;C组卵泡基底膜完整率最高、卵泡活力最低;阶段特异性卵泡培养条件、卵母细胞的体外成熟仍需未来更多的探索。。
何翃闳[5]（2020）在《低氧浓度对牦牛卵母细胞和附植前胚胎发育的影响及其作用机制的研究》文中研究表明牦牛对于低氧高寒环境具有较强的适应性,但其体外卵母细胞成熟率和胚胎发育能力较为低下,这严重影响了其体外受精、体细胞克隆等繁殖技术的发展。体外培养系统的气相环境对卵母细胞和早期胚胎的发育起着至关的重要作用,而氧气是体外培养系统气相环境的重要组成部分。然而,目前在国内外尚未见关于低氧浓度对牦牛卵母细胞和附植前胚胎发育影响的报道。本研究旨在探讨不同氧浓度对牦牛卵母细胞成熟和体外受精胚胎发育能力的影响,以及其作用机制的研究,为进一步优化牦牛体外胚胎生产系统提供理论依据。本研究进行了以下试验并取得了一定成果:1.通过观察在不同氧气浓度组（20%、10%、5%和1%O2）成熟的卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte complexes,COCs）的扩张和第一极体的排出情况,统计不同氧气浓度组牦牛卵母细胞孤雌激活（parthenogenetic activation,PA）后胚胎的卵裂率和囊胚率判断卵母细胞的发育能力,采用实时荧光定量（Quantitative Real-Time PCR,q RT-PCR）和蛋白免疫印迹分析（Western blotting）检测不同氧气浓度下牦牛卵母细胞葡萄糖转运、发育和代谢相关基因和蛋白的表达。结果显示,当氧气浓度为5%时,COCs扩散最好,卵母细胞的成熟率显着高于其他组（p<0.05）,而孤雌激活胚胎的卵裂率显着高于20%O2浓度组和1%O2浓度组（P<0.05）,囊胚率显着高于其他组（P<0.05）;不同氧气浓度组间与卵母细胞发育、抗氧化和代谢能力相关基因及其蛋白的表达有显着差异。结果表明,牦牛卵母细胞体外成熟过程中,5%的氧气浓度可以促进牦牛卵母细胞的成熟,并可显着提高后续孤雌激活胚胎的发育能力。2.通过免疫组织化学法检测HIF-1α和VEGF蛋白在牦牛卵巢中的定位,并采用q RT-PCR、Western blotting、免疫荧光染色法和TUNEL试剂盒分别检测HIF-1α、VEGF、Bax和Bcl-2在不同氧气浓度组COCs（20%、10%、5%和1%O2）中的表达情况以及不同氧气浓度组COCs中的细胞凋亡率。结果显示,HIF-1α蛋白主要定位在卵巢的卵泡颗粒层、卵泡膜、透明带、放射冠和卵巢生殖上皮层中,而VEGF蛋白主要定位在卵巢的卵泡颗粒层和卵泡膜中,在COCs中,其表达主要位于卵母细胞中,在卵丘细胞中表达较弱;随着氧气浓度的降低,HIF-1α和VEGF的表达均呈现先升高后降低的趋势,在5%氧气浓度下达到最高,显着高于其他组（P?0.05）;在5%氧气浓度下促凋亡因子Bax的表达水平均显着低于其他组（P<0.05）,而抗凋亡因子Bcl-2的表达水平均显着高于其他组（P<0.05）,其细胞凋亡率显着低于其他组（P?0.05）。结果表明,牦牛卵母细胞体外成熟过程中,5%氧气浓度可能通过HIF-1α介导VEGF的表达抑制了COCs的细胞凋亡,促进了卵母细胞的发育。3.将5%氧气浓度组中成熟的COCs分别在不同氧气浓度（20%、10%、5%和1%O2）下进行体外受精,观察不同氧气浓度对体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚孵化率和总细胞数来判断低氧浓度对胚胎发育能力的影响;此外,我们采用q RT-PCR、免疫荧光染色法和TUNEL试剂盒分别检测了胚胎发育相关基因的表达和细胞凋亡率。结果显示,在5%O2浓度组中,胚胎的卵裂率显着低于20%O2浓度组和10%O2浓度组（P<0.05）,显着高于1%O2浓度组（P<0.05）,而囊胚率、囊胚中的细胞总数、内细胞团细胞数、滋养层细胞数、ICM/TE的比例以及细胞凋亡率均显着高于其他组（P<0.05）;在5%O2浓度下,囊胚中CDX2、POU5F1、SOX2和NANOG基因的m RNA转录水平显着高于其他组（P<0.05）,促凋亡基因Bax的转录水平显着降低（P<0.05）,而抗凋亡因子Bcl-2的转录水平显着升高（P<0.05）。结果表明,在牦牛体外受精胚胎发育过程中,5%的氧气浓度降低了胚胎的卵裂率,但显着提高了胚胎的囊胚率,增强了附植前牦牛胚胎的发育能力并抑制了其细胞凋亡。4.通过q RT-PCR和免疫荧光染色法检测p38 MAPK与HIF-1α在常氧浓度（20%O2）和低氧浓度（5%O2）下体外受精胚胎不同阶段发育中的表达和定位。结果显示,在常氧浓度和低氧气浓度下,随着体外受精胚胎的发育,HIF-1α和p38 MAPK的表达呈先升高后降低的趋势,在8细胞中均达到最高（P<0.05）,而在囊胚期均为最低（P<0.05）;HIF-1α在各阶段胚胎中的表达差异均显着（P<0.05）,而p38 MAPK在2细胞到8细胞阶段表达差异不显着（P>0.05）,但在桑椹胚和囊胚阶段中表达差异显着（P<0.05）;在常氧浓度下,在2细胞到囊胚阶段,HIF-1α蛋白主要表达于胚胎的细胞质中,在囊胚中的表达非常弱,而p38MAPK蛋白表达于胚胎的细胞质和细胞核中,在细胞质中表达更为明显;在低氧浓度下,在2细胞到桑椹胚阶段,HIF-1α蛋白主要表达于胚胎的细胞质中,在囊胚阶段,HIF-1α蛋白在细胞质和细胞核中均有表达,而且在细胞核中表达明显,而p38 MAPK蛋白主要表达于胚胎的细胞质和细胞核中,在2细胞到桑椹胚阶段,细胞质中表达更为明显,而在囊胚阶段,细胞核中表达更为明显。结果表明5%氧气浓度下HIF-1α蛋白在囊胚中转入细胞核表达,推测5%氧气浓度可能通过p38 MAPK基因调控HIF-1α基因的表达,提高了囊胚率,进一步改善了附植前胚胎的发育。本研究表明5%的氧气浓度有利于牦牛卵母细胞的体外成熟,增强了牦牛附植前体外受精胚胎的发育能力,为进一步探讨牦牛卵母细胞体外成熟环境及建立牦牛体外胚胎生产系统提供了理论依据。
陈燕霞[6]（2020）在《补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究》文中指出研究背景随着人们生活方式和生育观念的改变,女性生育年龄不断后移,全球生育率呈逐年下降的趋势,而不孕不育的发病率呈逐年攀升的趋势。流行病学调查结果显示,在我国育龄人群中不孕不育的发病率高达15%～20%,患者累计超过6000万,尤其是在我国二孩政策开放后,高龄妇女成为不孕不育的主要就诊人群。其中,卵巢储备功能低下（Diminished Ovarian Reserve,DOR）是造成育龄女性发生不孕不育的重要致病因素,若未能及时干预则可在1～6年内进一步恶化并发展成为卵巢早衰。DOR不仅影响患者的生殖和心理健康,远期还可增加骨折、骨质疏松、心血管事件的发生风险。现代医学主要采用激素替代疗法改善患者临床症状和预防远期并发症,并通过辅助生殖技术进行人工助孕,但由于许多患者无法获得成熟的卵子进行体外受精,因此最终不能获得成功妊娠。中医药在防治不孕不育方面具有悠久的历史并积累了丰富的经验。前期通过查阅相关文献发现,肾虚血瘀是贯穿DOR发生发展全过程的基本病机,补肾活血是治疗DOR的重要治法。导师马堃研究员三十余年来一直致力于补肾活血中药治疗排卵障碍性不孕不育的临床及基础研究,根据多年临床诊疗经验,以补肾活血法为组方原则拟定补肾促卵方,长期应用于临床以治疗DOR,效果颇佳。现代药理研究显示,补肾促卵方可以通过抑制卵泡颗粒细胞凋亡,减少卵泡闭锁,增加原始卵泡,从而起到保护卵巢储备功能的作用。对于大多数雌性哺乳动物而言,卵巢中原始卵泡的数量是相对固定且不可再生的,因此不论何种因素诱导DOR的发生,最终都可将其归咎于卵巢中原始卵泡库提前耗竭,导致卵巢储备衰减,因而不能提供充足数量的原始卵泡以被募集进入生长卵泡池,卵泡发育障碍,最终无法形成具有受精能力的成熟卵子。因此,寻求有效治疗药物,积极改善卵巢储备功能、保护原始卵泡库是防治DOR的关键策略之一,而这正是中医“治未病”思想的体现。随着研究的不断深入,越来越多的证据支持原始卵泡过度激活是诱导卵巢储备提前耗竭的重要病理机制。为了维持生殖寿命,卵巢中绝大部分原始卵泡都处于静息休眠状态,每个周期中只有极少一部分原始卵泡会被激活进入生长卵泡池。其中,PI3K/AKT/mTOR信号通路在维持原始卵泡静息状态和启动募集过程中发挥着至关重要的作用,对于维持原始卵泡激活与休眠、存活与凋亡之间的动态平衡具有重要的意义。一旦原始卵泡过度激活进入生长卵泡池,将伴随着大量生长卵泡发生异常闭锁,而颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的中心环节,其中Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路在细胞凋亡途径中起着关键的调控作用,而氧化应激又是启动细胞凋亡程序的重要刺激因素。细胞凋亡的实质就是细胞内氧化系统与抗氧化系统之间动态平衡被打破的结果,其中,Nrf2/ARE信号通路是体内最为重要的抗氧化应激防御体系,在维持细胞稳定、抑制细胞凋亡等方面具有重要的作用。因此,本研究拟从PI3K/AKT/mTOR信号通路、Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路以及Nrf2/ARE信号通路探讨补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR的作用机制。在此基础上,并对补肾促卵方进行了急性毒性实验研究,以评价其用药安全性,以期为临床应用提供科学依据。研究目的本研究通过雷公藤多苷构建DOR小鼠模型,筛选出最适补肾促卵方给药浓度后,观察其对模型小鼠卵巢储备功能的保护作用,进而从分子角度深入探讨补肾促卵方通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路逆转雷公藤多苷诱导卵巢原始卵泡过度激活的作用机制,以及补肾促卵方通过激活Nrf2/ARE信号通路,抑制雷公藤多苷所致氧化应激对卵巢Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路的激活,减少颗粒细胞凋亡,防止生长卵泡过度闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用机制。与此同时,本研究开展了补肾促卵方急性毒性实验研究,以期为临床用药安全性提供客观依据。研究方法一、补肾促卵方急毒实验为了验证补肾促卵方的安全性,以小鼠为研究对象,进行急性毒性实验研究。在预实验中将20只小鼠随机分为给药组和对照组,灌胃前12h每组小鼠均禁食不禁水,给药组予最高给药浓度和小鼠可承受的最大给药体积的补肾促卵方溶液,1日灌胃3次,每次间隔约4h,对照组予等体积生理盐水灌胃,连续观察7天,测定LD50值。根据预实验结果,正式急毒实验采用药物最大耐受量实验的方法进行研究,将40只小鼠随机分为给药组和对照组,给药组灌胃当日予小鼠可承受最大给药体积和最高给药浓度的补肾促卵方浓溶液3次,对照组灌胃给予等体积生理盐水,每次间隔约4h,连续观察14天,密切观察小鼠的死亡情况、反应症状、体重变化、饲料消耗量,以及主要脏器大体形态改变和脏器指数情况。二、补肾促卵方浓度筛选实验雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方低剂量组、补肾促卵方中剂量组、补肾促卵方高剂量组和戊酸雌二醇组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方低剂量、中剂量和高剂量组分别予浓度为0.13g/mL、0.27g/mL和0.53g/mL补肾促卵方混悬液0.2mL灌胃;戊酸雌二醇组予0.015mg/mL戊酸雌二醇混悬液0.2mL灌胃;空白组和模型组予0.2mL生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,计算性腺指数,测定血清性激素（FSH、LH、E2）含量,并通过HE染色观察卵巢组织形态及卵泡计数情况。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方组和激素序贯组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方组予0.27g/mL补肾促卵方混悬液灌胃;激素序贯组予戊酸雌二醇联合醋酸甲羟孕酮进行序贯治疗;空白组和模型组予等体积生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,测量并计算各个脏器指数情况,检测血清性激素（AMH、INHB、FSH、LH、E2）水平,并通过HE染色观察子宫、卵巢形态学改变以及卵泡计数情况。为了进一步明确补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡池的作用机制,采用Western blot法检测卵巢组织PI3K/AKT/mTOR 信号通路关键蛋白 PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR表达水平,并采用RT-PCT分别检测PI3K、AKT、mTOR mRNA表达水平。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制在实验三的基础上,研究发现雷公藤多苷除了诱导原始卵泡发生过度激活外,还可引起卵泡发生过度闭锁。为了深入探讨雷公藤多苷诱导DOR是通过使原始卵泡过度激活、致使生长卵泡闭锁增加,还是直接诱导原始卵泡发生闭锁。在此基础上本实验对小鼠卵巢组织进行了 TUNEL荧光染色,并通过免疫组化法观察卵巢组织Cyt C、Caspase-3表达情况。为了进一步明确补肾促卵方抑制雷公藤多苷引起卵泡过度闭锁的作用机制,本实验采用Western blot法检测卵巢组织凋亡相关蛋白CytC、Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平,同时采用RT-PCT检测Bax、Bcl-2mRNA表达水平。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制在上述实验基础上,研究发现雷公藤多苷可通过诱导原始卵泡过度激活,并使进入生长卵泡池的颗粒细胞发生过度凋亡,促使卵泡异常闭锁,从而造成DOR。基于氧化应激是启动细胞凋亡程序的重要调控因素,为了进一步探索雷公藤多苷诱导卵泡颗粒细胞凋亡的作用机制以及补肾促卵方对其保护作用,本实验对卵巢组织8-OHdG、MDA、CAT、GSH-Px、SOD的水平进行了测定,同时采用Western blot和RT-PCT对卵巢组织Nrf2/ARE信号通路关键蛋白和基因Bach 1、Nrf2、Keap 1、HO-1的表达水平进行了检测。研究结果一、补肾促卵方急毒实验预实验结果提示补肾促卵方测不出LD50,故正式急毒实验采用最大耐受量实验的方法进行研究,结果显示补肾促卵方灌胃给药后,所有动物均未见死亡并且存活至实验结束。除给药组小鼠在灌胃后2h内出现静伏、活动减少、D0粪便色黑以及D1摄食量减少外,各组小鼠在其他时间点的一般状况良好。实验过程中两组小鼠日均饲料消耗量无明显差异,小鼠体重呈稳定上升趋势。两组小鼠主要脏器大体解剖均未见异常现象,主要脏器指数也无明显差异。二、补肾促卵方浓度筛选实验各组小鼠在实验期间进食、活动和大小便均无明显异常,补肾促卵方干预后小鼠体毛致密有光泽:除空白组外,各组小鼠予雷公藤多苷灌胃后,体重先呈下降趋势,随后逐渐增加至正常水平,至实验结束,各组小鼠体重无明显差异。补肾促卵方中、高剂量组能有效地改善小鼠动情周期,升高子宫和卵巢指数（P<0.05）,下调血清FSH、LH水平（P<0.01）,并增加原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数（P<0.01）,减少闭锁卵泡计数（P<0.01）。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制各组小鼠一般情况、体重及动情周期变化趋势与实验二结果一致。补肾促卵方干预后小鼠卵巢指数升高（P<0.01）,血清AMH和INHB水平上升（P<0.01）,FSH、FSH/LH值下降（P<0.01,P<0.05）;补肾促卵方能增加卵巢原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,减少次级卵泡和闭锁卵泡数目（P<0.01）,同时下调早期生长卵泡与原始卵泡比值（P<0.01）。补肾促卵方能增加小鼠子宫内膜厚度并使子宫内膜腺体数目增多。进一步研究发现补肾促卵方能下调卵巢组织 P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、P-mTOR/mTOR 值（P<0.01）,同时减少 AKT和mTOR mRNA表达水平（P<0.01）,并使PI3K mRNA表达呈下降趋势。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制卵巢组织TUNEL荧光染色主要出现在各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而位于皮质区的原始卵泡未见明显荧光着色,补肾促卵方干预后卵巢荧光面积和数量明显减少。免疫组化结果显示Cyt C和Caspase-3蛋白也主要表达于各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而原始卵泡表达较少,补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C和Caspase-3阳性表达面积比（P<0.01）。Western blot结果显示补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C、Caspase-3和Bax蛋白表达水平（P<0.05）,增加Bcl-2和Bcl-2/Bax值（P<0.05,P<0.01）,同时补肾促卵方能使Bax mRNA表达水平呈下调趋势,增加Bcl-2mRNA和Bcl-2/Bax值（P<0.01）。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制补肾促卵方能减少卵巢8-OHdG、MDA含量（P<0.05,P<0.01）,增加CAT、GSH-Px和SOD活力（P<0.01）。Western blot结果显示,补肾促卵方能下调Bach 1核蛋白和Keap1蛋白表达水平（P<0.01,P<0.05）,上调Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表达水平（P<0.05）,同时补肾促卵方能下调Bach 1核易位率并上调Nrf2核易位率（P<0.01）。RT-PCT结果显示,模型组和补肾促卵方组Bach 1和Nrf2 mRNA水平均升高（P<0.01）,但补肾促卵方能下调Keap 1 mRNA并上调HO-1 mRNA表达水平（P<0.05,P<0.01）。研究结论1.补肾促卵方最大耐受量为660.00g生药/kg/d,相当于临床用药量的240倍,该方临床用量安全无毒。2.补肾促卵方中、高剂量能够有效地保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠的卵巢储备功能,且两者疗效相当,故在后续实验中选择中剂量进行研究。3.补肾促卵方能通过抑制卵巢PI3K/AKT/mTOR信号通路,逆转雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡过度激活,减少卵泡异常闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用。4.补肾促卵方能通过抑制卵巢Bax/Cyt C/Caspases-3信号通路,上调Bcl-2表达,减少生长卵泡颗粒细胞过度凋亡,从而防止雷公藤多苷诱导DOR小鼠出现生长卵泡异常闭锁。5.补肾促卵方能通过调控卵巢Nrf2/ARE信号通路,抑制Keap1过表达,促进Nrf2核易位,激活下游抗氧化酶活性,从而减轻雷公藤多苷诱导DOR小鼠卵巢出现氧化应激,防止卵泡颗粒细胞过度凋亡。
齐佳佳[7]（2020）在《亚细亚酸对猪卵母细胞及早期胚胎体外发育影响的研究》文中研究说明猪卵母细胞的体外成熟及早期胚胎的体外培养技术是开展家畜胚胎发育研究和胚胎工程操作的重要内容。但是与体内获取的卵母细胞和胚胎相比,体外获得的卵母细胞与胚胎发育质量差是目前遇到的一大问题,因为在卵母细胞体外成熟及胚胎体外培养过程中容易受到自由基等多种其它因素的影响。亚细亚酸是一种从积雪草中分离出来的五环三萜烯,它的主要功能基团包括三个羟基,一个不饱和键以及一个羧基。有研究表明,亚细亚酸具有多种药理活性,包括抗凋亡、抗衰老、抗炎症、抗氧化等。但是亚细亚酸对卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响还未有报道,因此本研究旨在探究亚细亚酸对猪卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外培养的影响及其可能的作用机制。具体内容如下:实验一:在猪卵母细胞体外成熟过程中补充亚细亚酸,研究其对卵母细胞体外成熟的影响。从卵巢中采集GV期的卵母细胞,进行42-44h的成熟培养后,统计MⅡ期卵母细胞的成熟率,结果显示,补充亚细亚酸组的卵母细胞的成熟率与对照组相比有小幅度提升但无显着差异。将卵母细胞进行PA及IVF处理后,发现在体外成熟期间补充亚细亚酸可显着提高早期胚胎的发育能力,且囊胚的质量也有显着提高。同时对卵母细胞的抗氧化能力进行检测,结果显示,补充亚细亚酸后细胞内的ROS水平显着下降且GSH水平显着升高。亚细亚酸还缓解了由ROS累积引起的线粒体功能障碍,提高了细胞内的ATP水平。通过β-半乳糖苷酶检测发现亚细亚酸也可有效缓解卵母细胞的衰老进程。此外,除了关注卵母细胞外,还检测了与它密切相关的卵丘颗粒细胞的状态,发现经亚细亚酸处理后与卵母细胞共培养的卵丘细胞的相对扩散面积增加,且经流式细胞术检测后结果显示卵丘细胞的抗氧化能力提高,凋亡率下降。实验二:在猪早期胚胎体外培养过程中补充亚细亚酸,研究其对猪早期胚胎体外发育的影响。结果表明,在体外培养期间补充10μM的亚细亚酸可显着提高PA、SCNT和IVF猪早期胚胎的发育能力。进一步的分析表明,亚细亚酸能够显着减缓由H2O2诱导的细胞内ROS累积的状况。值得注意的是,亚细亚酸不仅提高了细胞内GSH的水平,还缓解了线粒体功能障碍。实时荧光定量结果分析显示,在核移植的囊胚中,亚细亚酸能够上调抗氧化相关基因Sod-1和囊胚孵化相关基因Cox-2的表达,下调凋亡相关基因Caspase-9的表达。综上所述,研究结果表明在卵母细胞体外成熟过程中补充亚细亚酸能有效提高卵母细胞的抗氧化能力,改善猪卵母细胞质量,提高后续早期胚胎的体外发育能力。另外在早期胚胎发育过程中补充亚细亚酸能够提高早期胚胎体外发育潜能,保护早期胚胎免受氧化应激损伤的影响。
苗佳坤[8]（2020）在《氯喹对猪卵母细胞体外成熟的作用研究》文中研究表明溶酶体（lysosome）是一种重要的细胞器,存在于所有原生动物和多细胞动物的细胞中,可以隔离通过内吞作用和自噬途径获得的大分子,进行降解和再循环。大规模的大分子更新对于哺乳动物卵母细胞的生长和发育至关重要。然而,溶酶体在哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟中的功能作用仍然不清楚。本研究通过特异性溶酶体抑制剂氯喹（CQ）处理体外成熟培养的猪卵丘-卵母细胞复合物（COC）,研究了溶酶体在猪卵母细胞体外成熟过程中的作用和可能的机制,为相关研究提供新的参考。本研究主要实验结果如下:（1）利用荧光染色检测溶酶体显示溶酶体存在于卵母细胞成熟过程的每个阶段并且主要分布在卵质的皮质及外周细胞质区域,定量分析显示溶酶体的相对荧光强度从GV到GVBD保持稳定,然后从GVBD到MII显着降低（1.12 vs.0.83,P<0.001）,表明溶酶体在猪卵母细胞成熟过程中存在并随着卵母细胞成熟进程动态变化。（2）向COCs成熟培养液中添加不同浓度的溶酶体特异性抑制剂CQ（0、25、35、45μM）不会改变卵母细胞的第一极体排出率,但会使MII期卵母细胞核染色体异常状态率显着增加（6.2%of control vs.34.7%,39.9%,71.2%,P<0.05）,这些结果表明CQ处理抑制溶酶体以剂量依赖性方式诱导猪卵母细胞核异常。（3）利用荧光染色检测卵母细胞的纺锤体组装、氧化应激水平及早期凋亡情况发现,与对照组相比,35μM CQ处理诱导卵母细胞微管形态异常（34.7%of control vs.57.9%,P<0.01）,破坏细胞膜上微丝的正常分布（1.0 of control vs.0.6,P<0.001）,但不影响胞质内的微丝分布及p-ERK1/2水平。同时,抑制溶酶体显着提高卵母细胞早期凋亡率（9.1%of control vs.19.2%,P<0.01）,降低抗凋亡基因Bcl2水平（1.00 vs.0.16,P<0.01）,但是卵母细胞ROS水平没有显着变化。综上,抑制溶酶体造成卵母细胞骨架组装异常,早期凋亡率增加。（4）对CQ处理抑制溶酶体的成熟卵母细胞进行孤雌激活或体外受精后体外培养7天,结果表明,对于孤雌胚胎,CQ处理组死亡率显着升高（Control vs.35μM vs.45μM:2.75%vs.24.50%vs.50.59%,P<0.01）,卵裂率显着降低（Control vs.35μM vs.45μM:89.90%vs.76.60%vs.75.51%,P<0.05）,囊胚率显着降低（Control vs.35μM vs.45μM:61.05%vs.33.70%vs.33.92%,P<0.001）,囊胚细胞数显着降低（Control vs.35μM vs.45μM:35.7 vs.25.0 vs.21.2,P<0.01）;对于体外受精胚胎,卵裂率显着降低（Control vs.35μM vs.45μM:62.31%vs.44.21%vs.32.74%,P<0.05）,胚胎碎裂率显着升高（Control vs.35μM vs.45μM:4.64%vs.16.49%vs.23.83%,P<0.05）,囊胚率显着下降（Control vs.25μM vs.35μM vs.45μM:23.52%vs.16.41%vs.11.93%vs.5.54%,P<0.05）,且每个囊胚的平均细胞数显着减少（Control vs.35μM vs.45μM:34.8 vs.21.3 vs.16.5,P<0.001）。综上,抑制卵母细胞中溶酶体功能可能通过诱导胚胎死亡或碎裂而影响它们在孤雌激活或体外受精后的发育能力。（5）检测自噬相关的m RNA和蛋白质水平发现,添加35μΜCQ处理的卵母细胞中LC3蛋白水平显着升高（0.6 of control vs.5.8,P<0.001）,溶酶体膜标志物Lamp1、2的m RNA水平显着降低（1.00 vs.0.46,P<0.05;1.00 vs.0.14,P<0.001）。综上,在体外成熟过程中抑制溶酶体会影响卵母细胞自噬功能。综上所述,溶酶体在猪卵母细胞体外成熟过程中持续存在且呈动态变化,对卵母细胞减数分裂成熟具有重要作用,主要是通过调控细胞骨架组装及参与自噬途径来影响卵母细胞核成熟进程和后续胚胎发育能力。
陈华丽[9]（2020）在《Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制》文中指出哺乳动物超过99%的卵子在发育过程中都会经历闭锁性退化而不排卵,在促性腺激素的作用下,其中一些可以达到排卵前阶段,为了促进濒危物种以及基因优良畜禽体外培养卵子更好的应用,卵子发生和卵泡发育的机制尚需进一步研究。颗粒细胞分泌的激素和生长因子对卵泡发育起重要作用,同时卵母细胞分泌各种生长因子也可以调节颗粒细胞的增殖和分化。在卵泡液中含有多种不同水平的类固醇激素,比如雌激素、孕酮和雄激素,可以通过作用于颗粒细胞生长以及卵泡液的形成来影响卵巢的卵泡发育。近年来很多的研究表明,Wnt信号可以调节小鼠和人类的性腺发育和性别分化,并且可以调节激素的合成和分泌,对哺乳动物卵泡形成和发育以及卵巢功能的维持具有重要作用,可以参与调控卵泡闭锁等生理过程。Wnt5a和Wnt11属于非经典Wnt蛋白,它们在颗粒细胞中表达并且在整个卵泡发育过程中发挥特异的调控作用。当颗粒细胞Wnt5a失去活性的时候可以导致小鼠卵泡闭锁增加和排卵率降低。然而Wnt非典型通路对猪卵泡发育的作用尚未见系统报道,本文探究Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡发育过程中凋亡和激素分泌的影响。本试验通过抽吸法取得直径为2-5mm的卵泡中的卵泡液,并且收集颗粒细胞和卵母细胞,在体外培养液中添加一定剂量的Wnt/Ca2+通路中蛋白抑制剂或激活剂,包括Wnt蛋白抑制剂IWP-2、磷脂酶C（PLC）蛋白抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS以及PKCβ蛋白抑制剂Enzastaurin。通过显微镜观察卵母细胞成熟率;通过CCK8试验分别观察IWP-2、U73122、m-3M3FBS或Enzastaurin对颗粒细胞活力的影响。由荧光Ca2+指示剂Fluo3-AM监测颗粒细胞内钙离子含量,Ca2+指示剂Fura-2AM测定卵母细胞内钙离子含量。采用实时荧光定量（q RT-PCR）法检测通路相关基因以及激素分泌、细胞凋亡调控相关基因转录水平的表达;Annexin V-FITC法检测PLC抑制剂和激活剂对颗粒细胞的凋亡的影响。酶联免疫法（ELISA法）检测猪颗粒细胞雌二醇和孕酮的水平。Western Blot法检测凋亡调控若干蛋白、PLC四个亚基蛋白及三种钙离子敏感蛋白（PKCβ、CAMKⅡα、Caln A）的相对表达量。得到如下主要研究结果:1. 与对照组相比,0.05μM或5μM的IWP-2对猪颗粒细胞活力没有影响,0.1μM、0.5μM和2.5μM的IWP-2增加了猪颗粒细胞活力（P<0.05）。这表明Wnt配体在一定程度上抑制颗粒细胞活力。PLC抑制剂U73122的浓度不超过0.5μM时颗粒细胞的活力没有变化,浓度增加时细胞活力在4 h、24 h和48 h降低（P<0.05）,而PLC激活剂m-3M3FBS的添加使12 h之前的颗粒细胞活力随着浓度的增加呈现先升高再降低的趋势,m-3M3FBS浓度为0.5μM时活力最高（P<0.05）。这表明,PLC蛋白参与猪颗粒细胞的活力,并且一定程度上促进颗粒细胞活力。与对照组相比,0.25μM和2μM的Enzastaurin可以降低猪颗粒细胞的活力（P<0.05）。2.0.1-5μM的Wnt抑制剂IWP-2可以对卵母细胞成熟的抑制作用具有剂量依赖性,并且0.5μM的IWP-2抑制卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。0.5μM的PLC抑制剂U73122提高了卵母细胞的成熟率（P<0.05）,降低了卵裂率（P<0.001）和囊胚率（P<0.01）;0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS降低了卵母细胞成熟率（P<0.05）,提高了卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。这说明Wnt配体在猪卵母细胞的成熟过程中可能具有促进作用,PLC蛋白可以抑制卵母细胞的成熟。3.0.5μM的IWP-2可以下调颗粒细胞（P<0.01）和卵母细胞（P<0.05）中的Ca2+的浓度。0.5μM的IWP-2处理猪颗粒细胞24 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCG1（P<0.01）和PLCZ1（P<0.001）的m RNA丰度;IWP-2处理猪卵母细胞44 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.001）和PLCZ1（P<0.001）基因的表达,同时降低了PLCD3（P<0.05）蛋白的表达。抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS对PLCB1 m RNA的最佳作用时间是4 h,最佳处理浓度是0.5μM。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h降低了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,同时降低了PLCB1（p=0.001）和PLCG1（P<0.05）的相对蛋白丰度以及钙离子的浓度（P<0.001）。0.5μM的m-3M3FBS处理颗粒细胞4 h显着增加了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,并升高了钙离子浓度（P<0.01）。与对照组相比,0.5μM的U73122处理猪卵母细胞44h后,PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.01）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度下降,钙离子浓度变化不大;用0.5μM m-3M3FBS处理猪卵母细胞44小时后,PLCB1（P<0.01）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.05）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度增加,PLCB1蛋白的丰度明显增加（P<0.05）,钙离子浓度增加（P<0.05）。IWP-2与U73122共同作用降低了颗粒细胞（P<0.001）和卵母细胞（P<0.05）中的钙离子水平,而IWP-2与m-3M3FBS共同作用则对颗粒细胞和卵母细胞的钙离子水平没有影响。结果表明,Wnt配体与PLC蛋白可以协同调节卵泡内钙离子水平的变化,能够增加胞质中Ca2+的增加。4. 在颗粒细胞中,抑制剂U73122降低了钙离子敏感蛋白PKCβ（P<0.05）、CAMKIIα（P<0.05）和Caln A（P<0.01）的表达丰度,激活剂m-3M3FBS升高了CAMKIIα蛋白（P<0.001）的表达量。在卵母细胞中,PLC蛋白对PKCβ和CAMKIIα蛋白具有正调控功能（P<0.05）,但是不影响Caln A的表达。在颗粒细胞中,抑制剂U73122可以下调CDC42（P<0.01）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.01）的m RNA表达水平,同时对CTNNB有少许上调作用（P>0.05）;激活剂m-3M3FBS可以上调CDC42（P<0.05）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.05）的m RNA表达水平,同时降低CTNNB（P<0.05）的表达。在卵母细胞中,PLC对下游基因具有上调作用,但是并不影响CTNNB的m RNA表达水平（P>0.05）。结果表明,PLC蛋白可以激活猪颗粒细胞和卵母细胞的钙离子敏感蛋白和下游基因,并且在颗粒细胞中可以抑制CTNNB的表达。5.0.5μM的IWP-2上调了调控猪颗粒细胞凋亡的BAK（P<0.001）、BAX（P<0.01）、CASP8（P<0.05）和TP53（P<0.05）基因的m RNA水平,同时Bak、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达增加（P<0.05）。0.5μM的IWP-2处理猪卵母细胞44 h之后,BAX（P<0.01）、CASP3（P<0.05）和TP53（P<0.01）基因的表达显着升高,同时抗凋亡基因BCL6（P<0.05）基因的表达降低;Bax（P<0.01）和Cleaved caspase3（P<0.05）蛋白的表达显着增加,Bcl-6（P<0.01）蛋白的表达降低。PLC活性变化可以抑制颗粒细胞的凋亡调控基因,并且在不同的时间对凋亡率的影响有所不同。0.5μM的PLC抑制剂U73122可以上调BAK（P<0.01）、BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.01）的m RNA表达水平。0.5μM的U73122作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率（P<0.05）和晚期凋亡率（P<0.05）达到最高。PLC激活剂m-3M3FBS可以上调抗凋亡基因BCL2（P<0.01）的m RNA水平,并且下调BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.05）的m RNA表达;并降低Bax蛋白的表达,增加Bcl-2蛋白的表达。0.5μM的m-3M3FBS作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率最高（P<0.05）,作用8 h时晚期凋亡率达到最高（P<0.05）。用0.5μM U73122培养猪卵母细胞44小时,与对照组相比,、、CASP3（P=0.001）、和的相对m RNA丰度增加,而的相对m RNA水平降低;、Cleaved和蛋白的表达上调。使用0.5μM m-3M3FBS培养猪卵母细胞44 h,与对照组相比,、、CASP3（p）、和TP53（p=0.001）的相对m RNA丰度降低,而BCL6的相对m RNA水平而升高（图4-6 D）;Bcl-6的蛋白表达丰度增加（P<0.05）,且P53的蛋白表达丰度降低。0.5μM的IWP-2与0.5μM的U73122于体外共同处理猪的颗粒细胞,与对照组相比,上调了BAK（P<0.01）、BAX（P<0.001）、CASP3（P<0.01）、CASP8（P<0.001）和TP53（P<0.05）的m RNA表达量,下调了BCL2（P<0.05）的m RNA表达水平。在猪颗粒细胞培养液中同时添加0.5μM的IWP-2和0.5μM的m-3M3FBS,与对照组相比,BAK（P<0.001）和CASP8（P<0.001）的m RNA表达水平降低。与对照组相比,2μM的Enzastaurin增加了BAK（P<0.001）、BAX（P<0.001）和CASP3（P<0.01）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.001）基因的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用增加了BAK（P<0.001）和BAX（P<0.05）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.01）基因的表达。2μM的Enzastaurin增加了Bax蛋白（P<0.05）的表达,降低了Bcl-2蛋白（P<0.01）的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用降低了Bcl-2蛋白（P<0.001）的表达。结果表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以协同抑制猪颗粒细胞和卵母细胞的凋亡过程。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同促进猪颗粒细胞的凋亡。6.0.5μM IWP-2可以促进猪颗粒细胞中雌二醇相关基因CYP17A1（P<0.01）、CYP19A1（P<0.01）、ER1（P<0.001）和ER2（P<0.01）的表达上调。0.5μM PLC抑制剂U73122可以上调猪颗粒细胞CYP11A1基因（P<0.05）,0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS对激素调控的作用很小。0.5μM U73122处理颗粒细胞2 h、8 h、12 h、24 h、48 h后雌二醇分泌下降（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2h后雌二醇分泌下降（P<0.05）。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h增加了孕酮的分泌（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h和8 h后孕酮水平增加（P<0.05）。0.5μM的U73122处理猪颗粒细胞后,除了8 h（P>0.05）之外,各时间点雌二醇与孕酮的比例均下降（P<0.05）。使用0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h降低了雌二醇与孕酮的比例（P<0.05）。IWP-2和U73122共同作用提高了参与调节E2和P4的基因的m RNA表达水平,IWP-2与m-3M3FBS共同作用降低了CYP11A1的m RNA表达水平（P<0.01）,提高了CYP17A1（P<0.05）、CYP19A1（P<0.01）和ER1（P<0.05）的表达水平。与对照组相比,2μM Enzastaurin以及0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用均增加了猪颗粒细胞中CYP11A1基因（P<0.01）的表达和降低了CYP19A1（P<0.001）基因的表达。0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用比2μM Enzastaurin单独作用更明显地降低了猪颗粒细胞中CYP17A1基因的表达。研究表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以共同调控猪颗粒细胞和卵母细胞的雌二醇（E2）和孕酮（P4）的激素水平。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同调控三种激素相关基因CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1。综上所述,Wnt/Ca2+信号通路中Wnt蛋白和PLC蛋白可发挥协同作用在猪的卵泡发育过程中具有抑制细胞凋亡和调节激素分泌的功能;Wnt/Ca2+信号关键蛋白PLC可以调控钙离子敏感蛋白和下游基因的表达。
李艳[10]（2020）在《颗粒细胞miR-142、miR-33b和miR-423靶向调节TGFBR1和SMAD7参与PCOS发生机制的研究》文中研究说明目的多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）是一种在育龄妇女中常见的生殖内分泌疾病,其重要的临床特征之一是卵泡发育不良及排卵障碍,部分PCOS患者伴有胰岛素抵抗且未来发展成为2型糖尿病风险较高,因此PCOS严重影响了育龄妇女的生育及健康。PCOS的病因至今尚不明确。卵巢颗粒细胞（Granulosa cells,GCs）与PCOS患者异常的卵泡发育和多种病变有着紧密的关系,对卵泡的生长发育起着至关重要的作用。了解PCOS患者卵巢颗粒细胞功能异常的发病机制可能为识别新的诊断和治疗生物标志物提供线索。在卵巢组织和卵泡液中丰度较高的microRNA（miRNA）是一种特殊的单链小分子RNA,其过度表达或表达的下调通过调节基因的表达参与细胞增殖、分化和凋亡等重要生命活动,提示miRNA可能与PCOS的发生有关。对PCOS患者卵巢颗粒细胞中miRNAs的异常表达及miRNAs调节PCOS的发病的机制仍有待进一步研究。本研究拟通过对颗粒细胞中表达异常的miRNAs在颗粒细胞中生物学功能的研究,进一步阐明PCOS的发病机制,并为PCOS的诊断和治疗提供理论基础。方法1.PCOS颗粒细胞中异常表达miRNAs的检测及靶点预测验证从2015年11月至2018年2月在郑州大学第二附属医院生殖中心收集46名PCOS患者和32名健康女性的卵泡液,提取卵泡液中颗粒细胞。应用RT-qPCR检测颗粒细胞中 6 种候选 miRNAs（miR-33b,miR-34c,miR-106,miR-142,miR-193和miR-423）的表达差异。应用在线靶点预测软件预测PCOS组中异常表达miRNAs的作用靶点,然后构建靶基因报告质粒,并通过荧光素酶分析和蛋白免疫印迹进一步验证已预测靶点。我们通过ELISA检测PCOS患者和健康对照组颗粒细胞培养液中TGF-β1的表达,并利用RT-qPCR检测TGF-β1对颗粒细胞中miR-142、miR-33b和miR-423以及TGFBR1和SMAD7表达的影响。通过蛋白免疫印迹检测差异表达的miRNAs混合物对TGF-β信号通路相关蛋白（TGFBR1、SMAD2,SMAD3 和 SMAD7,CDKN1A 和 CDKN2B）表达的影响。最后,为了进一步了解PCOS患者的病理生理学,使用免疫印迹检测了 PCOS患者和健康对照的颗粒细胞中SMAD7和TGFBR1的蛋白质水平。2.颗粒细胞中miR-142、miR-33b和miR-423生物学功能的研究用 miR-142 mimics、miR-33b mimics 和 miR-423 inhibitor 混合物转染人原代颗粒细胞48h,再用TGF-β1处理48h,然后用MTT检测细胞活力、Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡、流式细胞术检测细胞周期。结果1.PCOS颗粒细胞中异常表达miRNAs的检测及靶点预测验证PCOS组患者的GCs中miR-142和miR-33b表达上调（p<0.05）,而miR-423表达下调（p<0.05）,其余三种miRNAs的表达在两组间没有显着差异。靶基因软件预测这三种miRNAs均和TGF-β信号通路相关,miR-142和miR-33b靶点是TGFBR1,miR-423靶点是SMAD7,并经双荧光素酶报告基因检测和蛋白免疫印迹验证。和健康对照相比,PCOS组GCs中TGF-β1的表达显着降低。TGF-β1能够显着降低miR-142和miR-33b的表达水平,升高miR-423的表达水平,且具有时间和剂量依赖性。另外,TGF-β1处理颗粒细胞后TGFBR1的表达水平显着升高,而SMAD7的表达水平显着降低。用miRNAs混合物处理的原代GCs中TGFBR1的水平降低,SMAD7水平升高。当用TGF-β1处理时,miRNAs混合物处理的细胞中p-SMAD2和p-SMAD3的水平较低。用miRNAs混合物处理的细胞中CDKN1A和CDKN2B mRNA的表达水平显着降低（p<0.01）,而c-Myc的表达水平显着升高（p<0.01）。与对照相比,PCOS患者的颗粒细胞中SMAD7蛋白水平升高,而TGFBR1蛋白水平降低。2.颗粒细胞中miR-142、miR-33b和miR-423生物学功能的研究miR-142 mimic,miR-33b mimic 和 miR-423 inhibitor 混合物组的相对细胞活力显着高于转染错配对照组（Scramble control）的细胞活力（p<0.01）;混合物组的细胞凋亡率显着低于转染错配对照组（p<0.05）;混合物组的G0/G1期细胞显着减少（p<0.05）,S期细胞显着增加（p<0.01）,而处于G2/M期细胞百分比在两组间无显着差异。结论1.PCOS颗粒细胞中异常表达miRNAs的检测及靶点预测验证与对照组相比PCOS患者的GCs中miR-142和miR-33b表达上调,而miR-423表达下调。三种miRNAs的靶点均涉及TGF-β信号通路:miR-142和miR-33b的靶点是TGFBR1;miR-423的靶点是SMAD7。PCOS患者颗粒细胞中TGF-β1表达显着降低,且TGF-β1对miR-142、miR-33b和miR-423具有负反馈调节的作用。miR-142 mimics、miR-33b mimics 和 miR-423 inhibitor 能够阻断颗粒细胞中TGF-β信号通路。PCOS患者颗粒细胞中SMAD7蛋白增加,TGFBR1蛋白减少。2.颗粒细胞中miR-142、miR-33b和miR-423生物学功能的研究miR-142 mimic,miR-33b mimic 和 miR-423 inhibitor 具有促进颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞凋亡的能力。全文结论:1.PCOS患者颗粒细胞中miR-142、miR-33b和miR-423表达异常。2.PCOS患者颗粒细胞异常表达的miRNAs通过靶向调节TGFBR1和SMAD7影响颗粒细胞增殖、凋亡和细胞周期等生物学功能,可能参与PCOS的发生。
二、Can apoptosis analysis of cumulus granulosal cell evaluatethe potential vitality of replaced embryo?（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Can apoptosis analysis of cumulus granulosal cell evaluatethe potential vitality of replaced embryo?（论文提纲范文）
（1）雌激素对猪卵母细胞自噬的作用及调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物卵母细胞的成熟调控 |
| 1.1.1 哺乳动物的卵泡发育 |
| 1.1.2 卵泡发育的分子机制 |
| 1.1.3 卵母细胞核成熟 |
| 1.1.4 卵母细胞质成熟 |
| 1.2 卵母细胞的氧化应激和早期凋亡 |
| 1.2.1 卵母细胞的氧化应激 |
| 1.2.2 卵母细胞的早期凋亡 |
| 1.3 卵丘-卵母细胞间隙连接通讯 |
| 1.4 雌激素研究进展 |
| 1.4.1 雌激素的生成 |
| 1.4.2 雌激素受体 |
| 1.4.3 雌激素作用 |
| 1.5 自噬研究进展 |
| 1.5.1 自噬的形成 |
| 1.5.2 自噬的功能 |
| 1.5.3 自噬的机制 |
| 1.5.4 自噬对卵泡发育的影响 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 自噬对猪卵母细胞发育潜能的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 雌激素对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.3.2 自噬蛋白在猪卵巢组织中的表达 |
| 2.3.3 自噬对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.3.4 自噬对猪胚胎发育的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 17β-雌二醇对猪卵母细胞体外成熟影响的规律 |
| 2.4.2 自噬在猪卵母细胞、卵丘细胞和颗粒细胞中高表达 |
| 2.4.3 自噬参与猪卵母细胞体外成熟 |
| 2.4.4 自噬参与猪胚胎发育 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 雌激素在猪卵母细胞体外成熟过程中对自噬的调控 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 雌激素在成熟卵母细胞中促进自噬的发生 |
| 3.3.2 雌激素在卵母细胞成熟过程中促进自噬的发生 |
| 3.3.3 Autophinib对成熟猪卵母细胞自噬的影响 |
| 3.3.4 雌激素重新激活成熟猪卵母细胞中Autophinib介导的自噬 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 17β-雌二醇促进成熟猪卵母细胞的自噬 |
| 3.4.2 17β-雌二醇抑制猪卵母细胞早期成熟中的自噬 |
| 3.4.3 Autophinib有效抑制猪卵母细胞的自噬活性 |
| 3.4.4 雌激素参与Autophinib调控的成熟猪卵母细胞的自噬活性 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 自噬在雌激素诱导下对猪卵母细胞氧化应激与凋亡的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 雌激素可以减缓自噬失活引起的氧化应激 |
| 4.3.2 雌激素可以降低自噬失活引起的线粒体分布紊乱和钙离子缺失 |
| 4.3.3 雌激素下调自噬失活引起的猪卵母细胞早期凋亡 |
| 4.3.4 自噬失活诱导猪卵母细胞凋亡的分子机制 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 自噬失活导致的氧应激可以被雌激素减缓 |
| 4.4.2 雌激素保护由自噬抑制导致的线粒体分布紊乱和钙离子缺失 |
| 4.4.3 雌激素通过介导自噬活性调节卵母细胞早期凋亡 |
| 4.4.4 雌激素通过介导caspase调节自噬失活导致的凋亡 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 自噬在雌激素诱导下调节猪卵丘-卵母细胞复合体间隙连接细胞通讯 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 雌激素调节猪卵丘-卵母细胞复合体的细胞间隙连接通讯 |
| 5.3.2 雌激素介导的自噬失活对细胞间隙连接的作用 |
| 5.3.3 雌激素介导的自噬失活对跨带突触表达的检测 |
| 5.3.4 雌激素介导的自噬失活抑制Cx43的磷酸化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 雌激素下调间隙连接通讯 |
| 5.4.2 雌激素下调自噬介导的猪卵丘-卵母细胞间隙连接通讯 |
| 5.4.3 雌激素下调自噬介导的跨带突触 |
| 5.4.4 雌激素通过自噬调节Cx43的磷酸化 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 雌激素对猪卵母细胞自噬调控的分子机制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验材料 |
| 6.2.2 试验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 雌激素对猪卵母细胞中GPR30表达的影响 |
| 6.3.2 雌激素通过介导GPR30信号传导促进猪卵母细胞减数分裂 |
| 6.3.3 MEK/ERK信号通路参与雌激素对GPR30的介导 |
| 6.3.4 雌激素通过MEK/ERK信号途径调控猪卵母细胞的自噬 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 雌激素维持猪卵母细胞体外成熟早期的GPR30表达 |
| 6.4.2 GPR30促进猪卵母细胞体外成熟 |
| 6.4.3 MEK/ERK信号通路参与雌激素介导的GPR30 |
| 6.4.4 GPR30通过MEK/ERK信号通路调节猪卵母细胞的自噬 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）排卵信号靶基因的分类分析与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的提出 |
| 1.2 排卵的定义与过程 |
| 1.3 排卵过程的调控 |
| 1.3.1 卵巢卵泡内细胞调控排卵过程 |
| 1.3.2 调控排卵的信号通路 |
| 1.3.3 调控排卵的关键基因 |
| 1.4 转录组测序揭示排卵规律 |
| 1.4.1 转录组测序揭示卵泡发育与排卵过程 |
| 1.4.2 LncRNA调控雌性生殖的研究进展 |
| 1.5 实验目的与意义 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验动物与细胞 |
| 2.2 主要实验试剂、材料及仪器 |
| 2.2.1 主要试剂和试剂盒 |
| 2.2.2 主要抗体 |
| 2.2.3 主要耗材 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.2.5 主要分析软件、作图工具和生物信息学网站 |
| 2.3 常用试剂配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 RNA提取与反转录 |
| 2.4.2 转录组测序 |
| 2.4.3 细胞核和细胞质的RNA分离 |
| 2.4.4 qRT-PCR |
| 2.4.5 细胞培养 |
| 2.4.6 细胞转染 |
| 2.4.7 检测细胞增殖方法 |
| 2.4.8 检测细胞凋亡方法 |
| 2.4.9 放射免疫法检测雌二醇和孕酮 |
| 2.4.10 Gm12840 基因敲除鼠构建与基因型鉴定 |
| 2.4.11 Gm12840 基因敲除小鼠生长曲线测定 |
| 2.4.12 超数排卵与配种实验 |
| 2.4.13 发情周期检测及抑制发情 |
| 2.4.14 切片制作与HE染色 |
| 2.4.15 切片分析 |
| 2.4.16 数据分析方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 排卵过程GCs转录组测序分析 |
| 3.2 受排卵信号诱导的差异基因的筛选与分析 |
| 3.2.1 编码分泌蛋白基因的筛选与分析 |
| 3.2.2 转录因子的筛选与分析 |
| 3.2.3 阶段表达基因的筛选 |
| 3.2.4 在排卵过程功能未知的基因的筛选 |
| 3.2.5 LncRNA的鉴定与分析 |
| 3.3 分别敲低GCs中 LncRNA Gm12840和Gm20186 抑制细胞增殖和激素合成,诱导细胞凋亡 |
| 3.3.1 敲低Gm12840与Gm20186 抑制GCs增殖 |
| 3.3.2 敲低Gm12840与Gm20186 促进GCs凋亡 |
| 3.3.3 敲低Gm12840与Gm20186 抑制GCs类固醇合成 |
| 3.4 敲除Gm12840 提高小鼠卵泡发育和排卵能力,但加速卵巢储备损耗 |
| 3.4.1 Gm12840 基因缺失小鼠发育卵泡数量增加和排卵效率提升 |
| 3.4.2 Gm12840 缺失加速卵巢衰老 |
| 3.4.3 Gm12840 调控排卵的分子机制 |
| 4 讨论 |
| 4.1 本研究系统的鉴定并分类了参与排卵调控的编码基因 |
| 4.2 本研究促进了参与排卵调控的LncRNAs的研究 |
| 4.3 本研究探究了LncRNA Gm12840 对雌性小鼠繁殖力的影响 |
| 5 结论 |
| 6 创新点与不足 |
| 6.1 创新之处 |
| 6.2 不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）姜黄素延缓卵巢早衰的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 第1章 姜黄素临床应用及其研究进展 |
| 1.1 姜黄素结构及其抗氧化应激机制研究进展 |
| 1.1.1 姜黄素的结构与理化性质 |
| 1.1.2 姜黄素的药理作用 |
| 1.1.3 姜黄素的作用机制 |
| 1.1.4 姜黄素作用的信号通路 |
| 1.1.5 姜黄素的应用 |
| 1.2 卵巢功能减退及其氧化应激机制的研究进展 |
| 1.2.1 高龄与卵巢的氧化应激 |
| 1.2.2 氧化应激是卵巢功能减退的重要病理因素 |
| 1.2.3 改善氧化应激成为治疗卵巢功能减退的重要策略 |
| 1.2.4 姜黄素在卵巢疾病中的应用前景 |
| 1.3 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 课题研究 |
| 第2章 姜黄素对卵巢早衰小鼠卵巢功能的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物和材料 |
| 2.1.2 实验分组和造模 |
| 2.1.3 各级卵泡计数 |
| 2.1.4 血液样本处理和激素水平检测 |
| 2.1.5 卵巢组织SOD和MDA水平检测 |
| 2.1.6 Q-PCR |
| 2.1.7 免疫组化 |
| 2.1.8 原位TUNEL荧光染色测定 |
| 2.1.9 Western-blot检测样本中蛋白表达 |
| 2.2 统计学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 姜黄素对下丘脑-垂体-性腺轴的保护作用 |
| 2.3.2 姜黄素对卵泡发育的影响 |
| 2.3.3 姜黄素对氧化应激的影响 |
| 2.3.4 姜黄素对卵巢细胞凋亡的影响 |
| 2.3.5 姜黄素对4-HNE、NTY8-OHdG和p16蛋白表达的影响 |
| 2.3.6 姜黄素对氧化应激相关信号通路的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 研究小结 |
| 第3章 姜黄素对卵巢颗粒细胞的氧化应激的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物和光照制度 |
| 3.1.2 材料 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 指标检测 |
| 3.2 统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 不同浓度姜黄素对卵巢颗粒细胞存活率的影响 |
| 3.3.2 姜黄素对外源性ROS引起的小鼠颗粒细胞凋亡作用 |
| 3.3.3 姜黄素对外源性ROS引起的小鼠颗粒细胞凋亡作用 |
| 3.3.4 姜黄素对卵巢颗粒细胞氧化应激信号通路的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 研究小结 |
| 第4章 姜黄素对小鼠胚胎体外发育的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物和光照制度 |
| 4.1.2 材料 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 姜黄素对受精率的影响 |
| 4.3.2 姜黄素对二细胞期胚胎形成率的影响 |
| 4.3.3 姜黄素对囊胚期胚胎形成率的影响 |
| 4.3.4 姜黄素对囊胚滋养外胚层和内细胞团细胞数量的影响 |
| 4.3.5 姜黄素对囊胚细胞凋亡的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 研究小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 主要创新点 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）小鼠不同阶段卵泡同步分离方法的初步建立及评估（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一、实验动物 |
| 二、试剂和仪器设备 |
| 1.主要试剂及配制 |
| 2.主要仪器设备 |
| 三、实验方法 |
| 1.卵巢获得 |
| 2.卵巢HE染色 |
| 3.卵巢组织酶解 |
| 4.滤网卵泡分离与富集 |
| 5.卵泡二轮过滤 |
| 6.收获卵泡的计数和直径测量 |
| 7.不同分组卵泡的活力评估 |
| 8.卵母细胞体外成熟、受精 |
| 四、数据分析 |
| 结果 |
| 一、卵巢HE切片 |
| 二、不同滤网获得的卵泡数目及卵泡直径 |
| 三、不同滤网获得卵泡的质量分析 |
| 1.卵泡形态与Trypan Blue染色卵泡存活率 |
| 2.卵泡基底膜完整性与卵泡活力的关系 |
| 3.跨透明带突起结构 |
| 4.卵泡线粒体功能 |
| 5.卵泡培养结果 |
| 6.卵母细胞体外成熟、受精结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 A 英文全称及缩略词 |
| 附录 B 个人简历 |
| 附录 C 综述 卵泡分离与收集和体外培养的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）低氧浓度对牦牛卵母细胞和附植前胚胎发育的影响及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物卵母细胞的成熟和附植前胚胎的发育及其细胞凋亡 |
| 1 卵母细胞的成熟 |
| 1.1 卵巢与卵泡的形成 |
| 1.2 卵母细胞体内发育过程 |
| 1.3 卵母细胞的成熟 |
| 1.4 卵丘细胞在卵母细胞成熟中的作用 |
| 2 孤雌激活 |
| 2.1 孤雌激活 |
| 2.2 孤雌激活方式 |
| 3 体外受精胚胎发育的影响 |
| 4 细胞凋亡 |
| 第二章 低氧浓度对哺乳动物卵母细胞的成熟和附植前胚胎的发育的影响 |
| 1 雌性哺乳动物生殖器官中氧浓度的变化及生理学作用 |
| 2 氧化应激 |
| 2.1 活性氧的产生及生理意义 |
| 2.2 活性氧对卵母细胞成熟和胚胎发育的作用 |
| 3 低氧对胚胎发育的影响 |
| 4 p38丝裂原活化蛋白激酶 |
| 实验研究 |
| 第三章 不同氧气浓度对牦牛卵母细胞及后续孤雌激活胚胎发育的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 卵母细胞的采集及体外成熟培养 |
| 1.3 卵母细胞成熟的评估 |
| 1.4 孤雌激活和胚胎发育的评估 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 牦牛COCs RNA的提取和反转录 |
| 1.7 qRT-PCR检测不同氧气浓度组牦牛COCs中与卵母细胞发育能力相关基因的表达 |
| 1.8 Western blotting检测不同氧气浓度组牦牛COCs中与卵母细胞发育能力相关蛋白的表达 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同氧气浓度对牦牛卵母细胞成熟的影响 |
| 2.2 不同氧气浓度对牦牛孤雌激活胚胎发育潜能的影响 |
| 2.3 不同氧气浓度对牦牛COCs中卵母细胞发育能力相关基因的表达影响 |
| 2.4 不同氧气浓度对牦牛COCs中卵母细胞发育能力相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 不同氧气浓度对牦牛卵母细胞HIF-1α和VEGF表达的影响及其与细胞凋亡的关联性分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 样品的采集及卵母细胞的体外成熟培养 |
| 1.3 免疫组织化学法检测HIF-1α和VEGF在牦牛卵巢中的定位 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 牦牛COCs总RNA的提取和反转录 |
| 1.6 qRT-PCR检测牦牛COCs中HIF-1α、VEGF及凋亡相关基因的表达 |
| 1.7 Westernblotting检测牦牛COCs中 HIF-1α、VEGF及凋亡相关蛋白的表达 |
| 1.8 不同氧气浓度下牦牛COCs的细胞凋亡检测 |
| 1.9 免疫荧光染色法检测不同氧气浓度组牦牛COCs中HIF-1α和VEGF蛋白的表达 |
| 1.10 数据分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 HIF-1α和VEGF在牦牛卵巢中的定位 |
| 2.2 不同氧气浓度对牦牛COCs中HIF-1α、VEGF及凋亡相关基因的表达影响 |
| 2.3 不同氧气浓度对牦牛COCs中HIF-1α、VEGF及凋亡相关蛋白的表达影响 |
| 2.4 不同氧气浓度对牦牛COCs中细胞凋亡的影响 |
| 2.5 不同氧气浓度组牦牛COCs中HIF-1α和VEGF蛋白的表达定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 不同氧气浓度对牦牛体外受精胚胎发育及其凋亡的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 卵母细胞的采集及体外成熟培养 |
| 1.3 牦牛卵母细胞的体外受精及胚胎发育的评估 |
| 1.4 牦牛囊胚的差异染色及细胞计数 |
| 1.5 牦牛囊胚的细胞凋亡检测 |
| 1.6 引物设计 |
| 1.7 牦牛囊胚RNA的提取和反转录 |
| 1.8 qRT-PCR检测牦牛囊胚中与胚胎发育能力以及凋亡相关基因的表达 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎发育的影响 |
| 2.2 低氧浓度对牦牛体外受精囊胚细胞数的影响 |
| 2.3 低氧浓度对牦牛囊胚细胞凋亡的影响 |
| 2.4 低氧浓度对牦牛体外受精囊胚中与胚胎发育和凋亡相关基因的表达影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎p38 MAPK和HIF-1α表达的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 卵母细胞的采集及体外成熟培养 |
| 1.3 牦牛卵母细胞的体外受精 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 牦牛不同阶段体外受精胚胎总RNA的提取和反转录 |
| 1.6 qRT-PCR检测牦牛不同阶段体外受精胚胎中p38MAPK和HIF-1α基因的表达 |
| 1.7 免疫荧光染色法检测不同阶段体外受精胚胎中p38MAPK和HIF-1α蛋白的表达 |
| 1.8 数据分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎中HIF-1α基因的表达影响 |
| 2.2 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎中p38 MAPK基因的表达影响 |
| 2.3 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎中HIF-1α蛋白的表达和定位 |
| 2.4 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎中p38 MAPK蛋白的表达和定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（6）补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 文献研究 |
| 综述一 原始卵泡激活与卵巢储备功能低下的研究进展 |
| 1 原始生殖细胞形成、迁移和增殖 |
| 2 性腺发育与性别决定 |
| 3 原始卵泡形成 |
| 4 原始卵泡激活 |
| 5 原始卵泡激活与卵巢储备功能低下 |
| 综述二 卵巢储备功能低下中医研究进展 |
| 1 病名的阐释 |
| 2 病因 |
| 3 病机 |
| 4 治疗 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 补肾促卵方安全性评价的研究 |
| 实验一 补肾促卵方急毒实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 补肾促卵方保护雷公藤多普诱导DOR小鼠卵巢储备功能的机制研究 |
| 实验二 补肾促卵方浓度筛选实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR通路保护原始卵泡池的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验四 补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3通路保护生长卵泡的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 补肾促卵方调控Nrf2/ARE通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（7）亚细亚酸对猪卵母细胞及早期胚胎体外发育影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第一章 卵母细胞及早期胚胎氧化应激的研究进展 |
| 1.1 氧化应激 |
| 1.2 氧化应激对卵母细胞质量的影响 |
| 1.3 氧化应激对早期胚胎发育的影响 |
| 第二章 亚细亚酸的研究进展 |
| 2.1 亚细亚酸的药理特性 |
| 2.2 亚细亚酸药物应用研究 |
| 2.3 亚细亚酸对氧化应激的缓解作用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 亚细亚酸对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 卵母细胞来源 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 实验用液制备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 卵母细胞的收集及成熟培养 |
| 1.2.2 卵母细胞的药物处理 |
| 1.2.3 卵母细胞的孤雌激活 |
| 1.2.4 早期胚胎的培养 |
| 1.2.5 体外受精 |
| 1.2.6 卵母细胞ROS、GSH染色 |
| 1.2.7 β-半乳糖苷酶染色 |
| 1.2.8 卵丘颗粒细胞的收集 |
| 1.2.9 流式细胞术检测卵丘颗粒细胞ROS和 GSH水平 |
| 1.2.10 流式细胞术检测卵丘颗粒细胞凋亡情况 |
| 1.2.11 Hoechst33342 染色 |
| 1.2.12 卵母细胞JC-1 染色 |
| 1.2.13 统计分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 亚细亚酸对卵母细胞成熟率的影响 |
| 1.3.2 亚细亚酸对孤雌激活早期胚胎发育率的影响 |
| 1.3.3 亚细亚酸对体外受精胚胎发育的影响 |
| 1.3.4 亚细亚酸对卵母细胞抗氧化能力的影响 |
| 1.3.5 亚细亚酸对卵母细胞线粒体的影响 |
| 1.3.6 亚细亚酸对卵母细胞衰老的影响 |
| 1.3.7 亚细亚酸对卵丘细胞的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 亚细亚酸对猪早期胚胎体外发育的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 卵母细胞及猪成纤维细胞来源 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验用液制备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 卵母细胞的收集及成熟培养 |
| 2.2.2 成纤维细胞分离 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 体细胞核移植 |
| 2.2.5 体外受精 |
| 2.2.6 早期胚胎培养 |
| 2.2.7 早期胚胎ROS、GSH水平的检测 |
| 2.2.8 早期胚胎的JC-1 染色 |
| 2.2.9 Hoechst33342 染色 |
| 2.2.10 RNA提取 |
| 2.2.11 RNA的反转录 |
| 2.2.12 实时光定量PCR |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 亚细亚酸对孤雌胚胎发育率的影响 |
| 2.3.2 亚细亚酸对孤雌胚胎囊胚质量的影响 |
| 2.3.3 亚细亚酸对孤雌胚胎细胞内抗氧化能力的影响 |
| 2.3.4 亚细亚酸对孤雌胚胎线粒体的影响 |
| 2.3.5 亚细亚酸对核移植胚胎发育率及质量的影响 |
| 2.3.6 亚细亚酸对核移植胚胎基因调控的影响 |
| 2.3.7 亚细亚酸对体外受精胚胎发育率及质量的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）氯喹对猪卵母细胞体外成熟的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪卵母细胞成熟研究进展 |
| 1.1.1 猪卵母细胞核成熟 |
| 1.1.2 卵母细胞胞质成熟 |
| 1.1.3 早期胚胎发育 |
| 1.1.4 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.2 溶酶体及其在细胞中的生理功能 |
| 1.2.1 溶酶体的生物学特性 |
| 1.2.2 溶酶体的生物发生及调控机制 |
| 1.2.3 溶酶体的生物学功能 |
| 1.2.4 溶酶体抑制剂 |
| 1.3 本项研究的目标、意义和内容 |
| 1.3.1 研究目标及意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 猪卵巢的获取 |
| 2.1.2 主要药品 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 实验器材 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 引物的设计与合成 |
| 2.1.7 主要分子生物学软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪卵母细胞采集和培养 |
| 2.2.2 卵丘扩展及核状态检测 |
| 2.2.3 活性氧检测(ROS染色) |
| 2.2.4 凋亡检测(Annexin-V染色) |
| 2.2.5 Real time-PCR |
| 2.2.6 免疫荧光染色 |
| 2.2.7 蛋白印迹杂交(Western blot) |
| 2.2.8 卵母细胞孤雌激活及胚胎培养 |
| 2.2.9 体外受精 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 溶酶体在猪卵母细胞体外成熟过程中的丰度变化与定位 |
| 3.2 溶酶体在猪卵母细胞体外成熟过程中的功能研究 |
| 3.2.1 抑制溶酶体导致猪卵母细胞核异常率上升 |
| 3.2.2 抑制溶酶体导致猪卵母细胞凋亡率上升 |
| 3.2.3 抑制溶酶体影响猪卵母细胞骨架组装 |
| 3.2.4 抑制溶酶体降低猪卵母细胞后续胚胎发育能力 |
| 3.3 溶酶体在猪卵母细胞自噬中的功能研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 溶酶体影响卵母细胞成熟的探讨 |
| 4.2 溶酶体影响细胞骨架的探讨 |
| 4.3 溶酶体影响卵母细胞发育潜能的探讨 |
| 4.4 溶酶体影响卵母细胞自噬的功能探讨 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 颗粒细胞和卵母细胞在哺乳动物卵泡闭锁和激素分泌中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵巢的基本结构和功能 |
| 1.1.2 卵泡发育的基本过程 |
| 1.1.3 卵泡发育的调控途径 |
| 1.1.4 颗粒细胞在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.5 卵母细胞的发育以及在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.6 颗粒细胞与卵母细胞的互作 |
| 1.2 Wnt-Ca~(2+)信号通路对卵泡发育的影响 |
| 1.2.1 Wnt通路概述以及Wnt-Ca~(2+)通路的组成 |
| 1.2.2 Wnt-Ca~(2+)通路在哺乳动物生理病理活动中的调节作用 |
| 1.2.3 Wnt-Ca~(2+)与Wnt典型通路的互作 |
| 1.2.4 Wnt-Ca~(2+)与其它信号通路的关系 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第二章 Wnt/PLC/Ca~(2+)信号变化对猪颗粒细胞活力和卵母细胞成熟的调控 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.2.3 试验动物来源 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 猪卵巢的采集 |
| 2.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 2.3.3 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.3.4 CCK8法测定颗粒细胞活力 |
| 2.3.5 卵母细胞成熟的判定 |
| 2.3.6 孤雌激活和早期胚胎培养 |
| 2.3.7 早期胚胎发育的评定 |
| 2.3.8 统计学数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.4.2 不同浓度IWP-2对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.3 不同浓度抑制剂U73122对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.4 不同浓度激活剂m-3M3FBS对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.5 不同浓度IWP-2对猪卵母细胞第一极体排出率的影响 |
| 2.4.6 不同浓度抑制剂U73122 或激活剂m-3M3FBS对卵母细胞成熟的影响. |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 IWP-2对Wnt/PLC/Ca~(2+)通路的抑制、对凋亡的促进及其对颗粒细胞激素的调控 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 猪卵巢的采集以及猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 3.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度的测定 |
| 3.3.3 猪颗粒细胞RNA提取和反转录 |
| 3.3.4 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因和激素调控基因的表达水平 |
| 3.3.5 Western Blot法检测凋亡相关蛋白和PLC四种亚基蛋白表达水平 |
| 3.3.6 统计学数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞中Ca~(2+)浓度的影响 |
| 3.4.2 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的影响 |
| 3.4.3 IWP-2对颗粒细胞雌二醇和孕酮调控基因的影响 |
| 3.4.4 IWP-2 对猪颗粒细胞和卵母细胞PLC四种亚基基因和蛋白表达的影响. |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 PLC蛋白对猪卵泡发育过程中细胞凋亡、激素分泌和Wnt/Ca~(2+)信号通路的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 4.3.2 颗粒细胞和卵母细胞的总RNA提取和反转录 |
| 4.3.3 实时荧光定量PCR检测凋亡、激素和Wnt/Ca~(2+)通路若干基因的表达 |
| 4.3.4 Western Blot法检测凋亡和Wnt/Ca~(2+)通路相关蛋白的表达 |
| 4.3.5 Annexin V-FITC法检测猪颗粒细胞凋亡 |
| 4.3.6 酶联免疫法(ELISA法)测定猪雌二醇和孕酮的含量 |
| 4.3.7 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度测定 |
| 4.3.8 统计学数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的调控 |
| 4.4.2 PLC蛋白对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的调控 |
| 4.4.3 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞Wnt/Ca~(2+)信号中PLC四个亚基、Ca~(2+)浓度、三个钙离子敏感蛋白和若干下游基因的调控 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 IWP-2与U73122或m-3M3FBS互作对猪卵泡Ca~(2+)的调节以及对颗粒细胞凋亡和激素的调节作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 5.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度检测 |
| 5.3.3 颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 5.3.4 实时荧光定量PCR检测颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 5.3.5 统计学数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对猪颗粒细胞和卵母细胞Ca~(2+)浓度的影响 |
| 5.4.2 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞凋亡调控基因的影响 |
| 5.4.3 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞激素调控基因的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 Enzastaurin或 Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞激素和凋亡的调节作用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要试验仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞的培养 |
| 6.3.2 猪颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 6.3.3 实时荧光定量PCR检测猪颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 6.3.4 Western Blot法检测猪颗粒细胞PKC蛋白表达的影响 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 Enzastaurin对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 6.4.2 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响 |
| 6.4.3 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮激素相关基因表达的影响 |
| 6.4.4 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对PKCβ蛋白表达的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 下一步研究工作 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）颗粒细胞miR-142、miR-33b和miR-423靶向调节TGFBR1和SMAD7参与PCOS发生机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表(ABBREVIATION) |
| 引言 |
| 第一部分 PCOS颗粒细胞中异常表达MIRNAS的检测及靶点预测验证 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二部分 颗粒细胞中MIR-142、MIR-33B和MIR-423生物学功能的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 全文总结 |
| 本文创新点 |
| 不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 多囊卵巢综合征相关MIRNAS的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、Can apoptosis analysis of cumulus granulosal cell evaluatethe potential vitality of replaced embryo?（论文参考文献）
- [1]雌激素对猪卵母细胞自噬的作用及调控[D]. 段家昕. 西北农林科技大学, 2021
- [2]排卵信号靶基因的分类分析与功能验证[D]. 刘清华. 华中农业大学, 2021
- [3]姜黄素延缓卵巢早衰的作用及其机制研究[D]. 严正杰. 扬州大学, 2021(02)
- [4]小鼠不同阶段卵泡同步分离方法的初步建立及评估[D]. 吴丹丹. 蚌埠医学院, 2021(01)
- [5]低氧浓度对牦牛卵母细胞和附植前胚胎发育的影响及其作用机制的研究[D]. 何翃闳. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [6]补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究[D]. 陈燕霞. 中国中医科学院, 2020(01)
- [7]亚细亚酸对猪卵母细胞及早期胚胎体外发育影响的研究[D]. 齐佳佳. 吉林大学, 2020(08)
- [8]氯喹对猪卵母细胞体外成熟的作用研究[D]. 苗佳坤. 东北农业大学, 2020(04)
- [9]Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制[D]. 陈华丽. 西北农林科技大学, 2020
- [10]颗粒细胞miR-142、miR-33b和miR-423靶向调节TGFBR1和SMAD7参与PCOS发生机制的研究[D]. 李艳. 郑州大学, 2020(02)