一、通过转基因改善家畜奶的品质（论文文献综述）
施海东[1]（2021）在《转基因技术助力乡村振兴》文中研究指明"转基因"这个词很多人都不陌生。前些年当时的中央电视台主持人崔永元坚决抵制转基因食品,使其进入广大人民群众的视野,在老百姓中掀起一股评论热潮。经过这些年的不断认识,转基因已经贴近我们的生活,全球主要生产国的转基因作物普及率已经达到90%,在美国超市,高达70%的产品中含有转基因成分,其他国家的人们也在消费这样的产品,尤其是那些没有要求转基因标识的国家和地区。比如我们身上穿的棉质衣服,90%是转基因棉花做成的,全世界80%的大豆是转基因的,90%的油菜是转基因的。文章主要围绕什么是转基因和目前转基因有哪些以及转基因技术助力乡村振兴进行简单阐述,希望更多的人了解转基因技术。
于海滨[2]（2020）在《线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响》文中认为随着畜牧业的快速发展和人类生活水平的提高,消费者对牛乳品质的需求也逐渐增加,对乳品质的要求也越来越高。牛乳品质性状是复杂经济性状,多基因共同调控其表型变化。随着后基因组学时代的到来,筛查与挖掘奶牛乳脂性状相关且具有重大遗传效应的候选功能基因,成为当前奶牛遗传育种科研工作者的主要挑战。甘油-3-磷酸酰基转移酶线粒体（GPAM）基因,属于GPAT基因家族,该基因定位在牛第26q22号染色体上。有研究表明,GPAM基因催化磷脂和甘油三酯（TG）生物合成的第一步反应。基于课题组前期组学分析结果,GPAM基因可能对牛乳脂代谢具有重要影响。本研究以GPAM为候选基因,在敲除细胞水平验证目的基因与牛脂质代谢的功能,同时在模式动物的基础上,解析GPAM基因对乳脂代谢的调控作用机制。利用CRISPR-Cas9技术,以牛乳腺上皮细胞为研究对象,构建GPAM基因敲除细胞系,同时利用本课题组前期构建的GPAM基因过表达和干扰载体,分别检测目的基因过表达、干扰和敲除后,基因m RNA和蛋白水平的表达情况,检测细胞内甘油三酯、胆固醇和脂肪酸含量,并利用RT-q PCR和Western-blot技术,在m RNA和蛋白水平上验证GPAM基因对牛乳脂代谢相关基因的调控作用。研究结果表明:目的基因敲除后,细胞内GPAM在m RNA和蛋白水平的表达均降低;GPAM基因敲除细胞系内的甘油三酯和胆固醇的含量相对于野生型细胞均显着降低;细胞内脂肪酸含量检测结果显示:GPAM基因过表达能够降低细胞内丁酸的含量,沉默GPAM基因能够促进细胞内丁酸和辛酸含量显着升高;GPAM基因敲除能够促进辛酸的含量增加;乳脂代谢相关基因表达量的检测结果显示:敲除GPAM基因能够降低细胞内脂代谢相关基因ACSL5、FABP3、HSL、PRSS2、AGPAT4的表达,进而调控乳脂代谢通路。GPAM基因转录组测序共获得360个上调基因和570个下调基因;差异基因中的352个基因共富集在3196个GO terms,其中613个GO terms显着富集,包括402个生物过程的GO terms,72个细胞成分GO terms和139个分子功能GO terms;差异表达基因中共富集237个Pathway,其中139个Pathway显着富集（P<0.05）,下调基因富集在78个通路中,上调基因富集在61个通路中。GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析结果表明,GPAM敲除后在对糖代谢信号通路的作用,主要是通过影响丙酸（PATH:00640）和丙酮酸（PATH:00620）代谢通路,使其表达水平上调,提示GPAM基因可能对丙酸和丙酮酸起调控作用,从而对细胞内糖酵解产生一定的影响。同时在转录组测序结果中也发现GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。根据转录组的数据分析结果表明;GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。转录组数据分析发现,GPAM基因参与丙酸、丙酮酸代谢进程,该基因敲除后细胞内丙酸、丙酮酸代谢发生了变化,预测可能对线粒体能量代谢和糖酵解产生影响。同时,GPAM基因作为一种线粒体基因,研究其表达对细胞线粒体功能的影响具有重要意义,根据以上推断我们展开了敲除细胞内线粒体能量代谢的研究。以牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系为研究对象,研究GPAM基因敲除后细胞中线粒体数量、线粒体呼吸能力、线粒体糖酵解速率、细胞对ATP需求的变化。线粒体能量代谢实验结果表明:在GPAM基因敲除细胞系中,细胞内线粒体呼吸能力降低。同时,GPAM敲除后导致线粒体糖酵解所需的重要调节酶活性降低,从而最终导致细胞线粒体糖酵解过程受到显着抑制。同时影响了细胞内Na+/K+的转运;敲除GPAM基因后细胞内线粒体含量减少。实验表明,敲除细胞中GPAM含量的降低导致了细胞线粒体氧化磷酸化和三羧酸循环过程受到显着抑制。以上这些结果都说明,GPAM的敲除能够影响乳腺上皮细胞的线粒体能量代谢。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,建立GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上验证基因表达调控作用。结果表明:GPAM基因敲除小鼠的生长、发育和繁殖无明显的变化。血清学检测结果发现:GPAM基因敲除小鼠的血清中甘油三酯含量显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）,而血清中胆固醇的含量变化并不显着;组织中甘油三酯和胆固醇的检测结果发现:敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织中甘油三酯、胆固醇的含量均显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）;小鼠乳汁甘油三酯酶联免疫吸附实验结果显示:与野生鼠相比,GPAM基因敲除小鼠乳汁中的甘油三酯含量明显降低（p<0.05）;组织形态学观察表明,敲除小鼠脂肪组织中脂肪细胞的胞体直径略小于野生型小鼠,肌间脂肪含量明显少于与野生型小鼠,乳腺组织中野生型小鼠的脂肪细胞的直径略大于敲除型小鼠,其他组织无明显形态学变化;乳腺组织的脂肪酸含量检测结果显示:敲除小鼠乳腺组织中肉豆蔻酸、棕榈硬脂酸、花生四烯酸盐和亚麻酸盐上显着高于野生型小鼠。本研究在前期转录组学分析的基础上,以GPAM为候选基因,在敲除细胞系水平上验证GPAM基因对细胞内脂肪酸、甘油三酯、胆固醇含量的影响,并对GPAM基因敲除细胞系进行转录组分析,解析该基因敲除后对乳脂代谢相关基因的分子机制;同时检测了敲除GPAM基因乳腺上皮细胞内线粒体活性及能量代谢改变情况,阐明GPAM基因是参与线粒体能量代谢的重要基因,并对糖酵解产生影响;构建了GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上进一步验证GPAM基因对乳脂代谢的调控作用。为奶牛乳脂性状的改良和新品种的培育提供优质的基因资源和理论基础。
毕美玉[3]（2020）在《利用CRISPR/Cas9构建DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠的研究》文中研究指明近年来,CRISPR/Cas9技术因操作简单、耗时短等优势被广泛应用于多个领域。在家畜育种方面,已经利用CRISPR/Cas9技术成功构建了多种动物模型,这些育种模型的构建对于家畜新品种培育具有重要的参考价值。肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）作为骨骼肌增殖分化和生长发育的负调控因子,它的缺失或低表达均会导致肌肉肥大。二酰甘油酰基转移酶1（Acyl Co A:diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1）是调控甘油三酯合成的唯一的关键酶,在动物机体的脂肪代谢、脂类沉积等过程中起着重要作用。该研究主要利用CRISPR/Cas9技术构建DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠模型,为培育产肉量高且肉质鲜美的优良家畜新品种提供研究基础。研究结果如下:1.Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体的构建首先,根据CRISPR Design软件设计了4对gRNA并筛选出剪切活性较高的gRNA（命名为1-1）,构建了T7-Cas9-gRNA表达载体和U6-Cas9-gRNA表达载体。此外,我们还以pc DNA3.0为骨架载体成功构建了针对MSTN位点的DGAT1定点整合载体。2.Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体在细胞水平的功能验证通过电穿孔转染法将构建成功的U6-Cas9-gRNA表达载体、DGAT1定点整合载体和pc DNA3.0空载体按不同的组合及比例转入C2C12细胞中。通过PCR检测发现在同时转入U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体组中随机整合鉴定和定点整合鉴定均出现了符合预期的条带。通过实时定量PCR检测发现,在转入U6-Cas9-gRNA表达载体组以及同时转入U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体组中,MSTN基因在mRNA水平的表达量均低于转入空载体组和未经转染组,而在同时转入U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体组中DGAT1基因的表达量则明显高于转入U6-Cas9-gRNA表达载体组、转入空载体组和未经转染组。结果表明,所构的U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体不仅能实现DGAT1基因在MSTN基因位点的定点整合,还可以在mRNA水平实现MSTN基因低表达的同时DGAT1基因高表达。3.基因编辑小鼠模型的制备及鉴定通过原核注射技术将gRNA和Cas9 mRNA以及线性化的DGAT1定点整合载体注射到小鼠受精卵的原核中来制备基因编辑小鼠模型。本实验中,我们共获取4006枚小鼠受精卵,挑选其中状态良好的3041枚受精卵进行了原核注射,体外培养获得2082枚胚胎,将其移植到61只ICR代孕母鼠体内,共出生124只小鼠,最终存活111只,经PCR鉴定我们发现有4只DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠,1只DGAT1基因随机整合且MSTN基因敲除小鼠,8只DGAT1基因随机整合小鼠,8只MSTN基因敲除小鼠,出生率为5.95%,阳性率为16.93%,定点整合效率为3.2%。
胡豪[4]（2019）在《CRISPR/Cas9腺病毒直接注射法制备肌肉抑制素（MSTN）基因敲除鸡的研究初探》文中提出肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）,又称生长分化因子8（Growth differentiation factor 8,GDF-8）,是TGF-β超家族成员之一。MSTN是肌细胞生长发育的负调控因子,MSTN基因变异可引起动物的“双肌”性状,从而提高动物的产肉性能。CRISPR/Cas9技术是近年发展起来的基因定点修饰技术,它有制作简单、成本低、作用效果高等特点。鸡胚体内直接注射法,即将基因编辑工具与投递载体（如脂质体、病毒等）注入到鸡胚体内,直接转染体内的PGC从而生产性腺嵌合体鸡胚,实现基因编辑鸡的制备。本研究探讨了采用不同开口位置,封口条件,注射部位对鸡胚存活率和孵化率的影响,并将腺病毒直接注射法和CRISPR/Cas9技术结合,选择鸡MSTN基因作为靶位点,设计gRNA对鸡胚中MSTN基因进行定点敲除,为腺病毒直接注射法制备肌肉抑制素基因敲除鸡奠定基础。采用不同的开口方式,封口条件,注射位置研究其对鸡胚存活率和孵化率的影响。采用赤道面开口,LSD-高弹性密封胶封口,外周静脉注射GFP腺病毒探究其在鸡胚不同位置的转染效率。结果显示采用赤道面开口、密封胶封口、外周静脉注射种蛋对其孵化率影响较低;GFP病毒在种蛋中的转染效率符合后续实验要求。将设计的gRNA腺病毒和CRSIPR/Cas9腺病毒共同转染到鸡胚成纤维细胞中,采用T7EI酶切法检测其切割效率。随后使用上文中优化的赤道面开口、LSD-高弹性密封胶封口、外周静脉注射将CRSIPR/Cas9腺病毒和gRNA腺病毒注射到鸡胚中,孵化12天后提取性腺DNA,通过PCR检测MSTN基因的敲除效率。结果显示使用腺病毒作为投递载体能获得高效的CRISPR基因编辑效,使用CRISPR腺病毒直接注射法能获得MSTN大片段基因敲除的性腺嵌合体鸡胚。
赵鲜红[5]（2016）在《TALEN介导的foxo3a敲除小鼠和水牛源ALK6点突变转基因小鼠的表型研究》文中研究指明研究报道,foxo3a在水牛、猪、鼠类卵泡发育启动方面起着重要作用,foxo3a-/-雌鼠会出现早期全球卵巢卵泡募集,随后会出现卵巢内卵母细胞提前耗尽,造成雌鼠出现早期卵巢功能衰竭和继发性不孕症。自然突变ALK6的Booroola羊即FecB突变类型,单拷贝突变（基因型B+）母羊多产1.11羔,双拷贝突变（基因型BB）增加1.40-1.50只羊羔。故本研究以51bpfoxo3a基因敲除小鼠和水牛源ALK6点突变转基因小鼠为模型,观察其对小鼠产仔数及相关基因表达模式的影响。TALEN-foxo3a基因编辑小鼠：建立了TALEN-foxo3a基因编辑小鼠（缺失51bp）的PCR鉴定方法,琼脂糖凝胶电泳PCR产物,foxo3a-/-基因编辑小鼠602bp单一条带,野生小鼠653bp单一条带,foxo3a-/+小鼠602bp和653bp两条带。应用T7E1酶切断基因编辑切口,对PCR产物进行酶切鉴定,可以观察到foxo3a-/+小鼠产生3条带,foxo3a-/-基因编辑小鼠与野生型小鼠为单一大小不同条带。进一步分析653bp的野生型小鼠基因组序列酶切位点含有第270位、第285位和第543位3个PSTI酶切位点,因此野生型小鼠的PCR产物可酶切为110bp和260bp左右的两条带；单敲小鼠的DNA序列能酶切为543bp、110bp和260bp左右的三条带；双敲小鼠DNA序列仅能酶切为543bp和110bp两条带。生物信息分析显示酶切的51bp中恰好包含了foxo3a的第32位苏氨酸位点,一个重要的磷酸化位点。选择foxo3a-/+（?）foxo3a-/+的组合进行交配,对后代鼠进行PCR电泳、PCR加酶切以及测序鉴定显示：后代总生仔数43只,其中单敲阳性数位24只,单敲阳性率为55.81%,双敲阳性数位9只,双敲阳性率为20.93%,总阳性率为76.74%,阳性率符合孟德尔遗传定率。选择鉴定出foxo3a-/-母鼠,对其产仔数进行统计,共统计4窝,平均生仔数为7±1.02a,显着低于野生小鼠9.71±0.71（P<0.01）。单敲小鼠foxo3a-/+产仔数共统计13窝,平均生仔数为7.38±0.54只,亦显着低于野生型小鼠（P<0.05）。单敲小鼠和野生型小鼠交配共统计生仔数8窝,平均生仔数为7.88±0.35只。利用SPSS分析结果显示：相对于野生型小鼠,双敲小鼠产仔数显着下降（P=0.013）,单敲小鼠产仔数也显着下降（P=0.015）,双敲小鼠和单敲小鼠产仔数差异不显着（P=0.674）。水牛ALK6点突变FecB基因转基因小鼠：为了探讨ALK6点突变FecB基因是否能够提高水牛繁殖力,本实验以水牛源ALK6点突变转基因小鼠为模型,观察了其产仔数和基因表达变化情况。结果显示：小鼠和水牛ALK6基因编码的氨基酸个数相同均为502个,均无信号肽,分子质量分别为56.9444Kda和56.9234Kda,等电点分别为7.48和7.78,亚细胞定位均在质膜,在374位都有一个磷酸化位点,第24位、第109位和第284位均有糖基化修饰位点。水牛源ALK6点突变转基因小鼠平均生仔数为11.6±0.91只,比野生型小鼠平均生仔数9.71±0.71只多1.89只,但两者统计学差异不显着（P=0.297,P>0.05）。QRT-PCR定量结果显示水牛源ALK6点突变转基因小鼠卵巢和睾丸组织中的小鼠ALK6基因相对野生型小鼠表达量均显着下降（P<0.05）。水牛源ALK6点突变转基因小鼠卵巢和睾丸中水牛ALK6基因相对于鼠内源ALK6基因表达量均较低。在水牛源ALK6点突变转基因小鼠的卵巢和睾丸中,小鼠ALK6基因和水牛ALK6基因表达量之和均低于野生型小鼠卵巢和睾丸中小鼠本身ALK6基因。结论：水牛源ALK6突变转基因小鼠产仔数有增加,但差异不显着,这与转基因小鼠卵巢中ALK6基因表达的下调有一定的联系。结论：本研究为阐明foxo3a和FecB基因参与哺乳动物繁殖效率的分子机制研究奠定了基础。
郝蕾[6]（2016）在《浅谈转基因食品现状及其安全性》文中指出从世界上最早的转基因作物（烟草）于1983年诞生,1994年第一例转基因番茄"FLAVR SAVR"在美国商业化种植以来,转基因作物种植面积在全球快速增长,从1996年的170万hm2增长至2012年的1.7亿hm2[1],16年间增加了100倍,使得转基因技术成为现代农业化史上应用最迅速的作物育种技术。转基因食品的研发迅猛发展,产品品种及产量也成倍增长,转基因作为一种新兴的生物技术手段,它的
王友华,孙国庆,连正兴[7]（2015）在《国内外转基因生物研发新进展与未来展望》文中认为近年来,转基因技术在研发方面取得了全球化性进展,被誉为有史以来应用最快的技术,已显示出巨大的经济效益、社会效益和生态效益,未来将在满足国家粮食安全、生态安全、人民健康需求等方面发挥不可替代的作用。重点介绍了转基因技术在动植物领域的国内外重大研发进展,并对转基因技术的未来发展进行了展望,对分析当前的转基因技术研究和市场应用具有一定的参考价值。
张强[8]（2014）在《体细胞核移植技术制备转GH基因奶山羊的研究》文中研究指明全世界有190多个国家饲养奶山羊,我国是奶山羊存栏量最多的国家。但我国奶山羊个体的年均奶产量普遍偏低。如何改良奶山羊品种,提高奶山羊的个体产奶量已成为畜牧工作者亟需解决的问题。生长激素（growth hormone, GH）在乳腺发育和泌乳过程中发挥着重要作用。GH不仅可以促进乳腺发育,而且能维持泌乳期乳腺上皮细胞的数量,进而增加奶产量。因此,本研究选用GH作为目的基因,通过体细胞核移植技术培育高产奶量的转基因奶山羊新品种。首先,通过分子克隆技术,利用p-LG基因启动子元件构建能够在乳腺中特异性表达GH的载体pcGH,然后将载体转染到分离培养纯化的乳腺上皮细胞中,验证该载体能在体外分离的乳腺上皮细胞中表达GH；其次,采用电转染的方法将线性化的载体pcGH转染到分离培养的山羊胎儿成纤维细胞中,通过G418药物筛选转GH基因阳性细胞。进一步将转GH基因阳性细胞移植到去核的卵母细胞中,经融合激活待其发育到囊胚或桑椹胚后,移植到代孕母羊子宫中生产F0代克隆奶山羊；再次,通过普通PCR、Southern-blot、荧光定量PCR和TAIL-PCR等技术方法检测了外源基因在FO代克隆羊基因组中的整合情况；最后,为了评估转入的GH基因对奶山羊的影响,对F0代转GH基因奶山羊的生长发育、生理情况、乳腺发育及产奶量等生产性能进行跟踪检测,同时为了评估转GH基因奶山羊羊奶的安全性,将F0代转GH基因奶山羊羊奶饲喂羔羊,跟踪检测小羊的生长发育及生理情况,以期获得高产奶量的转基因奶山羊。主要试验内容分为以下四个部分：1山羊乳腺特异性表达载体pcGH的构建及其验证本部分试验的研究目的是构建能够在山羊乳腺中特异性表达的载体pcGH,并在体外分离培养的山羊乳腺上皮细胞中验证其生物学功能。首先,以萨能奶山羊为材料,从山羊的血液中提取基因组,采用PCR的方法克隆得到包含山羊β-乳球蛋白启动子区、外显子1在内的5’端调控序列（p-LG5）和包含外显子6、7及终止子在内的3’端调控序列（β-LG3）,同时利用RT-PCR的方法,从山羊的脑垂体中,克隆得到山羊gh基因；其次,以真核表达载体pV为骨架载体,先将克隆得到的β-LG5基因插入到XhoI位点处,然后再将gh基因插入到β-LG5基因的下游末端EcoRI位点处,再将克隆的β-LG3基因克隆到gh基因的下游末端SalI位点处,构建乳腺特异性表达载体并命名为pcGH。经PCR和酶切验证载体构建正确,且测序结果无碱基突变,说明乳腺特异性表达载体pcGH构建正确。为了验证所构建的载体能够在乳腺上皮细胞中表达,我们通过组织块培养法从泌乳期的乳腺中分离山羊乳腺上皮细胞,并通过差异消化法对乳腺上皮细胞进行纯化,纯化的细胞经免疫组化的方法验证其为上皮细胞；最后,通过脂质体转染的方法,将乳腺特异性表达载体pcGH转染到体外培养的乳腺上皮细胞中。于48 h、60 h、72 h分别收集细胞上清液进行ELISA检测,检测结果表明：转染pcGH到山羊乳腺上皮细胞48 h后,GH表达量极显着高于未转染组（P<0.01）,而60 h,72hGH表达量有所下降,但仍显着高于未转染组（P<0.05）。以上结果表明,乳腺特异性表达载体pcGH能在培养的乳腺上皮细胞中表达GH蛋白。这些结果为下一步制备在乳腺中特异性表达GH的转基因奶山羊提供了保障。2转GH基因阳性克隆细胞的筛选及转GH基因奶山羊的制备本部分研究的目的是分离培养山羊胎儿成纤维细胞,转染并筛选转GH基因阳性克隆细胞,同时用激素超排的方法获得卵母细胞,通过体细胞核移植技术制备转GH基因奶山羊。首先,通过组织块培养法,分离培养了山羊胎儿成纤维细胞,PCR方法鉴定分离的山羊胎儿成纤维细胞为雌性。然后使用电转染的方法,将线性化的山羊GH乳腺特异性表达载体pcGH转染到山羊胎儿成纤维细胞中。在转染48 h后,更换培养基添加G418 （500μg/mL）进行抗性筛选,在12 d左右出现明显的克隆团。挑取单克隆细胞团传至48孔板中继续培养,同时将G418浓度减半,待细胞长至80%-90%时,收集细胞,经PCR验证共获得GH阳性细胞65个。饥饿处理后,冻存作为核移植的供体细胞；其次,采用超排处理,从37只供体母羊中共获取卵母细胞388枚,作为核移植的受体细胞；核移植后供融合卵数337枚,融合卵数264枚,融合率为78.34%,激活后获得重构胚254枚。其中115枚重构胚直接移植到受体羊输卵管中,共移植受体羊17只；另138枚重构胚用琼脂包埋,先移植到寄母羊输卵管中,体内培养5 d后,回收胚126枚,其中发育到囊胚期64枚,将胚移植受体母羊子宫中,共移植39只,每只移植1-2枚。合计移植56只受体羊,至35 d检测有26只怀孕。最后,获得6只存活的克隆羊。这些结果为下一步转GH基因奶山羊的鉴定奠定了基础。3转GH基因奶山羊的鉴定本研究的目的是对前期研究获得的F0代转GH基因奶山羊外源基因整合的情况进行鉴定和分析。首先,通过普通PCR和Southern-blot的方法检测,构建的乳腺特异性表达pcGH在F0代转GH基因奶山羊基因组中的整合情况；其次,再通过绝对荧光定量PCR和热不对称交互式PCR （TAIL-PCR）的方法来测定转GH基因拷贝数和整合位点；最后,采用旁侧PCR对获得的整合位点进行验证。PCR和Southern-blot结果表明,所获得的克隆羊均整合有转GH基因构件；荧光定量PCR结果表明：GHcd-2、GHcd-7转GH基因奶山羊的拷贝数分别为12.95±0.18、12.24±1.12。TAIL-PCR检测结果表明：经BLAST比较分析,GHcd-2、GHcd-7两只转GH基因奶山羊外源基因分别整合到基因组3号和11号染色体上。这些结果为转GH基因奶山羊的安全性评价奠定了基础。4转GH基因奶山羊的初步安全性评价本研究的目的是在前期对F0代转GH基因奶山羊的拷贝数及整合位点鉴定的基础上,进一步对转入GH基因的奶山羊自身安全性及转GH基因奶山羊羊奶的安全性进行初步评价。首先,通过对FO代转GH基因奶山羊的生长发育性能进行跟踪观察和测定,研究外源基因对奶山羊自身生长发育性能的影响。结果发现,F0代转GH基因奶山羊的生长发育情况与非转基因奶山羊无显着差异（P>0.05）；通过对FO代转GH基因奶山羊血常规指标、血液生理生化指标进行定期检测,研究外源基因对山羊生理的影响。结果表明,F0代转GH基因奶山羊的各项生理生化指标均在正常范围之内并且与非转基因奶山羊无差别（P>0.05）。而在FO代奶山羊配种后至妊娠后期,转GH基因奶山羊乳围、乳宽及乳头间距等极显着大于非转基因奶山羊（P<0.01）。泌乳初期,转GH基因奶山羊的产奶量显着高于非转基因奶山羊（P<0.05）；而乳成分分析表明,转GH基因奶山羊羊奶的乳成分和非转基因奶山羊羊奶无显着差异（P>0.05）。表明转GH基因奶山羊在增加奶产量的同时,并没有改变羊奶中各乳成分所占的比例。Western-blot检测表明GH在奶中高表达,说明构建的载体能够在乳腺中表达GH蛋白；将F0代转GH基因奶山羊的羊奶饲喂羔羊,检测小羊的生长发育及生理生化指标,结果发现小羊的生长发育及生理并未受到不良影响（P>0.05）。本研究初步获得了泌乳初期产奶量显着增加的转GH基因奶山羊,并对FO代转GH基因奶山羊及其羊奶的安全性进行了初步评估,为今后培育高奶产量的转基因奶山羊提供参考。
郜富权[9]（2013）在《乳腺特异性表达人溶菌酶转基因小鼠的研究》文中认为溶菌酶，又称胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶,属于天然的非特异性免疫物质。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。它广泛分布于人和动物多种组织、分泌物以及某些植物和微生物中。溶菌酶在人乳中的含量约为0.5mg/ml，比其他哺乳动物如牛、绵羊和山羊乳含量高出1500～4000倍。并且溶菌酶在人乳中破坏和溶解细菌的能力约为牛乳的300倍，是人乳中的一种重要的抗菌因子。乳中含有的溶菌酶可破坏大多数革兰氏阳性菌和少量阴性菌的细胞壁,有利于婴儿肠道正常菌群的建立和提高抗病能力。随着社会的发展日新月异，人们对奶制品需求增加的同时，奶制品的质量也越来越引起人们的关注。通过生物学手段对某些哺乳动物进行转基因改造，经动物乳腺生物反应器使其产出的奶组分及活性类似于人奶，不仅增加了奶的营养价值，同时还可作为保健品饮用。以小鼠为模型进行乳腺特异性表达人溶菌酶的研究为牛乳人乳化及转基因动物乳腺生物反应器的进一步应用奠定了工作基础。本研究设计并构建了pMarBLGprobianhlyts及pMarBLGpro2bianhlyts两种乳腺特异性真核表达载体。pMarBLGprobianhlyts载体包括溶菌酶基因序列，基质附着区（Mar）序列，β-乳球蛋白一部分启动区序列（转录起始位点上游5kb）,β-乳球蛋白基因的所有转录单元及其3’侧翼区（BLGbian）序列。该载体多克隆位点位于β-乳球蛋白基因翻译起始位点的5’端；pMarBLGpro2biants载体除在pMarBLGprobianhlyts启动区序列5’端去掉1kb可能具有抑制外源基因表达的负调控原件外，其余序列同pMarBLGprobianhlyts载体。将两种乳腺特异性表达结构进行原核期胚胎的显微注射制备转基因小鼠。pMarBLGprobianhlyts经PCR鉴定得到了1号（♂）,2号（♀）,11号（♂）,42号（♂）四只转基因阳性鼠，转基因阳性率约6.7％。经PCR检测，每一个原代鼠系（Founder Line）的F1代都检测到了转基因阳性小鼠。经Western Blotting检测，在各转基因阳性母鼠及F1代阳性母鼠的乳汁中，可以检测到重组人溶菌酶的表达，随后进行的酶活测定显示该酶具有生物学活性。pMarBLGpro2bianhlyts经PCR鉴定得到了5号（♀）,9号（♂）,10号（♂）,12号（♂）四只转基因阳性鼠，转基因阳性率约5％。经PCR检测，每一个原代鼠系（Founder Line）的F1代也都检测到了转基因阳性小鼠。经Western Blotting检测，在各转基因阳性母鼠及F1代阳性母鼠的乳汁中，检测到了重组人溶菌酶的表达，同时酶活测定表明该酶具有生物学活性。
余大为[10]（2012）在《α干扰素在牛转基因细胞和核移植胚胎中的表达与功能研究》文中提出乳房炎和口蹄疫是危害奶牛养殖业两种严重的疾病，本研究旨在运用转基因克隆技术在牛的乳腺中特异表达乳铁蛋白肽以抵抗乳房炎，全身细胞内表达α干扰素以抵抗口蹄疫，研制同时抵抗细菌性和病毒性疾病的转基因奶牛新品种。本研究构建了山羊β-酪蛋白启动子调控的牛乳铁蛋白肽基因和CMV启动子调控的人α干扰素基因（切除信号肽）的载体，以neo基因为筛选基因，EGFP为标记基因。通过酶切鉴定，分别得到10kb和7.9kb+2.1kb的条带，与预期一致，表明载体构建正确。本研究采用人工授精妊娠40天的高产荷斯坦奶牛胎儿，通过酶消化法和贴壁法建立牛胎儿成纤维细胞系。运用FuGENE脂质体和Amaxa Nucleofector电转法转染，G418筛选后得到转基因细胞克隆，扩大培养后得到转基因细胞系。针对α干扰素基因和乳铁蛋白肽基因设计两对引物对两株转基因细胞进行PCR鉴定，两株转基因细胞分别扩增出550bp和450bp左右的目的条带。最后用Western blot检测到转基因细胞中α干扰素蛋白的表达。将水泡口炎病毒（VSV）感染转干扰素基因细胞，结果表明转干扰素基因细胞与对照组相比能显着抑制VSV病毒的增殖；并且感染VSV的转干扰素细胞能诱导干扰素诱导的经典抗病毒途径中的三个关键基因PKR、OAS和P53基因的表达，启动细胞凋亡机制（凋亡比例77.03%）以抵抗病毒的增殖。运用无透明带融合法制备了转基因克隆胚胎，与显微注射法相比能显着提高融合率。运用PCR在克隆胚胎中检测到了目的基因，运用免疫荧光检测到转基因克隆胚胎中α干扰素蛋白的表达。比较了两种最常用的细胞同期化处理方法血清饥饿和接触抑制对核移植效率的影响，二者无显着差异；比较了两种激活方法A23187+6-DMAP和离子霉素+6-DMAP，两者的核移植效率无显着差异；比较了转基因克隆和非转基因克隆胚胎的发育和妊娠率，均无显着差异。胚胎移植受体牛46头，妊娠5头，流产3头，出生2头。在出生转基因克隆牛的组织中观察到荧光，通过PCR检测到出生的转基因克隆牛携带有目的基因。建立了转基因牛耳成纤维细胞系，并进行了再克隆。
二、通过转基因改善家畜奶的品质（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、通过转基因改善家畜奶的品质（论文提纲范文）
（1）转基因技术助力乡村振兴（论文提纲范文）
| 1 什么是转基因技术 |
| 1.1 转基因调查数据 |
| 1.2 转基因是一门科学技术 |
| 1.3 转基因作物 |
| 1.4 我国转基因作物情况 |
| 1.5 转基因动物情况 |
| 1.6 转基因技术与生物医药 |
| 2 转基因技术和乡村振兴 |
| 2.1 农民需要优质种子 |
| 2.2 解决劳动力不足，提升田间管理效能 |
| 2.3 一粒种子一粒金 |
| 2.4 以转基因棉花为例 |
| 3 未来展望 |
| 3.1 掌握核心技术 |
| 3.2 做好宣传 |
| 4 结束语 |
（2）线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 GPAM基因的研究进展 |
| 1.1 GPAM基因家族基因 |
| 1.2 GPAM基因的生物学作用 |
| 1.3 线粒体GPAM的功能 |
| 1.4 酵母中的GPAT表达 |
| 1.5 GPAM在甘油三酯合成中的调控作用 |
| 1.6 结语 |
| 第二章 影响乳品质的重要因素及乳脂代谢通路的研究进展 |
| 2.1 甘油三酯的在乳品质评价中意义 |
| 2.2 哺乳动物乳腺中的甘油三酯合成 |
| 2.3 乳脂代谢相关基因的简介 |
| 2.4 多不饱和脂肪酸在乳脂中的调控作用 |
| 2.5 乳汁中的甘油三酯表达 |
| 2.6 结语 |
| 第三章 线粒体基因及线粒体能量代谢的研究进展 |
| 3.1 线粒体的主要功能 |
| 3.2 线粒体在生命活动中的重要意义 |
| 3.3 线粒体在细胞死亡过程中的作用 |
| 3.4 线粒体能量代谢 |
| 3.5 结语 |
| 第四章 基因编辑技术的研究进展 |
| 4.1 转基因技术概况 |
| 4.2 精原干细胞技术 |
| 4.3 原始生殖细胞技术 |
| 4.4 胚胎干细胞基因打靶技术 |
| 4.5 条件基因靶向技术 |
| 4.6 诱导多能干细胞技术 |
| 4.7 CRISPR-CAS9 技术 |
| 4.8 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系的建立及其对细胞内乳脂代谢的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验用酶 |
| 1.1.4 其他药品及试剂 |
| 1.1.5 试剂的配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.2.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆及鉴定 |
| 1.2.3 GPAM基因敲除靶位点的设定以及sg RNA的设计 |
| 1.2.4 gRNA的体外筛选 |
| 1.2.5 GPAM基因g RNA表达载体的构建 |
| 1.2.6 细胞培养及传代 |
| 1.2.7 敲除载体的的转染 |
| 1.2.8 细胞内编辑效率验证 |
| 1.2.9 敲除细胞的筛选、培养及鉴定 |
| 1.2.10 实时荧光定量PCR和 Western Blot检测候选基因的表达 |
| 1.2.11 GPAM基因表达载体与干扰载体鉴定 |
| 1.2.12 细胞内甘油三酯和胆固醇含量检测 |
| 1.2.13 细胞内脂肪酸含量的测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.3.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆和鉴定 |
| 1.3.3 gRNA浓度的测定 |
| 1.3.4 gRNA的体外筛选结果 |
| 1.3.5 敲除载体的构建及细胞转染 |
| 1.3.6 细胞内敲除效率验证 |
| 1.3.7 阳性细胞测序验证 |
| 1.3.8 GPAM过表达和干扰载体鉴定与检测结果 |
| 1.3.9 牛GPAM基因敲除后细胞内m RNA和蛋白表达的检测 |
| 1.3.10 GPAM基因表达对细胞内甘油三酯含量的影响 |
| 1.3.11 GPAM基因表达对细胞内胆固醇含量的影响 |
| 1.3.12 GPAM基因表达对细胞内脂肪酸含量的影响 |
| 1.3.13 GPAM敲除对脂代谢相关基因的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 其他药品及试剂 |
| 2.1.4 试剂的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA提取及质量检测 |
| 2.2.2 文库建立及测序 |
| 2.2.3 原始数据质量控制 |
| 2.2.4 Mapping结果统计及基因结构分析 |
| 2.2.5 差异基因表达分析 |
| 2.2.6 差异基因GO富集和KEGG分析 |
| 2.2.7 差异基因表达水平验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细胞总RNA提取及检测 |
| 2.3.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序数据筛选及分析 |
| 2.3.3 差异表达基因分析 |
| 2.3.4 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3.5 差异基因蛋白互作预测分析 |
| 2.3.6 GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析 |
| 2.3.7 基因共表达网络关系预测分析 |
| 2.3.8 差异基因的表达水平验证 |
| 2.3.9 GPAM基因对甘油三酯合成相关基因的调控作用 |
| 2.3.10 GPAM基因对脂肪酸合成相关基因的调控作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛GPAM基因对乳腺上皮细胞线粒体能量代谢的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 其他药品及试剂 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞线粒体的提取 |
| 3.2.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体呼吸的检测 |
| 3.2.3 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.2.4 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.2.5 敲除细胞对ATP 需求的影响 |
| 3.2.6 细胞线粒体数量的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敲除细胞中线粒体呼吸的检测 |
| 3.3.2 敲除细胞中线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.3.3 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.3.4 GPAM基因敲除后细胞内线粒体数量的改变 |
| 3.3.5 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中三羧酸循环检测分析 |
| 3.3.6 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中氧化磷酸化检测分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于敲除小鼠模型验证GPAM基因对脂肪代谢的调控作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 其他药品及试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 分析软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 GPAM基因敲除小鼠模型的制备 |
| 4.2.2 GPAM基因敲除小鼠的扩繁 |
| 4.2.3 GPAM基因敲除小鼠的鉴定 |
| 4.2.4 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.2.5 目的基因敲除小鼠相关生长性状的测定 |
| 4.2.6 组织形态学的检测 |
| 4.2.7 敲除小鼠血清学相关指标的检测 |
| 4.2.8 敲除小鼠组织中甘油三酯和胆固醇含量的检测 |
| 4.2.9 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的检测 |
| 4.2.10 敲除小鼠组织中脂肪酸成分及含量的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 敲除小鼠的阳性鉴定 |
| 4.3.2 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.3.3 目的基因敲除小鼠相关生长性状测定 |
| 4.3.4 目的基因敲除小鼠各组织形态学分析 |
| 4.3.5 敲除小鼠血清中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.6 敲除小鼠血清中胆固醇含量的测定 |
| 4.3.7 敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织甘油三酯和胆固醇含量的测定 |
| 4.3.8 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.9 敲除小鼠乳腺脂肪酸含量的测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表的文章及专利 |
| 致谢 |
（3）利用CRISPR/Cas9构建DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 家畜育种中MSTN基因、DGAT1基因及CRISPR/Cas9系统的研究概述 |
| 1 MSTN基因在家畜育种以及医学领域中的应用 |
| 1.1 MSTN基因概述 |
| 1.2 MSTN基因的生物学功能及调控机制 |
| 1.2.1 MSTN基因参与调控肌肉的生长发育 |
| 1.2.2 MSTN基因参与调控脂肪形成 |
| 1.2.3 MSTN基因参与调控生殖过程 |
| 1.2.4 MSTN基因参与调控骨密度 |
| 1.3 MSTN基因的应用前景 |
| 1.3.1 MSTN基因在家畜育种中的应用 |
| 1.3.2 MSTN基因在医学领域中的应用 |
| 1.4 总结与展望 |
| 2 DGAT1基因与家畜生产性状的关系及其在构建小鼠模型中的研究 |
| 2.1 DGAT1基因概述 |
| 2.2 DGAT1基因与家畜生产性状的关系 |
| 2.2.1 DGAT1基因与泌乳性状的关系 |
| 2.2.2 DGAT1基因与肉质性状的关系 |
| 2.2.3 DGAT1基因与生长性状的关系 |
| 2.2.4 DGAT1基因与繁殖性状的关系 |
| 2.3 DGAT1基因在构建小鼠模型中的应用 |
| 2.4 总结与展望 |
| 3 CRISPR/Cas9 系统在动物转基因过程中的研究进展 |
| 3.1 CRISPR/Cas系统概述 |
| 3.1.1 CRISPR/Cas系统的研究历程 |
| 3.1.2 CRISPR/Cas系统的结构及分类 |
| 3.1.3 CRISPR/Cas9 系统的作用机制 |
| 3.2 CRISPR/Cas9 系统在哺乳动物基因编辑中的应用 |
| 3.2.1 CRISPR/Cas9 在构建小鼠动物模型中的应用 |
| 3.2.2 CRISPR/Cas9 在培育家畜新品种中的应用 |
| 3.3 CRISPR/Cas9 在转基因动物的制备中存在的问题及优化策略 |
| 3.3.1 提高靶向特异性,减少脱靶效应 |
| 3.3.2 提高基因编辑效率 |
| 3.4 总结与展望 |
| 第二章 利用CRISPR/Cas9 构建DGAT1 基因在MSTN位点定点整合小鼠的研究 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.3 主要实验材料 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Cas9-gRNA表达载体构建 |
| 2.1.1 gRNA靶点的设计 |
| 2.1.2 spCas9-gRNA靶点效率检测 |
| 2.1.3 Cas9-gRNA表达载体构建 |
| 2.2 DGAT1基因定点整合载体的构建 |
| 2.2.1 上下游同源臂序列的获取 |
| 2.2.2 MCK特异性启动子序列的获取 |
| 2.2.3 DGAT1基因序列的获取 |
| 2.2.4 PolyA序列的获取 |
| 2.2.5 上游同源臂与骨架载体的连接 |
| 2.2.6 MCK启动子与中间载体pcDNA3.0-5hr的连接 |
| 2.2.7 DGAT1 基因与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK的连接 |
| 2.2.8 Poly A与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK-DGAT1 的连接 |
| 2.2.9 下游同源臂与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK-DGAT1-Poly A的连接 |
| 2.3 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体在细胞水平的功能验证及相关检测 |
| 2.3.1 细胞的解冻与培养 |
| 2.3.2 电穿孔法转染小鼠C2C12细胞 |
| 2.3.3 PCR鉴定载体在C2C12细胞中的整合情况 |
| 2.3.3.1 电转后细胞基因组的提取 |
| 2.3.3.2 PCR鉴定载体整合情况 |
| 2.3.4 实时定量PCR鉴定载体在细胞中的转录情况 |
| 2.3.4.1 提取细胞总RNA |
| 2.3.4.2 RNA反转录 |
| 2.3.4.3 实时定量PCR |
| 2.4 转基因小鼠的制备 |
| 2.4.1 质粒的获取 |
| 2.4.2 gRNA的制备 |
| 2.4.3 DGAT1定点整合载体的线性化 |
| 2.4.4 注射载体的纯化 |
| 2.4.5 实验用鼠的准备 |
| 2.4.6 受精卵的采集 |
| 2.4.7 原核注射 |
| 2.4.8 胚胎移植 |
| 2.5 基因编辑小鼠的PCR鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 Cas9-gRNA表达载体的构建 |
| 3.1.1 sp Cas9-gRNA靶点效率检测 |
| 3.1.2 Cas9-gRNA共表达载体构建 |
| 3.2 DGAT1基因定点整合载体的构建 |
| 3.2.1 上下游同源臂序列的获取与鉴定 |
| 3.2.2 DGAT1基因序列的获取与鉴定 |
| 3.2.3 MCK特异性启动子序列的获取与鉴定 |
| 3.2.4 polyA序列的获取与鉴定 |
| 3.2.5 上游同源臂与骨架载体的连接鉴定 |
| 3.2.6 MCK特异性启动子与中间载体pc DNA3.0-5hr的连接鉴定 |
| 3.2.7 DGAT1 基因与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK的连接鉴定 |
| 3.2.8 Poly A序列与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK-DGAT1 的连接鉴定 |
| 3.2.9 下游同源臂与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK-DGAT1-Poly A的连接鉴定 |
| 3.2.10 DGAT1基因定点整合载体的鉴定 |
| 3.3 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体在细胞水平的功能验证及相关检测 |
| 3.3.1 电转后C2C12细胞状态的检测 |
| 3.3.2 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体在DNA水平的检测及功能验证 |
| 3.3.3 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体在mRNA水平的检测及功能验证 |
| 3.4 基因编辑小鼠的制备 |
| 3.4.1 gRNA的制备 |
| 3.4.2 DGAT1定点整合载体的线性化 |
| 3.4.3 实验用鼠的准备 |
| 3.4.4 原核注射的结果 |
| 3.5 基因编辑小鼠的PCR鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体的构建 |
| 4.2 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体在细胞水平的验证 |
| 4.3 DGAT1 基因在MSTN基因位点定点整合的基因编辑小鼠的制备 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）CRISPR/Cas9腺病毒直接注射法制备肌肉抑制素（MSTN）基因敲除鸡的研究初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 一、基因编辑技术的研究 |
| 1. 锌指核酸酶研究简介 |
| 2. TALEN研究简介 |
| 3. CRISPR/Cas9系统研究简介 |
| 4. 总结 |
| 二、基因编辑动物研究进展 |
| 三、基因编辑鸡研究进展 |
| 1. 随机敲入的转基因鸡制备方法 |
| 2. 转基因鸡的应用价值 |
| 3. 基因编辑鸡的研究进展 |
| 四、MSTN基因研究进展 |
| 1. MSTN基因的研究概况 |
| 2. MSTN基因在不同动物中的研究 |
| 第二章 最佳注射条件的探索 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料与试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 封口条件探索结果 |
| 2.2 开口位置探索结果 |
| 2.3 注射位置探索结果 |
| 2.4 GFP腺病毒注射效果检测 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三章 腺病毒注射对鸡胚感染和基因编辑效果探索 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料与方法 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 gRNA效率检测 |
| 2.2 MSTN敲除效率检测 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）TALEN介导的foxo3a敲除小鼠和水牛源ALK6点突变转基因小鼠的表型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(中英文对照表) |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 文献综述 |
| 前言 |
| 1.1 应用转基因技术改良家畜生产性状的国际研究进展 |
| 1.2 国内转基因动物的研究进展 |
| 1.3 转基因动物的制备方法 |
| 1.3.1 显微注射法 |
| 1.3.2 嵌合体法 |
| 1.3.3 精子载体法 |
| 1.3.4 体细胞核移植(克隆)技术 |
| 1.3.5 RNA干扰技术 |
| 1.4 转基因动物在医药方面的应用 |
| 1.4.1 人类疾病模型方面的运用 |
| 1.4.2 生产动物器官用于人体移植 |
| 1.4.3 转基因动物在农业领域的应用 |
| 1.5 基因编辑技术 |
| 1.6 foxo3a基因研究进展 |
| 1.7 ALK6基因研究进展 |
| 第二部 分试验部分 |
| 第二章 TALEN介导的foxo3a基因敲除小鼠的表型研究 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 TALEN位点和引物设计 |
| 1.3.2 foxo3a敲除小鼠的制备与PCR鉴定 |
| 1.3.3 foxo3a基因在不同基因型小鼠卵巢和睾丸组织的表达模式研究 |
| 1.3.4 阳性小鼠卵巢组织切片的制作与HE染色观察 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 foxo3a~(-/+)小鼠foxo3a~(-/-)和的鉴定 |
| 2.1.1 普通PCR结果 |
| 2.1.2 PCR产物T7E1酶切和PSTI酶切结果 |
| 2.2 TALEN介导的foxo3a敲除小鼠后代阳性率的统计 |
| 2.2.1 TALEN介导的foxo3a~(-/+)+foxo3a~(-/+)后代阳性鉴定及阳性率统计 |
| 2.2.2 TALEN介导的foxo3a~(-/+)+foxo3a~(+/+)后代阳性鉴定及阳性率统计 |
| 2.2.3 foxo3a基因敲除小鼠后代产仔数的统计 |
| 2.2.4 不同周龄敲除小鼠产仔数变化分析 |
| 2.3 foxo3a基因在敲除小鼠和野生型体内的表达异同 |
| 2.3.1 foxo3a基因在野生型小鼠各组织的表达模式的建立 |
| 2.3.2 foxo3a~(-/+)小鼠卵巢和睾丸中foxo3a基因表达模式 |
| 2.3.3 foxo3a~(-/-)小鼠卵巢和睾丸foxo3a基因表达模式 |
| 2.4 不同基因型小鼠卵巢切片HE染色结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 水牛源ALK6点突变小鼠的表型研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 生物信息学分析 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.2.4 QRT-PCR反应 |
| 2 结果 |
| 2.1 水牛和小鼠ALK6基因蛋白序列一级结构生物信息学分析 |
| 2.2 水牛和小鼠ALK6基因蛋白序列高级结构生物信息学分析 |
| 2.3 水牛源ALK6点突变转基因小鼠及野生型小鼠生仔数统计分析 |
| 2.4 ALK6在转基因小鼠和野生型体内的表达异同 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（7）国内外转基因生物研发新进展与未来展望（论文提纲范文）
| 1国内外重大研发进展 |
| 1.1转基因植物领域取得的进展 |
| 1.2转基因动物领域取得的进展 |
| 2趋势及展望 |
| 2.1重要功能基因资源的来源呈多样化挖掘 |
| 2.2复合性状转基因作物的研发力度不断加强 |
| 2.3输出性状转基因作物日益丰富 |
| 2.4转基因动物将为人类医学发展作出重要贡献 |
（8）体细胞核移植技术制备转GH基因奶山羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 转基因动物的研究现状 |
| 1 制备转基因动物常用技术 |
| 1.1 原核显微注射技术 |
| 1.2 逆转录病毒载体技术 |
| 1.3 胚胎干细胞技术 |
| 1.4 精子载体介导的转基因技术 |
| 1.5 体细胞克隆技术 |
| 1.6 原始生殖细胞介导技术 |
| 1.7 诱导性多能干细胞介导技术 |
| 2 动物转基因技术的策略 |
| 2.1 构建表达载体策略 |
| 2.2 定点整合策略 |
| 2.2.1 同源重组技术 |
| 2.2.2 phiC31整合酶介导的定点整合技术 |
| 2.2.3 RNAi介导的定点敲除技术 |
| 2.2.4 锌指核酸酶介导的定点整合技术 |
| 2.2.5 TALEN介导的定点整合技术 |
| 2.2.6 CRISPR/Cas介导的定点整合技术 |
| 3 转基因动物的研究意义 |
| 3.1 生产保健蛋白 |
| 3.2 生产药物蛋白 |
| 3.3 生产特殊蛋白 |
| 3.4 改良家畜生产性能 |
| 3.5 转基因动物的生产成本和效率 |
| 4 转基因动物的检测 |
| 4.1 外源基因是否存在的检测 |
| 4.2 外源基因拷贝数的检测 |
| 4.3 外源基因整合位点的检测 |
| 4.3.1 反向PCR |
| 4.3.2 热不对称交互式PCR |
| 4.4 转基因表达的检测 |
| 参考文献 |
| 第二章 GH在动物研究中的应用 |
| 1 GH的结构及定位 |
| 2 GH的调控机制 |
| 3 GH的生物学功能 |
| 3.1 GH与动物的生长 |
| 3.2 GH与物质代谢 |
| 3.3 GH与机体的免疫调节 |
| 3.4 GH与乳腺发育及泌乳 |
| 4 GH在动物生产上的应用 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 山羊乳腺特异性表达载体pcGH的构建及验证 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验仪器 |
| 1.1.3 试验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物合成 |
| 1.2.2 山羊gh基因的克隆 |
| 1.2.3 山羊β-LG5’端及β-LG3’端基因的克隆 |
| 1.2.4 乳腺特异性表达载体pcGH的构建 |
| 1.2.5 山羊乳腺上皮细胞的分离培养 |
| 1.2.6 山羊乳腺上皮细胞的鉴定 |
| 1.2.7 山羊乳腺特异性表达载体pcGH在乳腺上皮细胞中的表达检测 |
| 1.2.8 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊gh的克隆 |
| 2.2 山羊β-LG5’端和3’端调控序列的克隆 |
| 2.3 载体pV-BLG5构建及鉴定 |
| 2.4 载体pV-BLG5-GH构建及鉴定 |
| 2.5 载体pcGH的构建及鉴定 |
| 2.6 山羊乳腺上皮细胞原代培养及纯化 |
| 2.7 山羊乳腺上皮细胞的免疫组化鉴定 |
| 2.8 山羊乳腺特异性表达载体pcGH在乳腺上皮细胞中的表达检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 转GH基因阳性细胞的筛选及转GH基因奶山羊的制备 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验仪器 |
| 1.1.3 试验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 山羊胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 1.2.2 山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定 |
| 1.2.3 转GH阳性细胞的筛选 |
| 1.2.4 转GH阳性细胞的鉴定 |
| 1.2.5 体细胞核移植 |
| 1.2.6 重构胚的培养及胚胎移植 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊胎儿成纤维的分离与培养 |
| 2.2 山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定 |
| 2.3 转GH基因阳性细胞的筛选 |
| 2.4 转GH基因阳性克隆细胞的鉴定 |
| 2.5 体细胞核移植制备转GH基因奶山羊 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 转GH基因奶山羊的鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验仪器 |
| 1.1.3 试验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 转GH基因奶山羊全血基因组的提取 |
| 1.2.2 PCR鉴定转GH基因奶山羊 |
| 1.2.3 Southern-blot鉴定转GH基因奶山羊 |
| 1.2.4 荧光定量PCR鉴定转GH基因奶山羊外源基因的拷贝数 |
| 1.2.5 转GH基因奶山羊外源基因在基因组中的整合位点检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR鉴定转GH基因奶山羊 |
| 2.2 Southern-blot印记杂交鉴定转GH基因奶山羊 |
| 2.2.1 探针的制备 |
| 2.2.2 DNA酶切电泳及转膜印记 |
| 2.3 荧光定量PCR测定转GH基因奶山羊插入基因拷贝数 |
| 2.4 转GH基因奶山羊外源基因整合位点的检测 |
| 2.4.1 TAIL-PCR对整合位点的克隆 |
| 2.4.2 测序与序列分析 |
| 2.4.3 旁侧PCR对整合位点的验证结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 转GH基因奶山羊的初步安全性评价 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验仪器 |
| 1.1.3 试验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 奶山羊生长发育测定 |
| 1.2.2 奶山羊生理生化分析方法 |
| 1.2.3 转GH基因奶山羊乳腺发育情况 |
| 1.2.4 转GH基因奶山羊乳中GH的表达检测及乳成分分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转GH基因奶山羊生长发育状况分析 |
| 2.2 转GH基因奶山羊血常规及血液生理生化指标检测分析 |
| 2.3 转GH基因奶山羊乳腺发育情况统计分析 |
| 2.4 转GH基因奶山羊乳成分分析及乳中GH表达检测 |
| 2.4.1 转GH基因奶山羊泌乳初期产奶量及乳成分分析 |
| 2.4.2 转GH基因奶山羊乳中GH表达检测 |
| 2.5 转GH基因奶山羊羊奶对小羊生长发育的影响 |
| 2.6 转GH基因奶山羊羊奶对小羊生理影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（9）乳腺特异性表达人溶菌酶转基因小鼠的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 溶菌酶的相关研究 |
| 1.2 动物乳腺生物反应器和牛奶人乳化 |
| 1.2.1 动物乳腺生物反应器的研究 |
| 1.2.2 牛奶人乳化的研究 |
| 1.3 本研究的目的、意义及主要内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 pMarblgprobianhlyts 表达结构转基因小鼠的研究 |
| 3.1 pMarblgprobianhlyts 表达结构的构建 |
| 3.1.1 构建方案及技术路线 |
| 3.1.2 提取含人溶菌酶序列的 pMCSɑs1HLYbghp-neo 质粒 |
| 3.1.3 人溶菌酶序列的 PCR 扩增 |
| 3.1.4 人溶菌酶序列的克隆及鉴定 |
| 3.1.5 pMarBLGprobiants 表达载体的构建及鉴定 |
| 3.1.6 方向鉴定 |
| 3.2 转基因小鼠的制备及鉴定 |
| 3.2.1 pMarBLGprobianhlyts 表达结构的酶切回收及检测 |
| 3.2.2 显微注射 |
| 3.2.3 PCR 鉴定转基因小鼠 |
| 3.2.4 转基因小鼠的遗传检测 |
| 3.2.5 Western blot 检测转基因小鼠 |
| 3.2.6 转基因小鼠的酶活检测 |
| 4 pMarBLGpro2bianhlyts 表达结构转基因小鼠的研究 |
| 4.1 pMarBLGpro2bianhlyts 表达结构的构建 |
| 4.1.1 构建方案及技术路线 |
| 4.1.2 pMarBLGpro2biants 表达载体的构建及鉴定 |
| 4.1.3 方向鉴定 |
| 4.2 转基因小鼠的制备及鉴定 |
| 4.2.1 pMarBLGpro2bianhlyts 表达结构的酶切回收及检测 |
| 4.2.2 显微注射 |
| 4.2.3 PCR 鉴定转基因小鼠 |
| 4.2.4 转基因小鼠的遗传检测 |
| 4.2.5 Western blot 检测转基因小鼠 |
| 4.2.6 转基因小鼠的酶活检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 构建载体时的一些注意事项 |
| 5.2 长序列的扩增和连接 |
| 5.3 人溶菌酶的表达 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（10）α干扰素在牛转基因细胞和核移植胚胎中的表达与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 奶牛乳房炎和口蹄疫研究进展 |
| 1.1.1 乳房炎 |
| 1.1.2 口蹄疫 |
| 1.2 动物转基因技术 |
| 1.2.1 DNA 显微注射法 |
| 1.2.2 逆转录病毒感染法 |
| 1.2.3 胚胎干细胞法 |
| 1.2.4 精子载体法 |
| 1.2.5 精原干细胞法 |
| 1.2.6 体细胞克隆法 |
| 1.2.7 诱导多能干细胞法 |
| 1.2.8 孤雄（雌）干细胞法 |
| 1.3 家畜转基因育种策略与现状 |
| 1.3.1 抗病 |
| 1.3.2 经济性状 |
| 1.3.3 其他生产性状 |
| 1.3.4 环保 |
| 1.4 抗菌肽和干扰素研究进展 |
| 1.4.1 抗菌肽 |
| 1.4.2 干扰素 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 转乳铁蛋白肽和α干扰素基因牛胎儿成纤维细胞的制备 |
| 前言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒及菌株 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 质粒提取 |
| 2.2.3 转化 |
| 2.2.4 牛胎儿成纤维细胞系的建立 |
| 2.2.5 FuGENE 脂质体转染 |
| 2.2.6 Amaxa Nucleofector 电转染 |
| 2.2.7 转基因细胞传代筛选 |
| 2.2.8 克隆的挑取和扩大培养 |
| 2.2.9 转基因细胞 DNA 提取（裂解法） |
| 2.2.10 转基因细胞 PCR 鉴定 |
| 2.2.11 Western blot 检测转基因细胞中α干扰素的表达 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 载体构建及鉴定 |
| 2.3.2 牛胎儿成纤维细胞系的建立 |
| 2.3.3 牛胎儿成纤维细胞的转染与筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 转基因细胞中α干扰素的抗病毒作用分析 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 仪器设备及试剂 |
| 3.1.3 细胞攻毒 |
| 3.1.4 病毒滴度测定 |
| 3.1.5 细胞凋亡分析 |
| 3.1.6 培养液添加α干扰素对培养细胞的影响 |
| 3.1.7 细胞 mRNA 提取 |
| 3.1.8 RT-PCR |
| 3.1.9 探针法定量 PCR |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 转α干扰素基因细胞上清病毒滴度检测 |
| 3.2.2 细胞凋亡分析 |
| 3.2.3 转α干扰素基因细胞抗病毒基因表达分析 |
| 3.2.4 胞外添加α干扰素的牛胎儿成纤维细胞抗病毒基因表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 转基因克隆胚胎的制备 |
| 前言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供体细胞 |
| 4.1.2 仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.1.4 显微操作针的制备 |
| 4.1.5 核移植 |
| 4.1.6 转基因克隆胚胎 PCR 鉴定 |
| 4.1.7 转基因克隆胚胎α干扰素免疫荧光染色 |
| 4.1.8 转基因克隆囊胚细胞计数染色 |
| 4.1.9 受体牛的同期发情与转基因克隆胚胎移植 |
| 4.1.10 转基因克隆牛鉴定 |
| 4.1.11 转基因克隆牛耳成纤维细胞建系与再克隆 |
| 4.1.12 实验设计 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 转基因克隆胚胎制备与鉴定 |
| 4.2.2 供体细胞不同处理方式对克隆效率的影响 |
| 4.2.3 不同的激活方式对克隆效率的影响 |
| 4.2.4 不同核移植方法对克隆效率的影响 |
| 4.2.5 转基因克隆和非转基因克隆胚胎发育能力比较 |
| 4.2.6 转基因克隆胚胎和非转基因克隆胚胎妊娠情况 |
| 4.2.7 转基因克隆牛鉴定 |
| 4.2.8 转基因克隆牛耳成纤维细胞系的建立与再克隆 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 供体细胞不同处理方式对克隆效率的影响 |
| 4.3.2 不同的激活方式对克隆效率的影响 |
| 4.3.3 不同核移植方法对克隆效率的影响 |
| 4.3.4 转基因克隆和非转基因克隆的胚胎发育比较 |
| 4.3.5 转基因克隆胚胎和非转基因克隆胚胎妊娠情况比较 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 附录 相关图片 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、通过转基因改善家畜奶的品质（论文参考文献）
- [1]转基因技术助力乡村振兴[J]. 施海东. 智慧农业导刊, 2021(05)
- [2]线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响[D]. 于海滨. 吉林大学, 2020
- [3]利用CRISPR/Cas9构建DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠的研究[D]. 毕美玉. 内蒙古大学, 2020(04)
- [4]CRISPR/Cas9腺病毒直接注射法制备肌肉抑制素（MSTN）基因敲除鸡的研究初探[D]. 胡豪. 广西大学, 2019(01)
- [5]TALEN介导的foxo3a敲除小鼠和水牛源ALK6点突变转基因小鼠的表型研究[D]. 赵鲜红. 广西大学, 2016(02)
- [6]浅谈转基因食品现状及其安全性[J]. 郝蕾. 口岸卫生控制, 2016(02)
- [7]国内外转基因生物研发新进展与未来展望[J]. 王友华,孙国庆,连正兴. 生物技术通报, 2015(03)
- [8]体细胞核移植技术制备转GH基因奶山羊的研究[D]. 张强. 南京农业大学, 2014(06)
- [9]乳腺特异性表达人溶菌酶转基因小鼠的研究[D]. 郜富权. 河北农业大学, 2013(03)
- [10]α干扰素在牛转基因细胞和核移植胚胎中的表达与功能研究[D]. 余大为. 中国农业科学院, 2012(10)