一、神经细胞Na~+/Ca~(2+)交换体电生理特性及慢性大鼠脑缺血下Na~+/Ca~(2+)交换体表达的改变（论文文献综述）
陈野[1]（2021）在《H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用》文中认为背景中风是目前最常见的死亡原因之一,也是在全世界范围内持续性和获得性残疾的主要原因,随着人口变化,发病率进一步增加,对人们生活的质量带来巨大负担。中风分为出血性中风和缺血性中风,后者更常见,当前治疗的重点是通过静脉溶栓和血管内血栓切除术进行快速再灌注,但再灌注的同时也会损害大脑组织,因此对中风可用的治疗方法极为有限,研究预防策略正朝着卒中管理的前沿发展,一些新的进展为神经保护带来了新的希望。Ras同源家族成员A（Rho A）,是一种分布广泛的胞质蛋白,属于小GTP酶家族,鸟苷三磷酸水解酶（Rho GTPases）构成了相当普遍表达的胞质分子开关,控制了一系列下游效应子的活性,Rho依赖性卷曲螺旋激酶（ROCK）是Rho A最直接、最主要的效应分子,有ROCK1和ROCK2两种亚型。缺血性脑损伤可诱导Rho A激活和ROCK2表达的显着上调,越来越多的证据表明,Rho A/ROCK通路参与了中枢神经系统一些疾病的病理过程。Rho A的磷酸化是导致其功能发生改变和调节其活性的主要方式之一,Rho A在Ser188位点磷酸化能够抑制Rho A激活。硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）是一种普遍存在的第二信使分子,起神经调节剂的作用,在许多哺乳动物器官和系统中均具有重要功能,参与大脑的生理和病理机制。内源性H2S合成的酶主要包含胱硫醚-γ-裂解酶（L-cystathionine-γ-lyase,CSE）,胱硫醚-β-合酶（L-cystathionine-?-synthetase,CBS）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）。我们前期研究证明了H2S可促进大鼠脑血管平滑肌细胞中KCa通道的开放,CSE产生的H2S对小鼠脑缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤具有保护作用,但其作用的分子机制尚不明确。前期研究者报道脑内皮/神经血管单位（Neurovascular unit,NVU）存在重要作用,脑血管的自动调节对于保护神经细胞免受缺血性损伤非常重要,缺血性脑组织的重塑涉及神经元和微血管细胞之间的相互作用,对神经血管单位缺血性死亡过程涉及的机制有待深入的了解。基于以上的研究背景,我们做了以下几个方面研究:1.构建并表达Glutathione S-transferase（GST）标签的Rho A野生型(GST-Rho Awild)和Rho A Ser188位点突变型(GST-Rho AS188A)蛋白,观察外源性H2S（Sodium hydrosulfide,Na HS）对其体外磷酸化的影响。2.探讨H2S抑制Rho A/ROCK通路的靶点和机制,并研究H2S促进Rho A Ser188磷酸化对海马神经元缺氧复氧（Hypoxia-Reoxygenation,H/R）损伤和大鼠脑缺血再灌注损伤的作用。目的1.观察H2S对Rho A的Ser188位点磷酸化的调节;2.探讨H2S对海马神经元Rho A Ser188位点的作用及其潜在的H/R损伤保护机制;3.探讨Rho A Ser188位点在H2S对大鼠缺血性脑损伤保护的影响。方法1.构建Rho Awild-p GEX-6p-1和Rho A S188A-p GEX-6p-1重组原核质粒,诱导表达并纯化GST-Rho Awild和GST-Rho AS188A蛋白,在进行体外磷酸化测定。2.构建Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1重组真核质粒,再进行大鼠原代海马神经细胞（Hippocampal nerve cells,HNCs）培养与鉴定,并将重组质粒通过电转染到HNCs中,给与不同浓度的外源性H2S（Na HS）后western blot测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达,酶联免疫实验（ELISA）法测定Rho A和ROCK2活性。3.全细胞膜片钳记录Na HS对转染重组质粒后的神经细胞大电导钙激活钾通道（BKCa）电流的影响。4.建立H/R损伤模型,通过细胞计数试剂盒（CCK-8）检测转染重组质粒后的神经细胞活力变化,乳酸脱氢酶（LDH）,神经特异性烯醇化酶（NSE）释放变化评估其损伤。5.原代大鼠脑血管内皮细胞（ECs）培养与鉴定,CSE-/-小鼠和3-MST-/-大鼠的原代内皮细胞与神经细胞共培养,加入乙酰胆碱（ACh）刺激内皮细胞释放H2S,测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达水平,测定Rho A和ROCK2活性,同时测定两种内皮细胞释放的H2S含量。6.分别将Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1真核质粒转染到HNCs,与CSE-/-ECs进行共培养,加入乙酰胆碱（ACh）刺激内皮细胞释放H2S,并进行H/R损伤造模。测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达,测定Rho A和ROCK2活性,以及细胞活力、培养上清LDH和NSE的变化。7.Hoechst 33258染色,在荧光显微镜下观察神经细胞核损伤情况,Annexin V/PI染色通过流式细胞仪检测凋亡细胞。8.Ca2+成像系统荧光显微镜（Olympus IX73）检测神经细胞内Ca2+含量并获得细胞内Ca2+信号的荧光图像。9.脑立体定位转染Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1真核质粒到大鼠海马区域,通过western blot检测Rho Awild和Rho AS188A蛋白表达,冰冻切片在荧光显微镜下观察转染效果。10.双侧颈总动脉结扎2VO对转染成功的大鼠建立脑I/R模型,激光散斑成像技术（Laser speckle imaging,LSI）检测血流变化,观察造模成功与否。缺血2h再灌注24h后,采用苏木素-伊红（HE）染色观察海马区域损伤程度,TUNEL检测海马神经细胞凋亡情况,western blot检测海马组织Rho A Ser188磷酸化蛋白和ROCK2蛋白表达,测定Rho A和ROCK2活性,以及血清LDH,NSE的变化。结果1.放射自显影结果显示,在PKG1存在下,H2S供体Na HS（100μmol/L）显着促进了GST-Rho Awild蛋白的磷酸化,但是GST-Rho AS188A蛋白并没有发生磷酸化。这表明Na HS可以通过Ser188位点促进Rho A的磷酸化。2.H2S（Na HS和内皮源性CSE产生）可促进空质粒或GFP-Rho Awild或GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中Rho A的磷酸化,以及GFP-Rho Awild质粒转染的神经元中GFP-Rho Awild的磷酸化。与对照组相比,p-Rho A/Rho A比值或p-GFP-Rho Awild/GFP-Rho Awild比值明显增加。但对GFP-Rho AS188A的磷酸化没有影响,GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中的p-GFP-Rho AS188A/GFP-Rho AS188A比值与对照组相比没有明显变化。这些结果表明,H2S可以诱导大鼠海马神经元中的Rho A磷酸化,并且这种磷酸化由Rho A Ser188介导。3.H2S能够使Rho A和GFP-Rho Awild在细胞膜中的含量显着减少,在胞质中的表达增高,但对GFP-Rho AS188A在细胞膜和细胞质中的分布没有明显影响。这些结果表明,Ser188是H2S引起神经元中Rho A从细胞膜向细胞质内易位的必需条件,同时可以通过Ser188抑制Rho A活性。4.Na HS对转染GFP-Rho AS188A质粒的神经细胞BKCa通道电流的增加低于转染空质粒和GFP-Rho Awild质粒组且具有显着性差异（30 m V-70 m V）这些结果表明,Na HS对BKCa通道电流的增加受到Rho A Ser188的调控。5.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的大鼠海马神经元中,H2S可显着抑制ROCK2蛋白的表达及其活性,但在GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中,抑制作用减弱,表明Rho A Ser188与H2S抑制神经元中ROCK2蛋白表达及其活性有关。6.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的神经元中,H2S显着抑制细胞活力的降低以及LDH和NSE活性的增加。然而,在GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中,H2S的这些作用显着降低。这些结果表明,Rho A Ser188介导了H2S对神经细胞H/R损伤的保护作用。7.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒或GFP-Rho AS188A质粒转染的CSE-/-EC共培养神经元中,H/R损伤诱导神经细胞凋亡和细胞内游离Ca2+荧光强度显着增加。在空质粒或GFP-Rho Awild质粒共培养的神经元中,CSE+/+EC可以明显降低H/R损伤诱导神经细胞凋亡的增加和细胞内游离Ca2+荧光强度,但对转染GFP-Rho AS188A质粒共培养的神经元没有影响。这些结果表明,内皮CSE产生的H2S可以通过抑制细胞内游离Ca2+的增加来保护神经元免受H/R损伤,并且该作用是由Rho A Ser188介导的。8.动物体内实验中,在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的大鼠海马中,Na HS能够促进Rho A的磷酸化,抑制Rho A活性,同时降低ROCK2的表达和活性,减轻大鼠脑I/R损伤诱导的血清LDH和NSE的增高,以及海马组织中神经细胞损伤和凋亡。但对转染GFP-Rho AS188A质粒的海马组织中这些作用显着降低。这些结果表明,Na HS减轻大鼠脑I/R损伤且与Rho A Ser188有关。结论1.Na HS可以通过Ser188位点促进Rho A的磷酸化。2.Na HS可能通过Rho A Ser188增加大鼠海马神经细胞中BKCa通道电流。3.内外源性H2S通过促进大鼠海马神经细胞Rho A Ser188磷酸化来保护海马神经元免受H/R损伤。4.Rho A Ser188介导了H2S对大鼠脑I/R损伤的保护作用。
师腾瑞[2]（2020）在《电生理及钙离子荧光成像检测MsrB1敲除对小鼠中枢神经系统的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理在生物代谢过程中,蛋白质中的甲硫氨酸残基易被氧化形成甲硫氨酸亚砜,导致蛋白质的空间结构,甚至其功能发生改变。然而,生物体中同时存在特异性的还原酶可以通过还原甲硫氨酸亚砜来逆转这种翻译后修饰。甲硫氨酸亚砜还原酶家族四个成员中,只有MsrB1是含有高还原性（高效抗氧化性）硒代半胱氨酸的硒蛋白。MsrB1高表达于肝脏和肾脏等器官,且在敲除模型小鼠中发现,该小鼠肝脏和肾脏氧化水平均明显升高。另外,有研究表明MsrB1在体外能与Actin、TRPM6和Amyloid-beta等蛋白相互作用,其中,Actin蛋白是细胞骨架的主要成员之一,参与肌肉收缩/舒张、细胞运动、细胞因子和细胞质流等过程,并且神经发育过程中轴突生长、突触发生以及突触间信号传递都需要细胞骨架的调控。可见,MsrB1在中枢神经系统的发育和功能中可能具有重要作用,但MsrB1的敲除是否影响小鼠的中枢神经系统的正常功能并未有研究和报道。因此,本研究以MsrB1敲除小鼠为模型采用电生理系统以及钙荧光成像系统展开对MsrB1在小鼠大脑中功能的初步研究。首先从形态学角度出发,观察MsrB1敲除对于脑组织结构及不同类型脑细胞分布的影响。HE染色结果发现脑组织结构无明显异常,但免疫荧光染色结果显示,星形胶质细胞在小鼠海马体组织中有明显的增生和迁移现象。可见,MsrB1敲除对小鼠海马组织的影响较明显,而海马组织对高等动物陈述行记忆的固化非常重要。因此,本研究通过水迷宫与旷场行为学实验对小鼠空间学习及记忆能力进行检测。结果表明,与野生型小鼠相比,MsrB1缺失小鼠自主探索行为能力及空间学习能力明显下降,但对焦虑情绪无影响。为了进一步证实该结果,我们还通过采用电生理技术检测了小鼠大脑切片海马CA1区LTP及LTD,结果发现KO小鼠LTP及LTD大幅度降低。可见,MsrB1敲除对海马CA1区神经元信号传递功能有明显损伤。神经元的信号传递依赖于突触结构的可塑性,突触中蛋白微丝的动态聚集和解聚对树突棘的形态、功能以及递质的运输至关重要,然而,肌动蛋白微丝的动态变化受到其自身的氧化还原状态的影响。体外研究表明,MsrB1可通过还原肌动蛋白受氧化的44和47位甲硫氨酸,使肌动蛋白恢复聚集能力。本研究结果表明,MsrB1缺陷鼠大脑中肌动蛋白44位甲硫氨酸氧化水平明显升高。可见,肌动蛋白甲硫氨酸氧化水平升高与MsrB1缺陷鼠空间学习障碍有关,且进一步的蛋白质组学分析结果也显示,MsrB1敲除后,部分与补体系统、肌动蛋白骨架调节、Rap1信号通路、AD、神经元信号通路、长时程增强、钙信号调节、MAPK信号通路以及内质网蛋白质合成等生理及病理过程相关蛋白的表达均有明显变化。此外,大量研究证实NMDAR在LTP和LTD的产生过程中发挥重要作用。因此我们检测了海马中NMDAR两个亚基GluN2A和GluN2B的表达量,以及分别位于突触前和突触后的Synaptophysin和PSD-95的表达水平。结果表明,MsrB1的敲除导致海马区NMDAR亚基的表达水平降低及突触结构的损伤。同时,研究表明神经元的活动与细胞内钙离子的浓度。钙离子与钙调蛋白结合,刺激多种酶的活化,包括钙调蛋白激酶和钙敏感腺苷酸环化酶,这些酶可以帮助钙信号的传递并影响神经元功能。CaMKII在Ca离子和钙调素（CAM）复合体的作用下发生自聚集和自磷酸化,且在Ca离子浓度降低后仍保留催化活性,构成记忆分子装置,该过程长期以来被认为对LTP和学习记忆具有重要作用,而本研究的Western Blot结果也显示,MsrB1敲除鼠CaMKII磷酸化水平明显低于WT鼠。为了证明上述体内结果,我们进而采用细胞内钙荧光成像技术检测了WT鼠和MsrB1敲除鼠原代神经元中钙离子水平。结果发现,在正常条件下,MsrB1敲除鼠神经元中钙离子水平略高于WT鼠,然而,在谷氨酸刺激后WT鼠神经元钙离子水平却明显高于MsrB1敲除鼠。由此可见,MsrB1的敲除会导致小鼠神经元正常条件下钙离子水平以及在谷氨酸刺激条件下钙离子的摄取。综上所述,本研究以MsrB1敲除小鼠为模型,首次揭示了MsrB1在大脑中的作用:首先,尽管MsrB1缺失不会影响小鼠大脑的总体形态,但会导致小鼠大脑星型胶质细胞的增生;其次,MsrB1缺失影响神经元突触信号传递功能蛋白的表达以及钙信号功能蛋白的活化,进而导致神经元间信号传递功能受损,最终表现为小鼠空间记忆能力的损伤。本研究不仅扩展了我们对MsrB1功能的认识,而且为了解甲硫氨酸氧化修饰影响中枢神经系统的发育和功能提供了新的证据。此外,MsrB1与神经退行性变化之间的关联也为临床上对神经退行性病变的诊断和治疗提供了新的思路。
邵丹丹[3]（2020）在《氟暴露下小鼠脑海马钙稳态变化分子机制的研究》文中指出氟（fluorine,F）是人体必需微量元素,过量氟蓄积造成机体全身性生理病理改变,称为地方性氟中毒,简称地氟病。氟斑牙、氟骨症是氟暴露致骨相器官受损的主要症状。氟暴露还能导致脑、肾脏等非骨相器官受损。研究表明,过量氟摄入可透过血脑-屏障蓄积在脑组织中,影响中枢神经系统的正常生理功能。近年来,氟中毒致神经系统的影响已成为地氟病研究的热点。Ca2+是机体细胞内重要的“第二信使”,钙稳态是细胞Ca2+信号生成转导,完成一系列生理功能的关键,但迄今氟暴露致脑海马组织钙稳态变化的分子机制及膳食钙水平的影响尚未见系统报道。本实验分为亚慢性氟和慢性氟暴露两部分,各选用初断乳ICR雄性小鼠120只,适应7天后,随机分为6组,即对照组（C）:饮用自来水（氟含量<0.2 mg/L）,食用标准饲料（钙含量0.8%）;染氟组（F）:饮用100 mg/LNaF溶液,食用标准饲料;高钙组（HCa）:饮用自来水,食用高钙饲料（钙含量2%）;低钙组（LCa）:饮用自来水,食用低钙饲料（钙含量0.063%）;染氟高钙组（F+HCa）:饮用100 mg/L NaF溶液,食用高钙饲料;染氟低钙组（F+LCa）:饮用100 mg/L NaF溶液,食用低钙饲料。染氟结束后,观测小鼠氟斑牙,并检测其血/尿氟、血/尿钙含量,在检验小鼠氟中毒模型复制成功的基础上,观测小鼠海马组织CA1区形态结构和细胞凋亡率;fluo-4荧光探针负载检测小鼠海马细胞内Ca2+水平;根据试剂盒方法检测小鼠海马细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性;用Western Blot、RT-PCR等方法检测小鼠海马细胞膜L型钙通道Cav1.2、质膜Ca2+泵PMCA、Na+-Ca2+交换体NCS-1、内质网膜肌醇三磷酸受体IP3R和钙泵ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平,拟首次系统探讨不同膳食钙水平对氟致脑海马钙稳态变化的影响及分子机制,为探寻氟致神经毒性经济有效的干预途径及完善“氟致钙矛盾疾病”理论提供基础资料。研究结果如下:（1）小鼠氟中毒模型的复制与C组比,亚慢性氟暴露和慢性氟暴露各氟处理组氟斑牙症状明显,尿氟含量极显着上升（P<0.01）,表明本研究小鼠亚慢性氟暴露和慢性氟暴露模型复制成功。（2）小鼠海马组织形态结构观察亚慢性和慢性氟暴露C组小鼠海马CA1区细胞形态规则,细胞正常,界限清晰,结构紧密,层次明显。F组小鼠海马CA1区细胞形态发生改变,细胞间隙较宽,排列疏松。与F组比,F+HCa组较细胞排列较紧密,有清晰的细胞分层,而F+LCa组细胞染色较浅,细胞数量明显减少且间隙较宽。（3）小鼠海马CA1区细胞凋亡检测结果与C组比,亚慢性氟暴露和慢性氟暴露各处理组小鼠CA1区细胞凋亡数量极显着上升（P<0.01）;与F组比,亚慢性氟暴露和慢性氟暴露F+HCa组小鼠CA1区细胞凋亡数量极显着减少（P<0.01）,而亚慢性氟暴露和慢性氟暴露F+LCa组小鼠CA1区细胞凋亡数量却极显着增加（P<0.01）;与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组和F+LCa组小鼠CA1区细胞凋亡数量显着增加（P<0.05）。（4）小鼠海马细胞内Ca2+水平检测结果与C组比,亚慢性氟暴露和慢性氟暴露各染氟组小鼠海马细胞内Ca2+水平均显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）;与F组比,亚慢性和慢性氟暴露F+HCa组小鼠海马细胞内Ca2+水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）,F+LCa组小鼠海马细胞内Ca2+水平显着升高（P<0.05）;与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组,F+HCa组和F+LCa组小鼠海马细胞内Ca2+水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）。（5）小鼠海马细胞Ca2+转运相关分子检测结果a、跨膜摄入Ca2+的相关分子检测结果与C组比,各染氟处理组小鼠海马细胞膜Cav1.2基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）;与F组比,F+HCa组Cav1.2基因/蛋白表达水平极显着降低（P<0.05或P<0.01）,ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,F+LCa组Cav1.2基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）。与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组、F+HCa组和F+LCa组Cav1.2基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）。b、Ca2+跨膜释出相关指标检测结果小鼠海马组织细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性检测结果显示,与C组比,各处理组Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力均显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）;与F组比,F+HCa组Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力显着升高（P<0.05）,F+LCa组Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力显着降低（P<0.05）;与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组和F+LCa组Na+-K+-ATP酶活力显着降低（P<0.05）。与C组比,各染氟处理组小鼠海马细胞内质网膜IP3R基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,海马细胞质膜NCS-1、PMCA基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）;与F组比,F+HCa组IP3R基因/蛋白表达水平极显着降低（P<0.05或P<0.01）,NCS-1、PMCA基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,F+LCa组IP3R基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,NCS-1、PMCA基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）。与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组、F+HCa组和F+LCa组小鼠海马细胞内IP3R基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,NCS-1、PMCA基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）。综上所述,氟中毒致脑海马细胞L-型钙离子通道Cav1.2基因/蛋白表达水平上升,使细胞外Ca2+的内流增加;同时细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性降低,Na+-Ca2+交换体NCS-1和质膜Ca2+泵PMCA基因/蛋白表达水平也降低,使细胞内Ca2+逆浓度向质膜外运转受阻;而脑海马细胞内通过升高内质网IP3R通道基因/蛋白表达水平,并降低钙泵ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平,使细胞内主要钙库内质网中Ca2+释出增多,并使内质网逆浓度从胞液中摄取Ca2+受阻。上述多因素导致细胞质中Ca2+超载,使脑海马细胞Ca2+稳态失衡,触发钙信号通路和下游凋亡调节相关分子表达异常,诱发脑海马细胞凋亡异常,最终损伤脑海马组织细胞,且氟致脑脑海马细胞凋亡率与染氟时间呈正相关。而膳食高钙（2%）能够显着地逆转上述氟暴露致脑海马细胞膜或内质网膜Ca2+转运相关分子表达的异常,抑制细胞内Ca2+超载,维持钙稳态,降低细胞凋亡率,膳食高钙可能是一种经济、安全且有效的抗氟剂。
刘碧原[4]（2020）在《系统生物学视角下苦碟子治疗缺血性脑卒中的效应机制研究》文中认为目的:缺血性脑卒中是临床常见的具有较高致死率和致残率的疾病。临床研究发现苦碟子对缺血性脑卒中具有较好的治疗效果,但对其作用机制的探查尚不全面。本课题以苦碟子治疗缺血性脑卒中的临床疗效为依据,运用MCAO/R模型和神经细胞系模型,通过整合运用蛋白质组学、高通量测序、生物信息学、分子生物学以及网络药理学等多种系统生物学研究方法,从体内和体外不同维度探查苦碟子治疗缺血性脑卒中的效应及机制。方法:（1）雄性SD大鼠45只,随机分为假手术组15只、造模组30只。造模组采用改良的线栓法复制大鼠MCAO/R模型,成模后将造模组大鼠随机分为模型组15只,苦碟子组15只。苦碟子组给药量依据成人口服苦碟子生药20g计算,在成模后每隔3h给予模型动物4mL/kg苦碟子提取物腹腔注射。假手术组和模型组给予等量的生理盐水腹腔注射。24h后观察各组动物的神经功能评分（mNSS）,脑梗死面积（TTC染色）,脑组织形态变化（HE染色）,神经细胞凋亡情况（TUNEL染色）;（2）比较各组动物大脑缺血半影区差异蛋白表达的情况,并用Western-blotting的方法验证;（3）用液质联用的方法鉴定苦碟子所含成份以及入脑成份,并运用网络药理学的方法分析苦碟子入脑成份靶点与差异蛋白靶点的交集,获得苦碟子入脑有效成份。（4）依据蛋白质组学结果,苦碟子的作用主要在于调节神经递质水平,抑制过量的兴奋性神经递质对神经元的损伤。用大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞系模拟神经元进行后续机制的探查,PC12细胞用DMEM F12K完全培养基在37℃,5%CO2的培养箱中培养,用NGF处理7天,刺激PC12细胞轴突生长。在PC12细胞系中使用10mM谷氨酸刺激细胞12h,复制兴奋性神经递质损伤模型,同时给予苦碟子及其入脑有效成份干预3h。对干预后的细胞用CCK-8检测细胞活力;并检测苦碟子及其入脑有效成份对PC12细胞内外谷氨酸水平的影响。（5）用苦碟子及其入脑有效成份干预细胞3h后收集细胞,用RNA-Sequencing的方法对细胞进行转录组测序。分析差异表达基因,并运用生物信息学的方法获得差异表达基因富集的生物过程及信号通路。（6）对体内的差异蛋白核心网络和体外的核心调节差异基因进行荟萃分析,获得苦碟子治疗缺血性脑卒中的核心靶点/通路,并用Western-blotting和RT-qPCR的方法对上述靶点进行验证。通过分析核心通路,获得通路之间的串扰关系,并获得苦碟子及其入脑有效成份通过核心通路调节的转录因子;用JASPAR预测与神经递质转运相关基因启动子区域与上述转录因子的结合位点;用抑制剂干预上述通路,用RT-qPCR验证苦碟子通过上述通路进行转录调控的机制。结果:（1）本研究发现,MCAO/R模型存在着明显的神经功能损伤,经过苦碟子治疗后模型动物的神经功能评分明显降低。TTC染色发现,MCAO/R模型存在着明显的脑梗死灶,苦碟子治疗后模型动物的脑梗死面积明显减小。运用HE染色进行组织学观察发现,MCAO/R模型动物的大脑皮层及纹状体区域存在着明显的组织变性,表现为细胞核皱缩,神经元空泡变性等;经过苦碟子治疗后组织变性明显好转。TUNEL染色发现,模型组动物病灶脑区及其周边的神经细胞凋亡增多;且经过苦碟子治疗后,神经细胞凋亡明显减少。（2）对各组动物缺血半影区以及相应位置进行蛋白组学分析发现,模型组和假手术组之间的差异蛋白主要富集在调节囊泡介导的胞吐作用,血小板聚集,补体激活,凋亡过程的负调控等生物学过程;蛋白所涉及的细胞结构主要包括神经元、突触、囊泡、细胞外泌体等;差异蛋白所涉及到的分子功能主要包括SNARE结合,GTPase活性等。KEGG富集分析发现模型组差异蛋白主要富集在补体和凝血级联,加压素调节水的重吸收,GABA能突触等通路。而苦碟子组和模型组的差异蛋白主要参与止血、突触小泡循环,TP53调节基因,突触小泡运输等通路及生物学过程。对苦碟子组与模型组之间的差异蛋白进行蛋白互作网络（PPI）分析后,获得了一个具有103个节点,353条边的核心网络模块。对模块中的蛋白进行GO分析发现,核心调节模块的蛋白主要涉及调节神经递质水平和囊泡的融合、胞吐和回收等生物过程。KEGG通路富集发现,核心模块蛋白主要参与调节突触小泡循环,SNARE在囊泡运输中的相互作用,谷氨酸能突触和cAMP信号通路等通路或生物学功能。（3）用液质联用的方法在苦碟子中共检测到81种成份,并且其中的9种可以在模型动物大脑中检测到。运用网络药理学方法获得9种入脑成份的靶点并与苦碟子治疗MCAO/R模型的差异蛋白进行交叉分析。在9种入脑成份中,芦丁、阿魏酸和腺苷的靶点与苦碟子体内调控的差异蛋白吻合度最高。所以我们认为,腺苷、阿魏酸和芦丁是苦碟子入脑的有效成份。（4）在用10mM谷氨酸刺激细胞12h的兴奋性神经递质毒性模型中,PC12细胞的活力被明显抑制;用苦碟子及其入脑有效成份干预后,可以明显减轻过量谷氨酸对PC12细胞活力的抑制作用。并且运用苦碟子及其入脑有效成份干预后,PC12细胞外谷氨酸水平均明显降低;苦碟子和腺苷干预后PC12细胞内谷氨酸水平明显降低,芦丁干预后PC12细胞内谷氨酸水平明显升高。（5）比较各实验组差异基因的富集分析结果发现,各实验差异基因所调控的通路既有重叠又有差异。对苦碟子及其入脑有效成份干预后PC12细胞的差异基因进行交集分析,共获得277个核心调节基因,核心调节基因主要参与通过cAMP信号通路,PI3K-Akt信号通路,钙信号通路,轴突导向等多条信号通路。对核心调控差异基因进行IPA分析发现,其主要参与调节的经典通路包括轴突导向,cAMP介导的信号传导、G蛋白偶联受体信号传导、eNOS信号通路等多方面。（6）基因测序和蛋白质组学结果共享的信号通路包括囊泡介导的运输、突触传递、神经递质转运、cAMP信号通路、血液循环、PI3K-Akt信号通路等通路及生物学过程,将上述通路定义为苦碟子的核心调控通路。用RT-qPCR验证苦碟子及其入脑有效成份干预后核心调控通路相关的基因。结果发现Nfatc4,Vamp1,Snap25,Slc6a4明显下调;Slc1a2表达升高明显;Cplx1在苦碟子干预后明显升高,在腺苷、阿魏酸和芦丁干预后降低。另外在苦碟子及其入脑有效成份干预后Crebl,Camk2g,Nr4a1和Bcl2表达升高明显;Th,Nfkb1表达明显降低。用Westrn-blotting的方法验证苦碟子和腺苷干预上述基因的蛋白表达,结果和RNA-Seq测序数据相一致。通过分析发现cAMP通路和PI3K通路存在着串扰,两条通路均参与调控Creb1和Nfkb1,并且cAMP通路还参与调节Nfatc4,上述三者编码重要的转录因子CREB,NF-κB和NFAT家族。用JASPAR预测转录因子的结合位点发现Slc1a2在基因的启动子区域同时存在Creb1和Nfkb1的结合位点;Vamp1和Snap25在基因的启动子区域存在Nfatc4的结合位点。Grin1在基因启动子区域同时存在Nfkb1和Nfatc4的结合位点。用抑制剂同时阻断cAMP通路和PI3K通路后苦碟子及其入脑有效成份对上述转录因子的调控作用消失,并伴随着对神经递质水平调节相关基因的调控作用消失。结论:上述研究表明,苦碟子对缺血再灌注损伤模型（MCAO/R）具有较好的疗效;苦碟子治疗MCAO/R模型的主要环节在于调节MCAO/R模型的神经递质稳态,抑制神经兴奋毒性,其分子机制在于苦碟子及其入脑有效成份可以同时调控cAMP通路和PI3K通路,以调节CREB、NF-κB和NFAT家族转录因子,影响其对下游Vamp1、Snap25、Slc1a2和Grin1基因的转录调节,发挥抑制囊泡的胞吐、增加兴奋性神经递质的转运并抑制其受体后传导的功能。从而抑制神经兴奋毒性,在缺血性脑卒中病理中起到对神经细胞的保护作用。
任周梁[5]（2019）在《Gal-3在大鼠急性脊髓损伤炎症反应中的作用及调控机制研究》文中研究表明目的:阐明半乳糖凝集素3（Gal-3）在大鼠急性脊髓损伤（SCI）炎症反应中的作用及调控机制。方法:第一部分:Gal-3在大鼠急性脊髓损伤模型中的表达及作用研究（体内实验）;（1）12只雄性SD大鼠随机分为对照组和SCI组（每组n=6）。Allen’s法打击脊髓造模,术后24h对大鼠进行眼眶静脉采血。分别于24h、48h和72h对各组大鼠进行BBB评分,然后被处死取损伤处脊髓组织进行含水量测定和苏木精-伊红（HE）染色,采用取血样进行酶联免疫吸附实验（ELISA）,检测p65、TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、SOD、CAT以及GSH-PX的表达水平。使用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）测定Gal-3 mRNA的表达。（2）18只雄性SD大鼠随机分为对照组,SCI组和SCI+GB1107组（每组n=6）,重复上述实验过程。第二部分:Gal-3促进大鼠急性脊髓损伤炎症反应的可能机制研究（体内实验）;（1）12只雄性SD大鼠随机分为对照组和SCI组（每组n=6）,术后24h处死大鼠、脊髓组织取样用于基因芯片技术,筛选Gal-3在SCI模型中的调控靶点。（2）12只雄性SD大鼠建立脊髓损伤模型,随机分为阴性对照组和Gal-3干预组（每组n=6）,蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测Gal-3、TXNIP和NLRP3蛋白的表达。（3）18只雄性SD大鼠随机分为对照组、SCI组和SCI+GB1107组,Western blot检测Gal-3、TXNIP和NLRP3蛋白的表达。第三部分:Gal-3通过ROS/TXNIP/NLRP3信号通路促进脊髓损伤后神经炎症反应的研究（体外实验）;（1）LPS诱导PC12细胞构建体外神经炎症模型,48h后收集PC12细胞,随机分为对照组、LPS组和LPS+si-Gal-3组,使用Western blot法检测Gal-3、硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）和NOD样受体家族蛋白3（NLRP3）的表达,ELISA法检测细胞中ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-PX以及IL-1β的水平,免疫荧光染色显示Gal-3的表达。（2）确定活性氧自由基（ROS）抑制剂调控Gal-3对氧化应激的作用,随机分为对照组、LPS组、LPS+si-Gal-3转染组和LPS+si-Gal-3+H2O2组,LPS+ROS抑制剂以及LPS+ROS抑制剂+Gal-3组,ELISA法检测各组细胞中ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-PX以及IL-1β的表达水平,Western blot检测TXNIP和NLRP3蛋白的表达。（3）明确TXNIP/NLRP3在Gal-3促神经炎症中的作用:将PC12细胞随机分为6组,分别为对照组、LPS组、LPS+si-TXNIP组、LPS+si-TXNIP+Gal-3组、LPS+si-NLRP3组以及LPS+si-NLRP3+Gal-3组,ELISA法检测各组IL-β的表达水平,Western blot分别检测TXNIP和NLRP3蛋白的表达。结果:第一部分（1）SCI组各时间点的BBB评分明显低于对照组（P<0.05）,SCI+GB1107组各时间点的BBB评分明显高于SCI组（P<0.05）;（2）SCI组组织含水量明显高于对照组,SCI+GB1107组明显高于SCI组（P<0.05）;（3）对照组脊髓组织完整,细胞形态正常,胞核和胞质染色清晰,而SCI组打击部位出现组织坏死、细胞变性、水肿、结构紊乱,伴有不同程度的出血及中性粒细胞浸润为主要表现,SCI+GB1107组脊髓损伤情况明显缓解,组织坏死、细胞变性、水肿、出血及等情况均有改善;（4）与对照组相比,SCI组大鼠血清p65、TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平明显增加,SOD,CAT、GSH-PX活性明显降低;与SCI组相比,SCI+GB1107组大鼠血清p65、TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平明显降低,SOD,CAT、GSH-PX活性明显增加（P<0.05）;（5）与对照组相比,SCI组大鼠脊髓组织中Gal-3 mRNA表达水平明显增加;与SCI组相比,SCI+GB1107组大鼠脊髓组织中Gal-3 mRNA表达水平明显降低（P<0.05）。第二部分:（1）与对照组相比,SCI组中差异最大的有8个基因上调,7个基因下调;GO分析生物学过程共涉及8种。PPI分析差异表达基因总共23个节点,共有七种配对关系,信号通路主要集中在NLRP3和TXNIP蛋白。（2）与对照组相比,Gal-3干预组Gal-3、TXNIP以及NLPR3蛋白明显高于阴性对照组;与SCI组相比,SCI+GB1107组中Gal-3、TXNIP以及NLPR3蛋白表达明显降低（P<0.05）。第三部分:（1）与LPS组相比,LPS+si-Gal-3转染组IL-1β、MDA、ROS表达水平明显降低,SOD、CAT以及GSH-PX的水平明显升高（P<0.05）;（2）LPS+ROS抑制剂+Gal-3组表达水平明显高于LPS+ROS抑制剂组（P<0.05）;（3）Gal-3的过表达诱导TXNIP/NLRP3蛋白表达,并增加IL-1β水平。结论:体内SCI模型中,Gal-3表达上调,抑制Gal-3表达可减弱脊髓损伤后神经炎症反应。体外诱导PC12模型中,抑制Gal-3的表达可减弱损伤后神经炎症和ROS的产生;ROS可调控Gal-3对氧化应激的作用。总之,Gal-3通过激活ROS/TXNIP/NLRP3信号通路促进SCI后的神经炎症反应;Gal-3可能是SCI的一种潜在治疗策略。
韩诚[6]（2019）在《从“肾脑相关”论衰老学习记忆功能减退的脑功能失衡机制》文中研究指明目的:研究衰老状态下学习记忆功能减退在脑不同层次阴阳失衡的表现和发生机制,初步阐明地黄饮子对衰老模型小鼠海马突触可塑性的作用机制,为补肾健脑法提供现代生物学依据。方法:采用理论探讨与实验研究相结合的方法。1、理论探讨:系统梳理中医学和现代医学对衰老及学习认知的认识,探讨从肾论治衰老学习记忆功能减退的可能性。2、实验研究:（1）实验分组:设正常对照组、衰老模型组、地黄饮子（低、中、高剂量）组和盐酸美金刚阳性药物组共计6组。其中,以6月龄雄性SAMP8小鼠作为衰老动物模型,以同月龄雄性SAMR1小鼠为正常对照,其他各组采用同月龄雄性SAMP8小鼠并给予药物干预。（2）给药干预:各组动物正常饮食条件喂养至5月龄后,从第6个月开始地黄饮子（低、中、高剂量）组小鼠分别每天灌胃不同浓度的地黄饮子水煎液（7.51g/kg·d、15.02g/kg·d、30.04g/kg·d）,盐酸美金刚组小鼠灌胃盐酸美金刚混悬液（3.03mg/kg·d）,正常对照组和衰老模型组动物小鼠灌胃等量溶媒。各组动物每天灌胃给药1次,连续1个月后,进行如下指标检测。（3）学习记忆能力评价:采用Morris水迷宫和新物体识别实验方法评价各组小鼠的空间学习能力、空间参考记忆力和新物体识别能力。（4）突触结构可塑性检测:采用透射电镜技术观察各组小鼠神经元和突触结构的形态变化。（5）突触功能可塑性检测:对各组小鼠海马内“schaffer侧枝-CA1区”突触回路进行在体场电位记录实验,观察LTP和LTD现象,评价突触传递效率。（6）海马神经递质检测:采用酶联免疫吸附实验方法检测各组小鼠海马组织谷氨酸和γ-氨基丁酸含量的差异。（7）谷氨酸受体和钙调素依赖性蛋白激酶II的检测:采用蛋白免疫印迹法检测各组小鼠海马组织AMPAR2、NMDAR1、pNMDAR1、NMDA2A、pNMDA2A、NMDA2B、pNMDA2B、CaMKII、pCaMKII共9个蛋白的含量和磷酸化水平。结果:1.理论研究结果:基于“肾脑相关”理论,从经络联系、精髓关系、元神、肾志与脑神的关系,以及阴阳变化5个方面探讨了从肾论治衰老学习记忆功能减退的可能性;并且基于阴阳学说理论,认为现代脑科学相关研究成果都是阴阳之象,是对中医阴阳理论的丰富和扩展,用阴阳的思维模式去认识脑具有可行性。2.实验研究结果:（1）行为学检测结果:Morris水迷宫检测结果显示,与正常对照组相比较,衰老模型组小鼠空间学习记忆能力显着下降（P<0.05）;与衰老模型组相比,地黄饮子高剂量可以有效提升小鼠空间辨识和记忆提取能力,减少空间搜索时间（P<0.05）;新物体识别显示,与正常对照组相比较,衰老模型组小鼠记忆力受损（P<0.05）;与衰老模型组相比,地黄饮子高、中剂量均能使小鼠准确区分被更换的物体（P<0.05）,并增加其对新物体辨识的时间（P<0.01）。（2）在体场电位记录结果:快速老化的SAMP8小鼠的兴奋性突触后电位经过200Hz的高频刺激后增幅不明显,LTP效应明显低于相同月龄的抗老化SAMR1小鼠（P<0.001）,给予地黄饮子治疗后,则可以有效增强模型小鼠的LTP效应（P<0.05）。而在2Hz的低频刺激下,各组小鼠LTD的易化效应和EPSP的抑制程度具有明显的差异。与6月龄的快速老化SAMP8小鼠相比,相同月龄的抗老化SAMR1小鼠LTD效应仅在低频刺激后的小段时间内受到强化,随着时间流逝,其LTD易化现象逐渐恢复,突触后的兴奋性电位逐渐恢复正常（P<0.001）;给予地黄饮子治疗后,地黄饮子高剂量组小鼠的LTD效应也得到一定程度的恢复（P<0.05）。（3）透射电镜检测结果:通过透射电镜我们可以观察到,模型组小鼠的海马CA1区神经元细胞损伤、突触间隙增大或消失,突触前、后膜不清晰,突触小泡减少,突触后致密物质变薄;线粒体结构崩解,嵴断裂或溶解。给予地黄饮子灌胃治疗后,神经元细胞器损伤减少,突触结构得到修复。（4）ELISA检测结果:衰老模型组小鼠海马内Glu与GABA含量显着增加（P<0.001）,经过药物治疗后,各组小鼠海马内Glu与GABA含量均有所降低,尤其是地黄饮子高剂量组的Glu与GABA含量降低最明显（P<0.01）。（5）WB检测结果:SAMP8模型小鼠海马内AMPAR2、NMDAR1和NMDA2B的含量升高（P<0.05）,CaMKII含量降低（P<0.05）,pNMDAR1、pNMDA2A和pNMDA2B的含量增高（P<0.05）,pCaMKII含量降低（P<0.05）。运用地黄饮子治疗后,中剂量地黄饮子可以有效降低NMDAR1的蛋白含量（P<0.01）;高剂量地黄饮子可以有效增加CaMKII的蛋白含量和磷酸化程度（P<0.05）,降低AMPAR2、NMDA2B和pNMDA2B的异常表达（P<0.05）。结论:1.海马组织Glu和GABA含量增高、代谢失衡与衰老状态小鼠学习记忆功能减退有关;2.海马“schaffer侧枝-CA1区”突触回路的LTP/LTD效应失衡是衰老状态下学习记忆功能减退的脑电生理层面阴阳失衡的机制;3.海马神经细胞内钙离子超载是衰老状态下脑电生理和氨基酸神经递质层面阴阳失衡的关键因素。4.补肾方剂地黄饮子可通过调节神经细胞内钙离子浓度,抑制钙内流而易化神经突触可塑性,从而改善衰老小鼠的学习记忆功能。
宋兴磊[7]（2019）在《离子通道ASIC1a的膜表面标记与可视化研究》文中研究指明酸敏感离子通道（acid-sensing ion channels,ASICs）作为中枢神经系统（central nervous system,CNS）主要的p H感受器能被胞外H+激活,通道开放介导阳离子内流。ASIC1a作为构成通道的主要亚基在CNS广泛表达,参与多种病理生理过程,如恐惧记忆、缺血性脑卒中和痛觉感受等。在大脑中,ASIC1a贡献多个脑区的突触传递和可塑性,并参与调节多种形式的学习记忆,但具体机制并不清楚。ASIC1a在树突棘中富集,神经元ASIC1a的膜表达受到组成型内吞的严格调控,脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是突触可塑性的重要调节分子,同时也调节脊髓背角神经元ASIC1a的膜表达,提示神经元ASIC1a的膜转运在调节突触功能方面发挥重要作用。我们以ASIC1a的定位为切入点,通过对细胞膜表面通道分子进行标记和可视化系统观察膜表面ASIC1a在皮层神经元中的分布以及活性依赖的突触中ASIC1a的动态变化,探索ASIC1a的膜转运与突触活动之间的联系。人源ASIC1a（h ASIC1a）对于揭示p H在脑功能和脑疾病中的作用意义重大。我们通过在h ASIC1a胞外域不同柔性区插入标签序列筛选到了h ASIC1a-298HA299以及从噬菌体组合抗体库中筛选到了特异识别h ASIC1a胞外域的抗体Ab6-Ig G1。为了实时观测膜表面ASIC1a的动态变化,我们在胞外域插入p H敏感的GFP变体(h ASIC1a-298p Hluorin299),同时对Ab6-Ig G1进行荧光标记修饰（Ab6-Ig G1-Alexa488）。借助于膜标记工具、共聚焦和超高分辨显微镜,我们首次细致分析了膜表面h ASIC1a在神经元上的亚细胞分布以及精细突触定位,h ASIC1a聚簇分布在胞体和树突的细胞膜上,尤其富集于树突棘头部,呈现突触周（peri-synaptic）定位。利用钙成像、荧光漂白恢复（fluorescence recovery after photobleaching,FRAP）技术、全内反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscope,TIRF）和单颗粒示踪（single-particle tracking,SPT）,结合体外活性刺激范式,我们发现chem LTP以ASIC1a依赖的方式诱导树突棘结构变化和钙活动的增强,从细胞水平验证了ASIC1a在突触可塑性中的关键作用。BDNF和chem LTP均能调节皮层神经元ASIC1a的膜表达,增强h ASIC1a靶向树突棘的正向膜转运,BDNF还能促进膜表面h ASIC1a的侧向运动;响应chem LTP刺激,树突棘中h ASIC1a发生由突触周到突触后（post-synaptic）的定位变化。在chem LTP诱导阶段,ASIC1a膜转运的变化从时程上先于AMPA受体;但在chem LTP表达阶段ASIC1a的膜转运出现相反的变化趋势,提示ASIC1a可能在LTP的诱导中发挥触发作用。综上,我们在静态及动态情况下对细胞膜表面h ASIC1a进行标记及可视化,为深入探索ASICs的定位-功能提供高效的工具支撑。利用这些工具,我们研究了兴奋性突触中h ASIC1a的精细定位和动态变化,发现了神经活动依赖的ASIC1a分子行为的改变,从膜转运的角度阐释了ASIC1a调节突触功能的新的分子细胞机制。
赵凡[8]（2019）在《脑氧化应激下的活体电化学分析》文中研究表明氧化应激是指机体氧化与抗氧化作用的不平衡,且倾向于氧化作用,过量活性氧物质引发细胞毒性,进而造成机体损伤。大脑是人体需氧量最多的器官,其更易受氧化应激作用的影响,触发多种脑疾病,如癫痫、缺血等。氧化应激发生时,多种离子如H+、Ca2+、K+,神经递质分子如谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）等参与其中,因此深入了解氧化应激过程的化学本质,对于解析脑氧化应激相关疾病的发病机制及病理过程具有重要意义。电化学方法由于其优良的化学特异性、高时空分辨率、实时在体连续监测等优点,广泛应用于脑活体分析中。然而脑微环境复杂、神经化学干扰物质众多且相互关联,因此建立高选择性、高灵敏度、高准确度、多物质同时分析的在体电化学分析新方法仍是分析化学中的挑战之一!通过广泛的文献调研,本论文以解决脑氧化应激状态下活体电化学分析中所存在的关键科学问题为目的,设计并发展了如下活体电化学分析新方法:（1）基于对H+有特异性响应电活性分子的生物传感器用于鼠脑pH值的在体测定分析。在本工作中,设计并合成了一种对pH有特异性响应的电活性分子Fc-Py,其中,吡啶基团（Py）作为H+识别基团,二茂铁基团（Fc）作为电活性基团,随着pH值的减小,Fc-Py中Py基团逐渐被质子化,Fc-Py吸电子能力逐渐增强,导致Fc基团更难被氧化,表观电位E1/2向正电位方向移动,从而构成了pH识别通道;其次,pH惰性的巯基二茂铁（FcHT）作为参比分子,构筑了参比通道,用以校正体内外环境差异所引起的误差;与此同时,笋状金纳米颗粒修饰的碳纤维微电极（CFME）大大增强了电流信号强度。该双通道比率型电化学传感具有高选择性,在pH为5.9-8.0的范围内呈现良好的线性,成功实现了正常及缺血状态下鼠脑不同脑区（纹状体、海马、和皮层）pH值的准确测定。结果表明缺血5分钟后,纹状体和海马区pH平均降低了0.5个单位,而皮层的pH基本无变化。这种比率型电化学方法具有普适性,为鼠脑中其他物质的检测分析提供了一种更可靠的模式。（2）基于双功能电化学生物传感器的Ca2+与谷氨酸同时在体电化学分析。本工作中,铂纳米颗粒（Pt NPs）和谷氨酸氧化酶（GluOx）共修饰的铂丝微电极（Pt ME）作为电流型谷氨酸检测电极,全固态钙离子选择性微电极（Ca-ISME）作为电位型Ca2+测定电极,将两者有机结合起来构成双功能微电极（DFME）生物传感器,两者信号间没有干扰,因此可用于谷氨酸与Ca2+的同时监测。该双功能生物传感器具有良好的选择性,在Ca2+浓度为5μM-70 mM,谷氨酸浓度为1100μM的范围内呈现良好的线性关系,且检测限较低(谷氨酸为0.5μM,Ca2+为1μM),最终成功应用于鼠脑扩散性抑制（SD）及缺血过程中Ca2+与谷氨酸的动态变化监测。结果表明,鼠脑缺血过程中Ca2+与谷氨酸浓度变化大于SD期间,从而证明了缺血导致神经元死亡的兴奋性毒性假说。该研究为多物质同时在体检测提供了一种简单有效的方法,为解析脑生理病理过程奠定了分子学基础。（3）发展了一种电化学生理学工具用于自由移动鼠脑中多离子的实时分析及电化学成像。本工作中,设计并合成了对K+有特异性响应的识别分子TAC,筛选了对Na+、Ca2+、pH响应的离子载体,结合微电极阵列（MEA）技术,构建了8通道离子选择性微阵列K-ISMEA（K+ion selective microelectrode array）,Ca-ISMEA,Na-ISMEA及H-ISMEA,其中7通道为离子选择性电极通道,剩余的一个通道为参比通道,实现了K+、Na+、Ca2+或pH的准确定量检测及成像分析;构建了5通道M-ISMEA（multi-ion selective microelectrode array）,四通道为K-ISME,Ca-ISME,Na-ISME及H-ISME离子选择性微电极通道,剩余的一个通道为参比通道,实现了K+、Na+、Ca2+及pH的同时测定分析;结合电生理测定微电极,发展了一种电化学生理学方法用于场电位（LFP）及K+、Na+、Ca2+、pH的实时分析及电化学成像。该生物传感器具有高选择性、高时空分辨率、准确度高、稳定性好,且具有良好抗蛋白质吸附能力,实现了鼠脑缺血及自由移动大鼠癫痫状态下K+、Na+、Ca2+、pH的定量检测及成像分析;此外,M-ISMEA还被用于精确示踪给药及电刺激治疗癫痫时鼠脑中K+、Na+、Ca2+、pH的动态变化,结果表明我们所发展的电化学生理学方法在癫痫病理基础研究及临床候选药物开发等方面具有广阔的应用前景。
杨亚娟[9]（2019）在《黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇改善氧化应激介导的糖尿病动物心房重构》文中研究表明目的心房颤动（房颤,AF）的发病机制十分复杂,包括炎症,氧化应激及钙稳态异常等。黄嘌呤氧化酶（XO）是嘌呤代谢过程的关键酶,其过度激活可使体内氧化应激水平升高。在本研究中,我们探讨了氧化应激和钙调控异常与心房电重构及结构重构的关系,以及黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇对以上病理过程的干预作用。方法本研究的动物实验部分应用了两种糖尿病动物模型:糖尿病兔模型和糖尿病大鼠模型。将90只成年大耳白兔随机分为3组:对照组（C,n=30）,糖尿病组（DM,n=30）及别嘌呤醇干预组（ALLO,n=30）,以四氧嘧啶溶液经兔耳缘静脉注射建立糖尿病兔模型。将成年雄性SD大鼠随机分为3组:对照组（n=30）,糖尿病组（n=30）及别嘌呤醇干预组（n=30）,以链脲佐菌素经大鼠尾静脉注射建立糖尿病大鼠模型。别嘌呤醇干预组在糖尿病模型建立成功后开始给药,药物干预时间为8/6周。在糖尿病兔/大鼠模型建立成功8/6周后,对各组动物进行在体心脏超声检查及血流动力学检测,取血清及组织标本,测定血清氧化应激指标,包括黄嘌呤氧化酶、一氧化氮、超氧化物歧化酶及丙二醛等。通过离体心脏灌流进行电生理研究,测定各组动物心房间传导时间,房室传导周期,心房有效不应期及房颤诱发率。通过马松染色观察心房间质纤维化水平,通过HE染色观察心房肌细胞排列情况。通过免疫组化观察心房组织XO表达情况,通过western blot法检测氧化应激（XO,Mn-SOD）,心肌纤维化及其上游相关蛋白（TGF-β,p-38,P-p38,JNK,P-JNK,ERK,P-ERK）、钙通道调控蛋白(Cav1.2,RyR2,SERCA2a,NCX,FKBP12.6,PLB,P-PLB)及线粒体代谢相关蛋白（TFAM,NRF-1,Drp-1,mfn1）表达情况。利用膜片钳技术测定左心房心肌细胞L型钙电流并利用共聚焦显微镜测定细胞内钙瞬变。为进一步研究钙信号通路上游的调控机制,通过免疫组化,western blot及PCR观察心房组织CaMKII及p-CaMKII蛋白及mRNA表达情况。培养小鼠心房肌细胞系HL-1细胞,将细胞随机分为4组:对照组,血管紧张素II（AngII）刺激组,别嘌呤醇预处理（10μM）+AngII刺激组,别嘌呤醇预处理（100μM）+AngII刺激组。通过检测HL-1细胞中ROS生成及MnSOD等蛋白表达测定各组HL-1细胞氧化应激水平,测定各组细胞CaMKII及p-CaMKII蛋白表达水平。结果超声检查及病理学研究发现,与对照组相比,糖尿病组动物左心室肥厚及心房间质纤维化程度增加,发生明显心脏结构重构。在电生理研究中,糖尿病组动物心房间传导时间及房室传导周期延长,房颤诱发率明显升高,发生明显心脏电重构。糖尿病组兔血清氧化应激指标,包括黄嘌呤氧化酶（XO）、一氧化氮（NO）及丙二醛（MDA）水平明显升高。另外,通过western blot检测蛋白表达发现,氧化应激、纤维化相关蛋白,包括XO,Mn-SOD,NF-κB,TGF-β,P-p38,P-JNK,ERK,P-ERK及线粒体合成代谢相关蛋白,包括TFAM,NRF-1,Drp-1,mfn1在糖尿病心房组织中表达水平均明显升高,应用别嘌呤醇干预可抑制心房结构重构及电重构,降低氧化应激、纤维化蛋白及线粒体合成相关蛋白表达。此外,糖尿病动物心房组织中钙通道蛋白如Cav1.2,NCX表达增加,L型钙电流密度及细胞内钙瞬变幅度均增大,提示糖尿病动物心房细胞内钙离子调控异常,应用别嘌呤醇干预后可改善钙离子通道重构。免疫组化及western blot显示糖尿病组动物心房组织CaMKII及p-CaMKII表达增加,应用别嘌呤醇干预后可降低其表达水平。另外,应用AngII刺激HL-1细胞后ROS生成及MnSOD表达水平有所上调,且CaMKII及p-CaMKII蛋白表达有一定程度升高,给别嘌呤醇干预后可在一定程度降低其水平。结论别嘌呤醇作为一种抗氧化剂,可通过抑制黄嘌呤氧化酶活性,减少体内活性氧的生成,抑制CaMKII活性,从而改善糖尿病兔心房结构重构及电重构,抑制细胞内钙离子调控异常,并改善线粒体代谢异常。因此,别嘌呤醇有可能成为糖尿病相关房颤的一种上游治疗方法。关于别嘌呤醇对房颤的治疗作用尚需进一步研究。
匡怡[10]（2019）在《大豆苷元对大鼠心室肌细胞离子通道的影响》文中研究指明目的:观察大豆苷元（daidzein,DD）对大鼠心室肌细胞钠通道、瞬时外向钾通道、L型钙通道的电流及动力学特征的影响,探讨其对心肌细胞保护作用的机制。方法:MTT法检测DD的毒性;Langendorff主动脉逆行灌流和单酶解法分离大鼠单个心肌细胞;通过全细胞膜片钳技术,在电压钳模式下观察、记录、分析DD不同剂量组低（1μmol/L）、中（3μmol/L）、高（10μmol/L）)给药前、后大鼠心肌细胞离子通道电流及其动力学特征的变化。结果:1.DD对乳鼠心肌细胞活力的影响:SD乳鼠心肌组织经0.25%的胰酶液4次消化,获得心肌细胞。后接种于培养皿中,隔24～48 h换液。待倒置显微镜下观察心肌细胞充斥视野80-90%时,在乳鼠心肌培养细胞液中加入不同浓度DD（0.1、0.3、1、3、10、30、100）μmol/L,再继续培养24 h后,随着药物浓度增加而降低,细胞的存活率也不断下降。其中,当所加入的DD终浓度为30～100 μmol/L时,心肌细胞活力的降低最明显,与给药前相比,差异具有显着性（p<0.05）。因此,我们选取DD终浓度为1、3、10μmol/L作为后续膜片钳实验时的用药剂量。2.急性分离的心肌细胞形态学观察:倒置显微镜下观察急性分离的单个心肌细胞。首次即时分离的大鼠心肌细胞多见长杆状,横纹清晰,细胞膜边缘完整,立体感强,表面无凹陷和气泡。大多处于静息状态（比例70%-90%）,少部分已收缩为椭圆状或者团状。复钙后,40%～60%的细胞保持仍保持原有形态,其将被用于下面的药物干预实验。3.DD对大鼠心肌细胞钠通道的影响:（1）DD对INa的浓度依赖性:在协定的保持电位和钳制电位下,引导出INa。与对照组相比,低浓度DD（0.1μmol/L）对INa无影响。但随着DD浓度的增加（0.3-10μmol/L）,药物则对INa呈现出抑制作用,其电流密度由给药前的（-53.9±6.35）pA/pF依次降为给药后的（-33.78±3.24）pA/pF、（-25.16±4.24）pA/pF、（-22.28±3.54）pA/pF 和（-17.96±4.56）pA/pF（P<0.05）,表现出浓度依赖性抑制作用。（2）DD对INa的电流-电压（Ⅰ-Ⅴ）曲线的影响:与对照组相比,DD 1、3、10μmol/L使电流-电压（Ⅰ-V）曲线上移。但是,Ⅰ-Ⅴ曲线的轨迹趋势、通道电流的激活电位、电流峰值电位和反转电位未变化。（3）DD对INa的激活和失活动力学的影响:按照特定的刺激方案,引导出INa的激活和失活曲线,给予不同浓度的DD（1、3、10μmol/L）后,观察其对INa的激活和失活曲线的影响。结果显示:DD（1、3、10μmol/L）使激活曲线向去极化方向移动。给药前及三个浓度下激活曲线的半数激活电压 V1/2 依次为（-40.99±0.32）mV、（-38.81±0.19）mV、（-35.67±0.78）mV、（-31.94±0.43）mV（P>0.05）,可见 DD 延迟了钠通道的激活的趋势。DD（1、3、10 μmol/L）使失活曲线向超极化方向移动。给药前及三个浓度下失活曲线的半数失活电压V1/2依次为（-74.42±0.44）mV、（-79.74±0.45）mV、（-82.81±0.59）mV和（-86.5±0.77）mV（P<0.05）,即DD加快钠通道的失活。（4）DD对INa失活后恢复曲线:同等条件下,DD给药后使INa的失活后恢复曲线左移,τ为通道失活后恢复时间常数由给药前（21.35±0.13）ms依次变为（15.49±0.24）ms、（13.30±0.32）ms和（11.31±0.22）ms（P<0.05）。结果表明,DD以浓度依赖性加快INa从失活态向激活态转变的时间。4 DD对大鼠心肌细胞瞬时外向钾通道的影响:（1）DD对Ito的浓度依赖性:稳态激活程序激引发出外向电流,加入4-AP可显着阻断该电流,证实该电流为Ito。待电流趋于稳定后,用细胞外液冲洗后,Ito电流逐渐恢复到给药前水平,提示DD对Ito的作用是可逆的。DD（0.1 μmol/L）对Ito几乎不影响,而DD在0.3、1、3、10μmol/L浓度下对心室肌细胞Ito抑制作用越来越强。（2）DD对Ito的电流-电压（I-V）曲线:在DD（0-10μmol/L）下,给予连续变化的步阶,测通道电流的大小作出Ito电流-电压（Ⅰ-V）曲线。与对照组相比,It。的电流密度随浓度增加而减小。然而,Ⅰ-Ⅴ曲线形态以及反转电位保持不变。（3）DD对Ito的激活和失活动力学:空白对照条件下,归一化拟合激活电导曲线的V1/2为（13.07±0.58）mV,k 为（13.87±0.52）。1、3、10 μmol/L DD 分别为（15.76±0.40）mV/（13.43±0.35）、（17.59±0.67）mV/（13.83±0.59）、（19.65±0.48）mV/（13.34±0.43）（P>0.05）。稳态失活曲线的V1/2和 k 值（0、1、3、10μmol/L）分别为（-20.03±0.41）mV/（15.16±0.36）、（-22.27±0.35）mV/（15.50±0.31）、（-24.89 ± 0.42）mV/（15.28±0.38）、（-27.74±0.55）mV/（15.31±0.49）（P>0.05）o当DD作用后,稳态和激活曲线均几乎没有发生移动。因此,DD并未从Ito的激活和失活状态影响通道的开放和关闭难易。（4）DD对Ito失活后恢复曲线:给予细胞膜电压刺激,开放的通道会逐渐失活,再给予电压刺激通道将不再开放成失活态,最后给予一电压刺激,失活态逐渐恢复。引发DD作用前后的瞬时外向钾通道失活后恢复电流,并可拟合电流恢复曲线。DD使Ito失活后恢复曲线显着右移,τ随浓度增加而延长（P<0.05）。5.DD对大鼠心肌细胞L型钙通道的影响:（1）心肌细胞ICa-L的确定:经方波刺激诱发一串内向电流,该电流可分别被含有CdCl2（钙通道阻滞剂）、NiC12（特异型T型钙通道阻滞剂）、维拉帕米（特异性L型钙通道阻滞剂）的台式液灌流几乎阻断、几乎不被阻断、几乎阻断,证明所记电流是L型钙电流（P<0.01）。DD（3 μmol/L）明显抑制 ICa-L,peak（P<0.01）。（2）DD对ICa-L的浓度依赖性:探究DD在0.1、0.3、1、3、10μmol/L浓度下对心室肌细胞 ICa-L 的作用。DD（0.1μmol/L）对 ICa-L影响微弱,而 DD（0.3、1、3、10μmol/L）使得大鼠心室肌细胞 ICa-L从给药前（-17.39±0.61）pA/pF 分别降至（-11.44±0.67）pA/pF、（-9.53±1.58）pA/pF、（-6.70±0.65）pA/pF 和（-2.45±0.54）pA/pF;与对照组相比,低浓度 0.3、1μmol/LDD就具备抑制效果,且效果明显（P<0.05）,提示DD呈浓度依赖性抑制L型钙通道电流,随浓度增加,抑制作用愈强。待电流趋于稳定后,用细胞外液冲洗后,ICa-L电流逐渐恢复到给药前水平提示DD对ICa-L的作用是可逆的的。（3）DD对ICa-L的电流-电压（Ⅰ-Ⅴ）曲线:当DD（1-10μmol/L）作用后,ICa-L和电流密度逐渐减少。Ⅰ-Ⅴ曲线在（-20-+20mV）电压范围下随电流密度降低而显着上移。而Ⅰ-Ⅴ曲线形态以及反转电位并没有明显变化。（4）DD对ICa-L的激活和失活动力学:ICa-L的激活曲线和失活曲线随DD浓度越高显着均向超极化方向移动。给药前以及各浓度DD（1-10 μmol/L）的激活曲线的半最大激活电压V1/2 和斜率因子 k 分别为（-9.13±0.57）mV/（4.52 ± 0.55）、（-14.10±0.65）mV/（4.70±0.54）、（-20.17±1.55）mV/（5.00±1.44）、（-28.76±1.44）mV/（4.80±1.33）（P<0.05）,说明 DD 可加快 L型钙通道激活。给药前以及各浓度DD的激活曲线的半最大失活电压V1/2斜率因子和k分别为（-19.82±0.55）mV/（14.11±0.49）、（-30.21±0.70）mV/（16.29±0.63）、（-42.61±1.00）mV/（15.77±0.92）和（-52.83±1.16）mV/（12.66±1.08）（P<0.05）,表明该药物加快了L型钙通道的失活。（5）DD对ICa-L失活后恢复曲线:DD使ICa-L的失活后恢复曲线右移,而1μmol/L DD使τ由给药前（10.50±0.45）ms 变为（16.75±0.65）ms;同样给予 3、10μmol/LD 后,τ为（21.50±0.73）ms和（29.00±1.07）ms,恢复时间呈明显延长（P<0.05）。结果表明,DD呈浓度依赖性延长ICa-L从失活态向激活态转变的时间。结论:DD以浓度依赖性阻滞瞬时外向钾通道;对钠通道和L型钙通道均可以浓度依赖和改变动力学特征阻滞,这些结果可能是DD保护心脏保护的作用机制。
二、神经细胞Na~+/Ca~(2+)交换体电生理特性及慢性大鼠脑缺血下Na~+/Ca~(2+)交换体表达的改变（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、神经细胞Na~+/Ca~(2+)交换体电生理特性及慢性大鼠脑缺血下Na~+/Ca~(2+)交换体表达的改变（论文提纲范文）
（1）H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 英汉缩略词对照(Abbreviations) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和来源 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 外源性H_2S体外磷酸化实验(~(32)P) |
| 2.1.1 重组质粒的转化 |
| 2.1.2 重组质粒的诱导表达 |
| 2.1.3 重组蛋白Rho A的分离与纯化 |
| 2.1.4 体外磷酸化 |
| 2.2 外源性H_2S实验 |
| 2.2.1 大鼠原代海马神经细胞培养与鉴定 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 神经细胞RhoA及ROCK_2活性测定 |
| 2.2.4 缺氧性损伤模型(Hypoxia-Reoxygenation Protocol) |
| 2.2.5 细胞活力的测量 |
| 2.2.6 神经特异性烯醇化酶(NSE)活性测定 |
| 2.2.7 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定 |
| 2.2.8 细胞膜蛋白和胞质蛋白的提取 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.2.10 全细胞膜片钳技术 |
| 2.3 内皮源性H_2S实验 |
| 2.3.1 原代脑血管内皮细胞培养 |
| 2.3.2 细胞共培养系统 |
| 2.3.3 流式细胞仪细胞凋亡测定 |
| 2.3.4 神经细胞内钙含量测定 |
| 2.3.5 H_2S浓度的测量 |
| 2.3.6 神经细胞活力和LDH及 NSE的测定 |
| 2.3.7 神经细胞RhoA及ROCK_2活性测定 |
| 2.3.8 Western blotting |
| 2.4 动物实验 |
| 2.4.1 质粒转染大鼠(脑立体定位注射) |
| 2.4.2 大鼠脑缺血模型(双侧颈总动脉结扎2VO) |
| 2.4.3 脑组织(海马)HE染色 |
| 2.4.4 脑组织(海马)TUNEL染色 |
| 2.4.5 血清LDH和 NSE测定 |
| 2.4.6 海马组织RhoA和ROCK_2活性测定 |
| 2.4.7 Western blotting |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 硫化氢(H_2S)对RhoA Ser188体外磷酸化的影响 |
| 3.1.1 目的蛋白在大肠杆菌(BL-21)中的表达 |
| 3.1.2 目的蛋白(RhoA~(wild),RhoA~(S188A))的纯化 |
| 3.1.3 NaHS(外源性H_2S)对RhoA Ser188体外磷酸化的影响 |
| 3.2 Ser188 介导NaHS对大鼠海马神经元的保护作用 |
| 3.2.1 大鼠原代海马神经细胞的培养与鉴定 |
| 3.2.2 真核质粒(RhoA~(wild)-pEGFP-N1;RhoA~(S188A)-pEGFP-N1)转染原代大鼠神经细胞 |
| 3.2.3 Ser188 介导Na HS诱导大鼠海马神经元Rho A的磷酸化 |
| 3.2.4 Ser188在Na HS诱导神经元中Rho A易位和失活的作用 |
| 3.2.5 RhoA Ser188在NaHS诱导的ROCK_2蛋白表达及其活性抑制的作用 |
| 3.2.6 Rho ASer188 介导Na HS对大鼠海马神经元H/R损伤的保护作用 |
| 3.2.7 Rho A Ser188 介导Na HS对 BKCa通道电流的影响 |
| 3.3 Ser188介导内皮源性H_2S对大鼠海马神经元的保护作用 |
| 3.3.1 大鼠原代脑血管内皮细胞(ECs)的培养与鉴定 |
| 3.3.2 内皮源性H_2S对神经元RhoA磷酸化,活性和易位的影响 |
| 3.3.3 内皮源性H_2S对神经元ROCK_2蛋白表达和活性的影响 |
| 3.3.4 内皮细胞中CSE产生内皮源性H_2S |
| 3.3.5 Ser188在CSE产生的H_2S诱导大鼠神经元RhoA磷酸化,转运和ROCK_2蛋白表达中的影响 |
| 3.3.6 Ser188在CSE产生的H_2S减轻神经元H/R损伤的作用 |
| 3.3.7 Ser188在CSE产生的H_2S对神经元(H/R损伤)RhoA和ROCK_2活性抑制的作用 |
| 3.3.8 Ser188在CSE产生的H_2S保护神经元H/R损伤的作用 |
| 3.4 Ser188 介导NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用 |
| 3.4.1 大鼠脑定位转染质粒的表达与检测 |
| 3.4.2 大鼠双侧颈总动脉结扎(2VO)模型验证 |
| 3.4.3 Ser188在NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤中海马组织Rho A磷酸化及其活性的影响 |
| 3.4.4 Ser188在NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤中海马组织ROCK_2蛋白表达及其活性的影响 |
| 3.4.5 Ser188在NaHS降低大鼠缺血再灌注损伤中LDH、NSE的影响 |
| 3.4.6 Ser188在NaHS减轻大鼠缺血再灌注损伤中海马组织病理学的影响 |
| 3.4.7 Ser188在NaHS减轻大鼠缺血再灌注损伤中海马神经细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 神经血管单位与缺血性脑中风关系 |
| 参考文献 |
（2）电生理及钙离子荧光成像检测MsrB1敲除对小鼠中枢神经系统的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 1 光电技术在神经生物学研究中的应用 |
| 1.1 电生理系统在LTP/LTD检测中的应用 |
| 1.2 钙离子荧光成像在神经生物学中的应用 |
| 2 硒蛋白概述 |
| 2.1 硒在人体的分布 |
| 2.2 硒蛋白的合成 |
| 2.3 硒蛋白的分类 |
| 2.4 硒蛋白的功能 |
| 3 甲硫氨酸亚砜还原酶 |
| 3.1 Msrs概述 |
| 3.2 Msrs对 Met可逆性氧化还原修饰 |
| 3.3 Msrs缺失与表型 |
| 3.4MsrB1 |
| 4 硒蛋白在神经系统中的功能 |
| 4.1 硒蛋白在大脑中的分布 |
| 4.2 硒蛋白与神经系统疾病 |
| 第一章 硒蛋白在小鼠大脑中的细胞类型特异性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 MsrB1及其他硒蛋白在大脑不同种类细胞中的表达差异 |
| 3 讨论 |
| 第二章 MSRB1基因敲除小鼠相关表型鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 MsrB1在各组织中的表达差异 |
| 2.2 MsrB1转基因敲除纯合鼠鉴定 |
| 2.3 Msr B1 缺失对其它Msrs基因的影响 |
| 2.4 MsrB1缺失对小鼠脑形态的影响 |
| 2.5 MsrB1缺失对小鼠新异环境中的自主行为、探究行为与紧张度的影响 |
| 2.6 MsrB1缺失对小鼠学习记忆能力的影响 |
| 2.7 Msr B1 缺失对小鼠LTP和 LTD的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三章 MSRB1转基因鼠表型的分子机制探究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 MsrB1缺失对小鼠海马突触功能及钙调激酶相关蛋白水平的影响· |
| 2.2 MsrB1缺失对小鼠神经元钙调节功能的影响 |
| 2.3 Ca MKⅡ α和 Ca MKⅡ β与 Msr B1 相互作用验证 |
| 2.4 5×TgAD转基因模型鼠繁育鉴定 |
| 2.5 AD转基因模型鼠Ca MKⅡ磷酸化水平检测 |
| 3 讨论 |
| 第四章 MSRB1转基因鼠蛋白质组学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 Msr B1 缺失对小鼠大脑Actin Met氧化水平的影响 |
| 2.2 蛋白质组学分析 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 指导教师对论文的学术评语 |
| 毕业论文答辩委员会决议书 |
| 简历及研究成果 |
| 致谢 |
（3）氟暴露下小鼠脑海马钙稳态变化分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRCT |
| 符号说明 |
| 1 绪论 |
| 1.1 地氟病对机体的危害 |
| 1.1.1 地氟病对骨相器官的危害 |
| 1.1.2 地氟病对非骨相器官的危害 |
| 1.2 氟中毒的发病机制 |
| 1.2.1 氟致氧化应激学说 |
| 1.2.2 氟致细胞凋亡 |
| 1.3 钙与氟中毒 |
| 1.3.1 氟致钙矛盾疾病理论 |
| 1.3.2 Ca~(2+)跨膜摄取 |
| 1.3.3 Ca~(2+)跨膜释出 |
| 1.3.3.1 细胞质中 Ca~(2+)的释出 |
| 1.3.3.2 胞内钙池Ca~(2+)的释放 |
| 1.4 研究意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物与分组 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 小鼠下切齿观察 |
| 2.4.2 小鼠血氟,血钙,尿氟,尿钙含量检测 |
| 2.4.3 HE染色观察小鼠海马组织CA1区形态结构 |
| 2.4.4 TUNEL法观测小鼠海马CA1 区细胞凋亡情况 |
| 2.4.5 小鼠海马细胞内Ca~(2+)水平观测 |
| 2.4.6 小鼠海马组织Na~+-K~+-ATP酶,Ca~(2+)-ATP酶活力检测 |
| 2.4.7 RT-PCR检测小鼠海马组织相关基因表达 |
| 2.4.8 Western Blot检测小鼠海马组织相关蛋白表达 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 氟中毒小鼠模型制备 |
| 3.1.1 小鼠氟斑牙观察结果 |
| 3.1.2 小鼠血氟、尿氟、血钙、尿钙测定结果 |
| 3.2 小鼠海马CA1区细胞形态结构观察结果 |
| 3.3 小鼠海马CA1区细胞凋亡观测结果 |
| 3.3.1 海马CA1区细胞凋亡观察 |
| 3.3.2 海马CA1区细胞凋亡率 |
| 3.4 小鼠海马组织细胞内Ca~(2+)水平测定结果 |
| 3.4.1 小鼠海马组织细胞内Ca~(2+)荧光探针负载 |
| 3.4.2 小鼠海马组织细胞内Ca~(2+)水平测定结果 |
| 3.5 小鼠海马组织相关酶活测定结果 |
| 3.5.1 小鼠海马Na~+-K~+-ATP酶活力测定结果 |
| 3.5.2 小鼠海马Ca~(2+)-ATP酶活力测定结果 |
| 3.6 小鼠脑海马细胞Cav1.2、NCS-1、PMCA、ATP2A2、IP3R m RNA表达测定结果 |
| 3.6.1 小鼠脑海马细胞L型钙离子通道Cav1.2 m RNA表达水平测定结果 |
| 3.6.2 小鼠脑海马细胞NCS-1和PMCA m RNA表达水平测定结果 |
| 3.6.3 小鼠脑海马细胞IP3R和 ATP2A2 m RNA表达水平测定结果 |
| 3.7 小鼠脑海马细胞Cav1.2、NCS-1、PMCA、SERCA2、IP3R蛋白水平测定结果 |
| 3.7.1 小鼠脑海马细胞L型钙离子通道Cav1.2蛋白表达水平测定结果 |
| 3.7.2 小鼠脑海马细胞NCS-1和PMCA蛋白表达水平测定结果 |
| 3.7.3 小鼠脑海马细胞IP3R和 SERCA2 蛋白表达水平测定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的成果 |
（4）系统生物学视角下苦碟子治疗缺血性脑卒中的效应机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 基于中医“平衡”思想认识缺血性脑卒中神经细胞损伤的病理机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 苦碟子治疗缺血性脑卒中临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 研究一 苦碟子治疗缺血性脑卒中的效应研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 苦碟子对缺血再灌注损伤模型大鼠神经功能评分的改善作用 |
| 3.2 苦碟子对缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织形态学的改善作用 |
| 3.3 苦碟子对缺血再灌注损伤模型大鼠病灶脑区细胞凋亡的改善作用 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 缺血再灌注模型大鼠缺血半影区蛋白表达谱的变化以及苦碟子的作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 缺血再灌注损伤模型大鼠缺血半影区蛋白质表达谱分析 |
| 3.2 苦碟子治疗后模型大鼠缺血半影区蛋白质表达谱分析 |
| 3.3 苦碟子治疗缺血再灌注损伤的关键靶蛋白验证 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 苦碟子主要成份鉴定和网络药理学研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 苦碟子所含成份的测定 |
| 3.2 苦碟子入脑成份的鉴定 |
| 3.3 苦碟子入脑成份靶标的预测与分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究四 苦碟子对神经细胞兴奋毒性损伤的改善作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同浓度谷氨酸对PC12细胞活力的影响 |
| 3.2 苦碟子及其入脑有效成份对于神经细胞兴奋毒性的保护作用 |
| 3.3 苦碟子及其入脑有效成份对于神经细胞内外谷氨酸水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究五 苦碟子及其入脑有效成份干预PC12细胞后的转录组测序 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 测序数据过滤及参考基因对比 |
| 3.2 基因定量分析 |
| 3.3 各实验组差异基因富集分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究六 苦碟子调节神经递质水平治疗缺血性脑卒中的机制探索 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 差异蛋白质网络核心模块与核心调节基因列表的富集荟萃分析 |
| 3.2 核心调控通路中基因表达量的验证 |
| 3.3 核心调控通路的相关性网络分析 |
| 3.4 通路调控转录因子与下游相关基因关系的预测 |
| 3.5 抑制剂干预后对苦碟子及其入脑有效成份调控效果的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 本研究的思路设计与技术应用 |
| 2 体内实验探查缺血性脑卒中的病理变化及苦碟子的治疗效果 |
| 3 体外实验探查苦碟子调节神经递质水平的分子机制 |
| 4 整合体内外结果阐释苦碟子治疗缺血性脑卒中的分子机制 |
| 5 本课题的创新点与不足 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（5）Gal-3在大鼠急性脊髓损伤炎症反应中的作用及调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Gal-3 在大鼠急性脊髓损伤模型中的表达及作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 Gal-3 促进大鼠急性脊髓损伤炎症反应的可能机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 技术路线图 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 Gal-3 通过ROS/TXNIP/NLRP3 通路促进脊髓损伤后神经炎症反应 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）从“肾脑相关”论衰老学习记忆功能减退的脑功能失衡机制（论文提纲范文）
| 提要 |
| abstract |
| 引言 |
| 理论探讨 |
| 一、中医学对学习记忆功能的认识 |
| (一)“神”乃精神意识思维活动 |
| (二)五脏藏神协调认知过程 |
| (三)脑主元神启发灵机神明 |
| 二、中医学对衰老的认识 |
| (一)阴阳失衡而衰 |
| (二)五脏衰而寿尽 |
| (三)肾乃寿夭关键 |
| 三、从“肾脑相关”论衰老学习记忆功能减退 |
| (一)经络不通,肾脑失联 |
| (二)肾精不足,脑髓不满 |
| (三)元气衰竭,神去机息 |
| (四)志无所藏,神无所化 |
| (五)阴阳失调,迷惑健忘 |
| 四、现代医学对学习记忆功能的认识 |
| (一)学习记忆活动的行为模式 |
| (二)学习记忆活动的结构基础 |
| (三)学习记忆活动的物质基础 |
| 五、现代医学对衰老的认识 |
| (一)基因功能紊乱与衰老 |
| (二)细胞自噬与衰老 |
| (三)氧化应激-炎症-免疫与衰老 |
| (四)与衰老相关的其他学说及认识 |
| 六、衰老与学习记忆功能的关系 |
| (一)相关脑区突触可塑性的改变 |
| (二)中枢神经递质的改变 |
| (三)离子通道通透性与功能的改变 |
| (四)激素水平的改变 |
| 七、从肾论治衰老肾虚状态下学习记忆功能减退 |
| (一)基于阴阳失衡探究学习记忆功能减退 |
| (二)运用地黄饮子从肾论治学习记忆功能减退 |
| 实验研究 |
| 实验一 地黄饮子对SAM小鼠学习记忆功能的影响 |
| 一、实验材料 |
| (一)实验动物 |
| (二)实验仪器 |
| (三)药品与试剂 |
| 二、实验方法 |
| (一)实验设计 |
| (二)主要试剂及药品配制备 |
| (三)行为学实验检测 |
| (四)在体海马场电位记录 |
| (五)海马组织样本采集、固定与制片方法 |
| (六)统计方法 |
| 三、实验结果 |
| (一)地黄饮子对SAM小鼠空间学习记忆能力下降的改善作用 |
| (二)地黄饮子对SAM小鼠短期学习记忆能力下降的改善作用 |
| (三)地黄饮子对SAM小鼠海马突触结构可塑性的改善作用 |
| (四)地黄饮子对SAM小鼠海马突触功能可塑性的改善作用 |
| 四、讨论 |
| (一)地黄饮子参与调节学习记忆 |
| (二)地黄饮子参与调节海马突触可塑性 |
| (三)LTP/LTD效应失衡是衰老肾虚证脑电生理阴阳失衡的表现之一 |
| 五、小结 |
| 实验二 地黄饮子对SAM小鼠海马突触可塑性的作用机制研究 |
| 一、实验材料 |
| (一)实验动物 |
| (二)实验仪器 |
| (三)药品与试剂 |
| 二、实验方法 |
| (一)实验设计、分组情况及实验流程 |
| (二)主要试剂及药品配制 |
| (三)待测样本的收集与检测 |
| (六)统计方法 |
| 三、实验结果 |
| (一)酶联免疫法检测海马内Glu、GABA含量 |
| (二)Western blot检测海马内谷氨酸受体、CaMKII的表达 |
| 四、讨论 |
| (一)兴奋性与抑制性氨基酸神经递质代谢失衡是脑内神经递质阴阳失衡的表现之一 |
| (二)衰老状态下脑不同层次阴阳失衡的关键在于钙离子代谢异常 |
| (三)地黄饮子可以有效调节衰老状态下的学习记忆能力下降 |
| 五、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1.Master8 刺激器各阶段刺激模式程序 |
| 附录2.fEPSPs计算公式 |
| 附录3.各组小鼠海马透射电镜观察结果 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 论文着作 |
（7）离子通道ASIC1a的膜表面标记与可视化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 全文主要缩略词中英文对照表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 突触传递和可塑性与谷氨酸受体 |
| 1.2 酸敏感离子通道 |
| 1.3 酸敏感离子通道与突触传递和突触可塑性 |
| 1.4 关键科学问题与主要研究内容 |
| 1.4.1 关键科学问题 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 1.5 研究意义 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 生化分子试剂 |
| 2.1.4 细胞培养相关试剂、药品和材料 |
| 2.1.5 抗体 |
| 2.1.6 主要溶液配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞系与原代神经元培养 |
| 2.2.2 细胞系培养 |
| 2.2.3 质粒构建与细胞转染 |
| 2.2.4 基于组合抗体库筛选策略制备h ASIC1a胞外域抗体 |
| 2.2.5 细胞膜表面h ASIC1a标记和免疫染色 |
| 2.2.6 甘氨酸诱导的化学LTP |
| 2.2.7 胚胎电转 |
| 2.2.8 组织免疫染色 |
| 2.2.9 免疫电镜 |
| 2.2.10 膜蛋白抽提和蛋白免疫印迹 |
| 2.2.11 膜片钳电生理记录 |
| 2.2.12 荧光漂白恢复 |
| 2.2.13 超高分辨成像 |
| 2.2.14 抗体修饰和单颗粒示踪 |
| 2.2.15 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 ASIC1a贡献兴奋性突触结构和功能可塑性 |
| 3.1.1 ASIC1a与树突棘结构重塑 |
| 3.1.2 ASIC1a与突触钙活动 |
| 3.2 神经元质膜表面h ASIC1a标记与可视化 |
| 3.2.1 神经元上h ASIC1a的表达与分布 |
| 3.2.2 基于分子改造的h ASIC1a的膜表面标记 |
| 3.2.3 h ASIC1a在原代皮层神经元细胞膜上的亚细胞定位 |
| 3.2.4 针对h ASIC1a胞外域的抗体开发和h ASIC1a的膜表面标记 |
| 3.2.5 神经元细胞膜表面ASIC1a的动态可视化 |
| 3.3 BDNF与皮层神经元ASIC1a的膜转运 |
| 3.3.1 BDNF调控皮层神经元ASIC1a的膜表达 |
| 3.3.2 可视化 BDNF调控突触中h ASIC1a的动态变化 |
| 3.4 ASIC1a膜转运与LTP |
| 3.4.1 ASIC1a在兴奋性突触中的精细定位 |
| 3.4.2 LTP调控ASIC1a的膜转运 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞膜表面功能性的ASIC1a的标记与可视化 |
| 4.2 神经元膜表面ASIC1a的亚细胞分布 |
| 4.3 神经活动依赖的突触中h ASIC1a的动态转运 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 文献综述——质子,酸敏感离子通道与突触活动 |
| 1 H~+来源、分布调节有关的过程 |
| 1.1 H~+来源 |
| 1.2 H~+分布 |
| 1.3 中枢神经系统p H动态调控的转运子和酶 |
| 2 质子与神经元的兴奋性 |
| 2.1 质子与突触递质释放 |
| 2.2 质子与缝隙连接 |
| 2.3 质子敏感的G蛋白偶联受体 |
| 2.4 H~+调节电压门控离子通道的电导 |
| 2.5 质子与配体门控离子通道的电导 |
| 3 酸敏感离子通道与突触功能 |
| 3.1 神经细胞所处的p H环境 |
| 3.2 H~+受体的发现与基本性质 |
| 3.3 ASICs总体表达和分布 |
| 3.4 ASICs在神经元中的亚细胞定位 |
| 3.5 ASIC与神经元生理状态 |
| 3.6 ASICs与突触功能 |
| 3.7 调节ASICs功能和转运的分子机制 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及学术论文和科研成果目录 |
（8）脑氧化应激下的活体电化学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 氧化应激 |
| 1.1.1 氧化应激简介 |
| 1.1.2 缺血模型 |
| 1.1.3 癫痫模型 |
| 1.2 氧化应激相关小分子的生理作用 |
| 1.2.1 pH |
| 1.2.2 金属离子 |
| 1.2.3 谷氨酸 |
| 1.3 脑活体分析方法 |
| 1.3.1 磁共振成像(MRI) |
| 1.3.2 荧光法 |
| 1.3.3 表面增强拉曼光谱法(SERS) |
| 1.3.4 电化学方法 |
| 1.4 本文的研究目的、内容与创新点 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 研究内容和创新点 |
| 第二章 鼠脑中PH值的高准确度在体电化学分析 |
| 2.1 背景介绍 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 CFME/Au/MPA/Fc-Py及 CFME/Au/FcHT电极的制备 |
| 2.2.4 Wistar大鼠的培养及手术 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Fc-Py合成 |
| 2.3.2 双通道比率型pH电化学传感器的构建 |
| 2.3.3 CFME/Au/MPA/Fc-Py电极的表征 |
| 2.3.4 CFME/Au/MPA/Fc-Py电极的电化学性能 |
| 2.3.5 CFME/Au/MPA/Fc-Py电极与Au/MPA/Fc-Py电极的比较 |
| 2.3.6 双通道比率型pH电化学生物传感器的选择性 |
| 2.3.7 双通道比率型pH电化学生物传感器的稳定性与重现性 |
| 2.3.8 鼠脑缺血过程中pH值的实时在体电化学分析 |
| 2.4 本章结论 |
| 第三章 扩散性抑制(SD)和缺血过程中谷氨酸与钙离子的同时活体电化学分析 |
| 3.1 背景介绍 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料及试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 GluOx/PMPD/Pt-ME及 Ca-ISME电极的制备 |
| 3.2.4 Wistar大鼠的培养及手术 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DFME电化学生物传感器的构建 |
| 3.3.2 DFME电极的表征 |
| 3.3.3 DFME电极的电化学性能 |
| 3.3.4 DFME电极的选择性 |
| 3.3.5 DFME生物传感器的稳定性及重现性 |
| 3.3.6 SD以及缺血过程中谷氨酸和Ca~(2+)的同步在体电化学分析 |
| 3.4 本章结论 |
| 第四章 自由移动鼠脑中多离子实时分析及电化学成像 |
| 4.1 背景介绍 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料及试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 8通道K-ISMEA(Ca-ISMEA,Na-ISMEA,H-ISMEA)及 M-ISMEA电极的制备与修饰 |
| 4.2.4 Wistar大鼠的培养及缺血模型构建 |
| 4.2.5 癫痫模型构建 |
| 4.2.6 海马切片的制备 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 钾离子载体TAC的合成 |
| 4.3.2 5通道多离子选择性微电极阵列(M-ISMEA)及8通道K~+,Na~+,Ca~(2+),pH-ISMEA电化学传感阵列的构建 |
| 4.3.3 ISME电极的表征 |
| 4.3.4 ISMEA电极的电化学性能测试 |
| 4.3.5 M-ISMEA电极的选择性 |
| 4.3.6 M-ISMEA电极抗蛋白吸附测试 |
| 4.3.7 M-ISMEA电极稳定性测试 |
| 4.3.8 M-ISMEA电极重现性测试 |
| 4.3.9 8通道K-ISMEA、Ca-ISMEA、Na-ISMEA及 H-ISMEA电化学成像 |
| 4.3.10 鼠脑缺血过程中K~+、Na~+、Ca~(2+)、pH在体电化学分析及电化学成像 |
| 4.3.11 自由移动大鼠癫痫过程中K~+、Na~+、Ca~(2+)、pH在体电化学分析及电化学成像 |
| 4.3.12 不同方法治疗癫痫过程中K~+、Na~+、Ca~(2+)、pH离子变化研究 |
| 4.4 本章结论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在读期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇改善氧化应激介导的糖尿病动物心房重构（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、糖尿病模型的建立、实验设计和可行性分析 |
| 1.1 对象和方法?????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.1.1 实验动物及分组????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.1.2 实验仪器及试剂????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.1.3 建模方法??????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.1.4 血流动力学检查????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.1.5 统计学处理???????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.2 结果??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.2.1 三组家兔基础指标?????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.2.2 三组大鼠基础指标?????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.3 讨论??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.3.1 四氧嘧啶诱导的1型糖尿病模型的可行性分析???????????????????? |
| 1.3.2 链脲佐菌素诱导的2型糖尿病模型的可行性分析????????????????? |
| 1.4 小结??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 二、别嘌呤醇对糖尿病动物心房重构的影响????????????????????????????????????? |
| 2.1 对象和方法????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.1 实验仪器???????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.2 实验试剂???????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.3 心脏超声检查?????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.4 电生理检查????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.5 病理学实验????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.6 统计学处理????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.2 结果???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.2.1 心脏超声检查????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.2.2 电生理研究????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.2.3 病理学实验 |
| 2.3 讨论?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.3.1 糖尿病与心血管疾病的关系 |
| 2.3.2 糖尿病诱导的心房结构重构参与房颤的发生 |
| 2.3.3 糖尿病诱导的心房电重构参与房颤的发生 |
| 2.3.4 糖尿病诱导的心房自主神经重构参与房颤的发生 |
| 2.4 小结 |
| 三、糖尿病介导的心房重构的分子机制及别嘌呤醇的干预作用?????????? |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 心房组织留取 |
| 3.1.4 血液生化检查 |
| 3.1.5 Western blotting |
| 3.1.6 统计学处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 血液生化学检查 |
| 3.2.2 Western blot 实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 糖尿病导致房颤的病理生理机制 |
| 3.3.2 核转录因子 NF-κB 与心房重构的关系 |
| 3.3.3 MAPK 信号通路与心房结构重构的关系 |
| 3.4 小结 |
| 四、钙信号通路异常介导的糖尿病心房重构及别嘌呤醇的干预作用 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验设备 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 膜片钳实验 |
| 4.1.5 共聚焦显微镜测定细胞内钙波 |
| 4.1.6 Western blotting 检测钙通道相关蛋白表达 |
| 4.1.7 Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction(PCR)实验 |
| 4.1.8 免疫组化 |
| 4.1.9 统计学处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 膜片钳实验 |
| 4.2.2 共聚焦显微镜测定细胞内钙波 |
| 4.2.3 Western blotting 测定钙通道相关蛋白表达 |
| 4.2.4 PCR 实验 |
| 4.2.5 免疫组化 |
| 4.3.讨论 |
| 4.3.1 兴奋-收缩偶联的生理过程及结构基础 |
| 4.3.2 细胞内钙稳态失衡导致房颤发生的机制 |
| 4.3.3 Ca MKII 在心血管系统中的分布及作用 |
| 4.3.4 Ca MKII过度激活参与房颤的发生过程 |
| 4.4 小结 |
| 五、氧化应激介导的线粒体代谢相关蛋白表达异常 及别嘌呤醇的干预作用 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 实验仪器 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 Western blotting 检测线粒体代谢相关蛋白 |
| 5.1.4 统计学处理 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 六、血管紧张素 II 介导的氧化应激对 HL-1 细胞 钙信号通路的影响及别嘌呤醇的干预作用 |
| 6.1 对象和方法 |
| 6.1.1 实验仪器 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 溶液配制 |
| 6.1.4 HL-1 细胞培养 |
| 6.1.5 HL-1 细胞实验分组 |
| 6.1.6 酶标仪测定细胞 ROS 水平 |
| 6.1.7 Western blot 检测蛋白表达 |
| 6.1.8 统计学处理 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 酶标仪测定 HL-1 细胞内 ROS 生成 |
| 6.2.2 Western blotting |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 氧化应激与心血管疾病的关系 |
| 6.3.2 血管紧张素 II 通过增加氧化应激水平引起细胞损伤 |
| 6.3.3 Ca MKII激活可通过引起多种离子通道活化异常导致房颤发生 |
| 6.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 氧化应激及其介导的钙信号通路异常与心房颤动的关系及 黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇的干预作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）大豆苷元对大鼠心室肌细胞离子通道的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药品和试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 药品和试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 乳鼠心肌细胞的分离 |
| 2.2 MTT法对心肌细胞活力的测定 |
| 2.3 心肌细胞的分离 |
| 2.4 刺激方案设置 |
| 2.4.1 I_(Na)刺激方案 |
| 2.4.2 I_(to)刺激方案 |
| 2.4.3 I_(Ca-L)刺激方案 |
| 2.5 细胞电生理记录 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 DD对乳鼠心室肌细胞活性的影响 |
| 3.2 急性分离大鼠心肌细胞形态学观察 |
| 3.3 DD对大鼠心室肌细胞钠通道的影响 |
| 3.3.1 DD对心室肌细胞I_(Na)的影响 |
| 3.3.2 DD对I_(Na)电流-电压(Ⅰ-Ⅴ)关系的影响 |
| 3.3.3 DD对I_(Na)激活动力学和失活动力学的影响 |
| 3.3.4 DD对I_(Na)失活后恢复动力学的影响 |
| 3.4 DD对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾通道的影响 |
| 3.4.1 DD对心室肌细胞I_(to)的影响 |
| 3.4.2 DD对I_(to)电流-电压(Ⅰ-Ⅴ)关系的影响 |
| 3.4.3 DD对I_(to)激活动力学和失活动力学的影响 |
| 3.4.4 DD对I_(to)失活后恢复动力学的影响 |
| 3.5 DD对大鼠心室肌细胞L型钙通道的影响 |
| 3.5.1 心室肌细胞I_(Ca-L)的确定 |
| 3.5.2 DD对心室肌细胞I_(Ca-L)的影响 |
| 3.5.3 DD对I_(Ca-L)电流-电压(Ⅰ-Ⅴ)关系的影响 |
| 3.5.4 DD对I_(Ca-L)稳态激活动力学和失活动力学的影响 |
| 3.5.5 DD对I_(Ca-L)失活后恢复动力学的影响 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
四、神经细胞Na~+/Ca~(2+)交换体电生理特性及慢性大鼠脑缺血下Na~+/Ca~(2+)交换体表达的改变（论文参考文献）
- [1]H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用[D]. 陈野. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]电生理及钙离子荧光成像检测MsrB1敲除对小鼠中枢神经系统的影响及机制研究[D]. 师腾瑞. 深圳大学, 2020(11)
- [3]氟暴露下小鼠脑海马钙稳态变化分子机制的研究[D]. 邵丹丹. 浙江师范大学, 2020(01)
- [4]系统生物学视角下苦碟子治疗缺血性脑卒中的效应机制研究[D]. 刘碧原. 北京中医药大学, 2020(04)
- [5]Gal-3在大鼠急性脊髓损伤炎症反应中的作用及调控机制研究[D]. 任周梁. 新疆医科大学, 2019(07)
- [6]从“肾脑相关”论衰老学习记忆功能减退的脑功能失衡机制[D]. 韩诚. 山东中医药大学, 2019(05)
- [7]离子通道ASIC1a的膜表面标记与可视化研究[D]. 宋兴磊. 上海交通大学, 2019(01)
- [8]脑氧化应激下的活体电化学分析[D]. 赵凡. 华东师范大学, 2019(09)
- [9]黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇改善氧化应激介导的糖尿病动物心房重构[D]. 杨亚娟. 天津医科大学, 2019
- [10]大豆苷元对大鼠心室肌细胞离子通道的影响[D]. 匡怡. 扬州大学, 2019(02)