一、枯草芽孢杆菌整合载体研究进展（论文文献综述）
林平[1]（2021）在《枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶及酶电极的制备》文中提出葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase,GOD）是一种需氧脱氢酶,具有高效专一的生物特性,能够催化葡萄糖和氧反应,与电极结合可用于制备生物酶电极。以葡萄糖氧化酶电极为代表的酶电极在食品工业、生物医学、环境监测等方面有着广泛的应用前景,一直是生物传感器领域研究的热点。目前,葡萄糖氧化酶电极的制备往往需要采用纯化后的GOD,而酶的分离提纯过程进一步增加了电极的成本。此外,固定GOD的过程中会造成酶活损失,影响电极的稳定性。因此,本文将GOD与芽孢衣壳蛋白融合表达,使GOD展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面,从而避免了GOD的分离提纯,可降低葡萄糖氧化酶电极的制备成本。另外,优异的芽孢抗逆性,进而提高酶电极的稳定性。主要研究内容如下:（1）首先选取了芽孢衣壳蛋白Cot C、Cot X和Cot Y用作Bacillus subtilis WB800n芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的锚定蛋白,通过对芽孢表面展示的葡萄糖氧化酶进行Western Blot、免疫荧光以及酶活分析,证明葡萄糖氧化酶可以在芽孢表面展示,并且具有酶活性,重组菌B.subtilis WB800n-Cot C/X/Y-GOD单位菌体干重的比酶活分别为20.33 U/g、23.28 U/g和21.78 U/g,其中,以Cot X为锚定蛋白所展示的GOD酶活最高。（2）为提高芽孢表面展示的葡萄糖氧化酶的展示量,在不影响枯草芽孢杆菌正常生长的情况下,选取了amy E、lac A和pyr D基因为插入位点,通过构建带有插入位点的上下游同源臂的载体,将外源基因和锚定蛋白通过同源臂双交换的方式整合入B.subtilis WB800n的不同插入位点。Western Blot分析结果证明葡萄糖氧化酶成功在枯草芽孢杆菌芽孢表面表达,其表达量随着整合位点个数的增加而增加,并且外源基因同时插入三个不同位点时,所得到的重组菌芽孢表面的葡萄糖氧化酶酶活最高,为50.09 U/g。（3）采用饥饿发酵法生产表面展示葡萄糖氧化酶的重组芽孢,将其与氧化石墨烯材料和普鲁士蓝电子媒介体制备酶电极。该酶电极在葡萄糖浓度范围为0.1-9.0 mmol/L时,循环伏安曲线与葡萄糖浓度呈线性关系。校准曲线方程式为I=1.2846 Cglucose+5.7907（R2=0.9971）,检出限为4.2μmol/L（S/N=3）,灵敏度为41.94μA·m M-1·cm-2。该修饰电极可用于葡萄糖的分析和测定。
陈秋铭[2]（2019）在《纤维二糖差向异构酶的分子改造、定向挖掘与食品级表达》文中进行了进一步梳理食品用酶本质是一种蛋白质,它的结构十分精巧且复杂。目前针对食品工业酶的研究大多处在应用层面,而理论层面的研究基础还相对薄弱,尤其对食品酶分子层面的研究还在起步阶段。针对这一问题,本课题从理论角度出发,对纤维二糖差向异构酶的结构与功能展开了研究。同时着眼于该酶在乳制品工业中的应用,利用分子生物学与基因工程技术对纤维二糖差向异构酶进行新酶挖掘、分子改造与食品级安全工程菌株构建。纤维二糖差向异构酶是一种新兴的乳制品工业用酶,该酶不需要辅酶与共底物的加入,可独立催化低价值的乳糖进行两种生物转化反应,用于乳果糖和依匹乳糖的生产。乳果糖和依匹乳糖是两种功能性甜味剂,具有多种有益健康的生物活性。但目前所知的纤维二糖差向异构酶还存在酶活较低、温度稳定性不足等问题,难以满足不同工作环境下的高效工业化生产的需求。计算机技术和计算资源的高速发展为酶的理论研究提供了新的思路,人们在计算机辅助下可对酶分子的结构稳定性和催化机理进行分子层面的理论研究。本课题通过计算机辅助手段,对已知的纤维二糖差向异构酶进行了分子改造。半理性设计了稳定性提高的突变体库。通过对突变体库进行酶活检测,找到了一株温度稳定性和异构化酶活均提高了的纤维二糖差向异构酶突变体CsCE-M5/E327D。相同反应体系下,该酶突变体1 h所产乳果糖量高于野生型4 h所产乳果糖量。本课题使用分子动力学模拟手段对纤维二糖差向异构酶的结构灵活性进行了分析。结果表明计算机模拟得到的计算数据（结构均方根偏差、氢键数量）与酶分子的热稳定性实验数据有一定的相关性,相比于静态分析能够更准确的预测蛋白质结构的稳定性与灵活性。通过对有底物的纤维二糖差向异构酶进行分子动力学模拟,对该酶的催化机理进行了探讨。推测了该酶底物的开环过程中新的关键残基,并通过突变实验进行了验证。还确定了纤维二糖差向异构酶催化异构化过程的限速步骤,为该酶未来的理性设计打下了基础。通过分子动力学模拟在数据库中定向搜索到了在低温环境下仍然具有一定灵活性的野生型酶基因。将来源于Roseburia intestinalis的纤维二糖差向异构酶基因在大肠杆菌表达系统中进行异源表达,并通过镍亲和层析法进行分离纯化,随后对纯酶进行了酶学性质鉴定。纯酶的相对分子质量约为43.5 kDa,最适pH为7.0,最适温度为45°C;该酶对乳糖的差向异构化Km值为429.9±57.3 mM,kcat值为117.0±7.7 s-1,kcat/Km值为0.27 mM-1 s-1,以纤维二糖为底物时差向异构化反应的动力学参数值分别为131.0±11.6mM、98.5±2.9 s-1和0.75 mM-1 s-1。在8°C低温条件下,该酶的差向异构化酶活是目前所报道活性最高的野生型纤维二糖差向异构酶的18.5倍。十分适合工业低温条件下对乳糖的转化。结果表明分子动力学模拟方法可以使野生酶的挖掘过程更高效、合理。本课题构建了整合型质粒将纤维二糖差向异构酶基因与抗生素抗性基因一同插入到枯草芽孢杆菌染色体上,筛选到整合工程菌后再通过Cre/lox特异性重组系统敲除抗性基因,得到整合型安全表达的工程菌,该整合型重组菌的最高发酵酶活为0.325 U/mL;又构建了含有D-丙氨酸消旋酶基因但不含抗生素抗性的双启动子可复制质粒,转化到D-丙氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌宿主中,得到了质粒型安全表达工程菌,该工程菌的最高发酵酶活大于7 U/mL;使用乙醇处理的方法将枯草芽孢杆菌菌体的产依匹乳糖能力提高了3.67倍,通过将产物中乳糖降解、酵母发酵、离子交换层析的方式构建了一条不含致病菌和抗生素的产依匹乳糖食品安全级生产流程。将依匹乳糖的纯度提高到98%以上,产率为24%。
王越[3]（2019）在《长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达》文中研究说明长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）来源的普鲁兰酶（GenBankNo.JN872757.1）在高温、酸性环境条件下有较好的耐受性,满足淀粉工业中糖化过程的要求,可以提高淀粉质原料的利用率,提高工业生产的效率。枯草芽孢杆菌是食品级生产菌株,具有完善的蛋白转录翻译和分泌系统。因此,本研究通过同源重组,将长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因整合在枯草芽孢杆菌基因组中进行表达,构建了分别包含组成型启动子PHpaⅡ和诱导型启动子PsacB的枯草芽孢杆菌表达系统,并对酶活较高的重组菌进行了发酵优化,主要内容如下:（1）从以往构建的穿梭质粒pMA0911-PHpaⅡ-pul中获得普鲁兰酶基因表达框PHpⅡ-pul,构建了枯草芽孢杆菌整合载体pDL-PHpaⅡ-pul,并将普鲁兰酶基因分别整合在B.subtilisWB600和B.subtilisWB800的基因组中实现胞外表达,经过72 h发酵,重组菌B.subtilis WB800-PHpaⅡ-pul（以下简称8H）和B.subtilis WB600-PHpa Ⅱ-pul（以下简称6H）的胞外酶活分别为30.32U·mL-1和18.83U·mL-1。对于包含组成型启动子PHpaH的枯草芽孢杆菌表达系统,选择酶活较高的菌株进行发酵条件的优化,8H在最佳发酵条件下即接种量2%（v·v-1）,培养基初始pH7.0,培养温度30℃,摇床转速250r·min-1,酶活最高达到60.85 U·mL-1,约为优化前重组菌8H胞外酶活的2倍;（2）从以往构建的穿梭质粒pMA0911-PsacB-pul中获得普鲁兰酶基因表达框PsacB-pul,并构建了枯草芽孢杆菌整合载体pDL-PsacB-pul,并将普鲁兰酶基因分别整合在B.subtilisWB600和B.subtilis WB800的基因组中实现胞外表达,经过72 h蔗糖诱导,重组菌B.subtilis WB600-PsacB-pul（以下简称6S）和B.subtilis WB800-PsacB-pul（以下简称8S）的胞外普鲁兰酶酶活分别为5.34 U·mL-1和13.19 U·mL-1。对于包含诱导型启动子PsacB的枯草芽孢杆菌表达系统,选择酶活较高的菌株进行蔗糖诱导条件的优化,8S在最佳诱导条件下即蔗糖诱导剂终浓度2%（w·v-1）,初始诱导OD600为0.4,诱导温度20℃,酶活最高达到48.59 U·mL-1,约为优化前重组菌8S胞外酶活的3.7倍。
赵雷真[4]（2019）在《第二代蛋白酶缺陷型枯草杆菌表达宿主的构建与应用》文中进行了进一步梳理枯草杆菌（Bacillus subtilis）因其具有宿主安全性、高效的蛋白分泌能力、简便的遗传操作体系、易于发酵培养等优点,现已被用作重要的重组蛋白表达宿主。然而,在枯草杆菌中进行异源蛋白生产时,也会存在质粒不稳定性、目的产物被宿主分泌的多种蛋白酶降解等问题。对蛋白酶基因进行敲除是解决异源蛋白受损问题的有效方法,现已构建的第一代蛋白酶缺陷型菌株如B.subtilis 1A751,B.subtilis WB600,B.subtilis WB800有较低的胞外蛋白酶活性,常被用作异源蛋白的表达宿主。然而,当异源蛋白在枯草杆菌中分泌表达时,对多种蛋白酶缺陷型宿主的使用仍未有选择标准。同时,不是所有八个胞外蛋白酶对所有重组蛋白都是有害的,某个蛋白酶可能对A蛋白是有利,对B蛋白是不利的,第一代缺陷型宿主不能够满足目的蛋白个性化的需求。此外,有些野生型枯草杆菌具有模式菌株不可比拟的发酵生长能力和蛋白分泌能力,如何开发野生型菌株用作表达宿主仍是一个难题。本论文从模式菌株B.subtilis 168出发,对表达宿主的改造与提高进行了系统的研究,并将其应用于野生型枯草杆菌中,实现了目的蛋白在枯草杆菌中稳定高效的表达,并取得以下研究结果。1.异源蛋白最适蛋白酶缺失菌株的构建枯草杆菌分泌的八种蛋白酶是限制异源蛋白生产的主要因素。同时,也有研究表明有些蛋白酶是有利于目的蛋白分泌的,对蛋白酶进行选择性的失活可以实现异源蛋白产量的最大化。如何区分每种蛋白酶对目的蛋白生产的影响仍是一个难题。本研究在B.subtilis 168中构建了一株失活八个胞外蛋白酶基因（nprE,aprE,epr,bpr,mpr,nprB,vpr,wprA）的枯草杆菌表达宿主PD8,和八株只表达单一蛋白酶的枯草杆菌突变体 PD8CnprE,PD8CaprE,PD8Cepr,PD8Cbpr,PD8Cmpr,PD8CnprB,PD8Cvpr,PD7。这九株菌株组成的评估系统可以鉴定每种蛋白酶对异源蛋白分泌的影响;当异源蛋白在枯草杆菌中进行分泌表达时,突变菌株的蛋白产量高于PD8则相应的蛋白酶视为有利于目的蛋白的分泌,相反的蛋白酶则为不利的,对不利的蛋白酶进行失活,以此来构建最适的蛋白酶缺失宿主用于提高目的蛋白在枯草杆菌中的分泌水平。通过上述的评估系统鉴定到PD8为甲基对硫磷水解酶（MPH）最适的蛋白酶缺陷型表达宿主;PD9（ΔnprE,ΔaprE,ΔnprB,Δvpr,ΔwprA）为百菌清水解脱氯酶（Chd）的最适蛋白酶缺陷型表达宿主,其产量相比于PD8提高了 70%。PD3（△nprE,△aprE,△epr）为α-淀粉酶（AmyM）的最适蛋白酶缺陷型表达宿主,其产量相比于PD8提高了 60%。同时,构建的 pDnprE,pDaprE,pDepr,pDbpr,pDmpr,pDnprB,pDvpr,pDwprA 八种枯草杆菌整合载体,可以便捷实现对枯草杆菌蛋白酶基因的无痕敲除和多拷贝表达宿主的构建。2.野生型枯草杆菌表达宿主的筛选与改造筛选高效蛋白分泌能力的野生型表达宿主可以作为提高异源蛋白生产的有效策略。根据AmyM的抗枯草杆菌蛋白酶的特性,使用AmyM作为报告蛋白,对野生型枯草杆菌菌株可作为表达宿主的潜能进行评估。分离与鉴定到四株（PAA5,M2,Za,24-DA-2）可进行遗传操作的野生型枯草杆菌。菌株PAA5是四株野生菌株中具有最高AmyM生产能力的宿主,并对PAA5进行宿主改造,使得AmyM在蛋白酶缺陷型表达宿主PAA5-03中实现了高效分泌,最高的α-淀粉酶活性为1960 U/mL,是本研究中AmyM最优的生产宿主。3.MPH在枯草杆菌中稳定高效的表达高产AmyM的宿主并不适合MPH的分泌,对PD8菌株进一步的宿主提高,得到DegUH12L,ΔdltABCD菌株,MPH的产量相比于PD8宿主分别提高了 22%和14%,使得在宿主改造方面进一步提高目的蛋白的分泌水平。为了进一步提高MPH的生产,将PNBP3510-mpd表达盒的启动子替换为Pac启动子,成功构建Pac-mpd表达盒。重组菌株在摇瓶培养条件下最高的MPH酶活为380.7U/mL,是本研究中最高的MPH产量。综上所述,本研究首先在模式菌株B.subtilis 168中构建九株枯草杆菌突变体,详细的评估了每种蛋白酶对异源蛋白分泌的影响;对不利于目的蛋白生产的蛋白酶进行失活,通过构建最适蛋白酶缺陷型表达宿主的方式提高异源蛋白在枯草杆菌中的分泌水平。同时,将在模式菌株中的研究应用到野生型枯草杆菌菌株中,对野生菌株进行发掘,开发高产目的蛋白的表达宿主。最后,对PD8进一步的进行宿主提高,通过染色体整合的方式实现了 MPH在枯草杆菌中稳定高效的生产。
卜庆廷[5]（2019）在《基于恰塔努加链霉菌的聚酮类底盘细胞构建与评估》文中研究说明链霉菌是微生物药物主要生产菌,富含各类药物合成元件和合成前体,具备完整的抗性/耐药机制,是药物异源合成的优良底盘;其富含次级代谢基因簇,是天然活性产物的宝库。基于工业菌构建链霉菌底盘细胞,创建人工合成体系,有望创新遗传育种技术,从“一菌一药、产物多组分”变革为“一底盘多药、单一组分”的新模式,服务于新颖天然产物挖掘和微生物药物优质高产,是微生物制药领域的重要创新。恰塔努加链霉菌L10（Streptomyce schattanoogensis L10）是生产纳他霉素（natamycin,PKS）的工业菌（产量高达16g/L）,基因组为9Mb,含32个次级代谢生物合成基因簇,大部分是聚酮类。恰塔努加链霉菌L10中酰基供体丰富,具有高效调控网络,遗传稳定性强、遗传操作简单,有望开发为高效的聚酮类底盘细胞。本课题基于比较基因组学、泛基因组学及功能基因组学技术,建立了系统分析链霉菌基因组中必需基因和冗余基因的方法。通过antiSMASH、IslandViewer4、ISsaga2对L10的基因组进行分析,定位了冗余基因元件如次级代谢生物合成基因簇（BGCs）、基因组岛（GIs）、可移动元件（MGEs）的分布,表明冗余基因元件主要分布在染色体末端（60%的次级代谢基因簇、73.5%的基因组岛、74%的插入序列）;通过全基因组比对和泛基因组分析,将L10基因组明确划分为高度保守的核心基因区（6.0Mb）和两个亚端粒区（左右分别为2.0Mb和1.0Mb）两部分;通过全蛋白质组多重比对分析（OrthoVenn）和KEGG代谢通路分析,表明L10基因组中约有2700个必需基因,绝大部分与细胞基本构架、初级代谢（如糖代谢、TCA循环、氨基酸代谢）、DNA功能（复制、转录、翻译）、细胞分裂等基本生命活动相关,其余的约5500个基因则主要是与次级代谢途径相关基因、致病性相关基因、可移动元件及噬菌体相关基因;综合必需基因、冗余基因的功能及分布,准确界定了两个大片段的冗余基因区域（1.3Mb和0.7Mb）,为理性设计工业链霉菌底盘细胞提供了依据。课题优化了Cre/loxP位点特异性重组系统,用于大规模删减冗余基因区,构建了链霉菌简约基因组。基于链霉菌通用载体pSET152和pKC1139构建了 一系列链霉菌中通用的loxP或loxP突变位点快速整合载体,可广泛应用到其它链霉菌中。鉴于硫链丝菌素诱导型启动子tipAp的本底表达高、硫链丝菌素对大部分链霉菌的毒性,优化了 Cre酶诱导表达质粒pALCre,用己内酰胺诱导型启动子nitAp替换了tipAp构建了 pNitCre,只需用0.1%的ε-己内酰胺便可诱导Cre酶的高效严谨表达,且己内酰胺对绝大部分链霉菌不具有毒性,因此,也可广泛应用到其它链霉菌中。利用上述技术,我们实现了 L10中两个大片段冗余基因区域的高效缺失,构建了两个基因组简化的恰塔努加链霉菌底盘细胞（L320和L321）。同时,完善了基因簇捕获技术,实现了 3个基因簇的直接克隆或组装,推动了链霉菌合成生物学使能技术的发展。同时,本课题对恰塔努加链霉菌底盘细胞L321进行了系统的评估。与L10相比,L321展现出遗传稳定性增强、转化效率提高、次级代谢谱简化、异源蛋白和次级代谢产物表达能力增强、胞内能量（ATP）和还原力（NADPH/NADP+）水平提高等优良性能,且底盘细胞L321菌丝比较分散,不会在发酵过程中形成沉淀,有利于工业化生产。以L321为基础,通过进一步遗传改造,阻断了主要副产物-氧化偶氮霉素的生物合成途径,获得了次级代谢谱更加简化的底盘L325,最终表明L321和L325适合于聚酮类次级代谢产物异源合成,具有潜在的工业应用价值。
王振华,李建臻,潘康成[6]（2018）在《益生芽孢杆菌表达系统的研究进展》文中研究指明益生芽孢杆菌尤其是枯草芽孢杆菌是目前分泌外源蛋白的理想宿主,将益生菌作为表达外源基因的宿主菌,除了必须有适合基因操作的菌株外,还必须建立合适的表达质粒以及解决外源基因表达的相关问题。本文详细阐述了益生芽孢杆菌宿主菌、启动子和信号肽的改造优化及不同类型载体的优缺点,为益生芽孢杆菌表达系统的完善奠定了基础。同时结合本实验室研究提出以芽孢表面展示技术投递抗原,口服后除了保持芽孢杆菌益生菌原有的功能外,还同时发挥疫苗黏膜免疫作用。
王振华,李建臻,潘康成[7]（2018）在《芽孢杆菌的表达系统的研究进展》文中研究说明益生芽孢杆菌尤其是枯草芽孢杆菌是目前分泌外源蛋白的理想宿主,把益生菌作为表达外源基因的宿主菌,除了必须有适合基因操作的菌株外,还必须建立合适的表达质粒以及解决外源基因表达的相关问题。本文详细阐述了益生芽孢杆菌宿主菌、启动子和信号肽的改造优化及不同类型载体的优缺点,为益生芽孢杆菌表达系统的完善奠定了基础。同时结合本实验室研究提出以芽孢表面展示技术投递抗原,口服后除了保持芽孢杆菌益生菌原有的功能外,还同时发挥疫苗粘膜免疫作用。
姬生跃[8]（2019）在《基于南海海洋沉积物宏基因组学的新型抗菌肽挖掘与表达》文中提出抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）是一类具有抗病毒、抗真菌、抗细菌及抑制癌细胞生长等生物学功能的小肽,是一类重要的抗生素潜在替代品,其在生物医药、食品防腐及畜牧业绿色养殖等领域有着广泛应用。本课题以南海海洋沉积物为研究出发材料,构建了宏基因组文库;利用基于抗菌肽功能的筛选方法挖掘了具有产业应用价值的新型抗菌肽;之后应用氨基酸测序技术测析了其一级结构;随后利用基因工程技术和枯草芽孢杆菌表达系统优化出了新型抗菌肽的胞外表达体系。本文的主要结论是:1.应用宏基因组技术从南海海洋沉淀物中提取、纯化并获得了的宏基因组文库DNA。2.在南海海洋沉积物宏基因组文库DNA基础上,构建出了基于枯草芽孢杆菌表达系统的宏基因组文库。3.应用抗菌肽功能平板筛选从南海海洋沉淀物宏基因组文库中筛选出了产生抑菌圈的阳性克隆子,之后应用DNA测序技术获取新抗菌肽的碱基序列。4.对筛选得到抗菌肽进行了温度、酸碱度和酶的耐受性以及抑菌谱、抑菌效价等方面的生物学特性研究,获得了一个特殊生物学特性的抗菌肽,命名为Naseain 9。5.应用自动Edman降解测序技术测定出了 Naseain 9的氨基酸序列为VLTKKKPINTIYCGTVPCQGKKKRMGGLVKK,并应用生物信息学的方法预测了Naseain 9二级结构。6.基于新型抗菌肽Naseain 9结构,结合生物信息学和偏爱密码子方法,优化出适宜于在枯草芽孢杆菌宿主菌中表达的新型抗菌肽DNA序列GTTCTKACAAAAAAAAAACCGATTAATACAATTTATTGCGGCACAG TTCCGTGCCAAGGCAAAAAAAAAAGAATGGGCGGCCTKGTTAAA AAA。7.构建出了基于枯草芽孢杆菌表达系统组件最优组合的新型抗菌肽高效分泌表达体系BNAS,其在摇瓶水平下1 L发酵液上清中最高可获得89 mg的Naseain 9样品。
徐永洞[9]（2018）在《昆虫抗菌肽枯草芽孢杆菌工程菌构建》文中提出抗生素的滥用引发了一系列的环境、健康隐患,尤其是耐药细菌的出现,严重威胁着人类的健康,寻找更为高效的新型抗生素成为迫在眉睫的问题。抗菌肽（Antimicrobial peptide,AMP）由于安全性高、热稳定性好、抗菌谱广、不易产生耐药性且对高等动物细胞无毒害作用等特点吸引了广泛关注。抗菌肽是一类短肽,含有30-60个氨基酸,当前发现的天然抗菌肽超过了2600条,在植物、细菌、昆虫、动物中均有发现。昆虫源抗菌肽是抗菌肽数据库的重要组成部分。从黑水虻幼虫体内分离得到的Defensin-like-peptide 4（DLP4）和从沙蛾（Sand moth fly）体内分离得到的抗菌肽Sand moth fly peptide（SMFP）氨基酸序列相似度达到75%,对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用。天蚕素（Cecropin）是分离得到的第一条抗菌肽,对革兰氏阴性菌、阳性菌均有较强的抑制作用。本试验利用Tris-HCl（pH6.5）、Tris-HCl（pH8.0）、生理盐水和0.1%三氟乙酸（TFA）4种溶液提取黑水虻幼虫抗菌肽,检测粗提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性。结果表明,四种粗提液对二者均有抑制作用,且对大肠杆菌的抑制效果更明显。抗菌肽虽然存在广泛但含量偏低、易被消化系统降解失活、化学合成成本高,难以形成规模化应用。构建基因工程菌株,通过微生物发酵得到抗菌肽是当前可供选择的主要途径;枯草芽孢杆菌作为益生菌,广泛存在于哺乳动物消化系统内,是一种重要的基因工程宿主菌。本试验利用天蚕素CAD融合基因,DLP4、SMF基因序列和实验室筛选保存枯草芽孢杆菌GF101,构建2组共6株枯草芽孢杆菌工程菌株:（1）利用已有质粒PMA5,分别连接3段抗菌肽序列,构建PMA5-AMP游离型重组质粒,转化枯草芽孢杆菌;（2）利用已有质粒PAX01和PMA5,构建PAX01-KANA大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒,分别连接3段抗菌肽序列,构建PAX01-KANA-AMP重组基因,转入枯草芽孢杆菌。试验转化得到6株工程菌株,抑菌圈试验结果表明,6组菌株发酵液对大肠杆菌抑菌效果明显。该试验为枯草芽孢杆菌抗菌肽工程菌株构建提供了可供借鉴的模板,并为抗菌肽规模化应用提供了研究基础。
佟超男[10]（2019）在《乳二糖磷酸化酶的表达与优化》文中指出乳二糖（lacto-N-biose,LNB）是母乳寡糖中的重要组成部分,也是双歧杆菌维持生命活动的重要底物,它在促进婴幼儿肠道中双歧杆菌的定植和增殖中起重要作用。双歧杆菌可以通过乳二糖磷酸化酶（lacto-N-biose phosphorylase,LNBP）来代谢LNB获得生命活性所需要的能量。LNBP（EC2.4.1.211）是一种可逆的磷酸化酶,可以催化LNB和GNB（galacto-N-biose）产生N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）,N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）和β-D-半乳糖-1-磷酸（Gal 1-P）。Wada等证实双歧杆菌中具有编码代谢LNB的基因簇,其中LNB通过特定的ABC型转运蛋白转运至细胞质,它由LNBP最终在糖酵解和氨基糖代谢途径中代谢。从长双歧杆菌JCM 1217（Bifidobacterium longum JCM1217）克隆乳二糖磷酸化酶基因,将该基因与载体pET28a连接构建了重组表达质粒pET28a-LNBP,将pET28a-LNBP转化到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中构建了重组工程菌株E.coli BL21/pET28a-LNBP。另外,该基因与pHT43载体连接构建了重组表达质粒pHT43-LNBP,将pHT43-LNBP转化到枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB800N中,构建了重组工程菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP。在优化这两种表达系统的表达条件的基础上,对比分析了两种表达系统对乳二糖磷酸化酶的表达情况。此外,使用Ni-NTA纯化重组乳二糖磷酸化酶,并进行部分酶学性质分析,实验结果如下:1.重组菌E.coli BL21/pET28a-LNBP表达乳二糖磷酸化酶的最佳初始菌密度为OD600=0.5、IPTG的最终浓度为0.1 mmol/L、诱导表达温度为30℃、诱导表达时间为18h、振荡培养的最佳转速为180 rpm。经以上条件培养重组菌E.coli BL21a/pET28a-LNBP后,获得的LNBP总酶活达353.94U/L,比活力为15.18U/mg。2.重组菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP表达乳二糖磷酸化酶时的最佳初始菌密度OD600=0.5、0.1 mmol/L为IPTG的最终浓度、37℃为最适的诱导表达温度、9h为最适的诱导表达时间、120 rpm为振荡培养的最佳转速。经以上条件培养重组菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP后,获得的LNBP总酶活为778.82U/L,比活力为31.36U/mg。3.用Ni-NTA纯化重组的乳二糖磷酸化酶,用含有200 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白,具有良好的纯化效果。酶学性质分析结果表明,重组乳二糖磷酸化酶的最佳反应温度为20℃,最适pH为7。4.本论文通过对重组菌E.coli BL21/pET28a-LNBP和重组菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP的诱导表达条件的优化,结果显示,枯草芽孢杆菌相对于大肠杆菌显着地提高了重组乳二糖磷酸化酶的比活,为工业化生产乳二糖磷酸化酶提供了技术支持与指导。
二、枯草芽孢杆菌整合载体研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、枯草芽孢杆菌整合载体研究进展（论文提纲范文）
（1）枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶及酶电极的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 葡萄糖氧化酶概述 |
| 1.1.1 葡萄糖氧化酶的特征 |
| 1.1.2 葡萄糖氧化酶反应机理 |
| 1.1.3 葡萄糖氧化酶的性质 |
| 1.1.4 葡萄糖氧化酶的应用 |
| 1.2 枯草芽孢杆菌芽孢表面展示系统 |
| 1.2.1 枯草芽孢杆菌芽孢表面展示系统概述 |
| 1.2.2 B.subtilis芽孢的形成与结构 |
| 1.2.3 芽孢表面展示系统的组成 |
| 1.3 葡萄糖氧化酶电化学生物传感器 |
| 1.3.1 酶电化学生物传感器的原理及组成部分 |
| 1.3.2 电极表面固定酶的方法 |
| 1.4 立题背景和研究内容 |
| 1.4.1 立题背景 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第2章 利用单个Cot蛋白在芽孢表面展示葡萄糖氧化酶 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 实验试剂与培养基 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌体吸光度的测定 |
| 2.3.2 单位菌体干重的测定 |
| 2.3.3 细菌基因组和质粒的获取 |
| 2.3.4 锚定蛋白cot C/X/Y基因和god基因的克隆 |
| 2.3.5 重组质粒p DG1730-cot C/X/Y-god的构建 |
| 2.3.6 pDG1730-cot C/X/Y-god重组质粒的B.subtilis WB800n转化 |
| 2.3.7 重组菌B.subtilis WB800n-Cot C/X/Y-GOD的检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 GOD在芽孢表面展示所需目的基因的克隆和重组质粒的构建 |
| 2.4.2 芽孢表面展示GOD重组菌的构建 |
| 2.4.3 芽孢表面展示GOD的WB分析 |
| 2.4.4 芽孢表面展示GOD的IF分析 |
| 2.4.5 芽孢表面展示GOD的酶活分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 葡萄糖氧化酶基因的B.subtilis WB800n基因组多位点整合 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 B.subtilis WB800n基因组DNA的提取和质粒的提取 |
| 3.3.2 不同位点整合所需基因的克隆 |
| 3.3.3 不同位点整合片段的构建 |
| 3.3.4 重组B.subtilis WB800n的构建 |
| 3.3.5 不同位点整合重组B.subtilis WB800n生长曲线的测定 |
| 3.3.6 重组B.subtilis WB800n的 WB分析 |
| 3.3.7 重组B.subtilis WB800n的酶活分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 不同位点整合所需基因的克隆 |
| 3.4.2 重组B.subtilis WB800n的构建 |
| 3.4.3 重组B.subtilis WB800n生长曲线 |
| 3.4.4 重组B.subtilis WB800n芽孢表面展示GOD的 WB分析 |
| 3.4.5 重组B.subtilis WB800n芽孢表面展示GOD的酶活检测 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的酶电极制备 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要实验试剂 |
| 4.2.2 主要实验仪器 |
| 4.2.3 主要溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组芽孢的制备 |
| 4.3.2 修饰电极的制备 |
| 4.3.3 氧化石墨烯的修饰量和普鲁士蓝电沉积条件优化 |
| 4.3.4 .修饰电极检测方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 氧化石墨烯的添加量和普鲁士蓝电沉积条件的影响 |
| 4.4.2 Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE电极的扫描电镜表征 |
| 4.4.3 Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE电极的电化学表征 |
| 4.4.4 p H和温度对修饰电极的影响 |
| 4.4.5 Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE电极的性能研究 |
| 4.4.6 Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE电极的重现性和稳定性 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要科研成果 |
（2）纤维二糖差向异构酶的分子改造、定向挖掘与食品级表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号与缩率语说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳糖与乳糖衍生物 |
| 1.1.1 乳糖的理化性质 |
| 1.1.2 乳糖的衍生物 |
| 1.1.3 乳糖产业面临的问题 |
| 1.2 纤维二糖差向异构酶简介 |
| 1.2.1 纤维二糖差向异构酶的研究历史概述 |
| 1.2.2 纤维二糖差向异构酶的酶学性质 |
| 1.2.3 纤维二糖差向异构酶制备乳果糖和依匹乳糖的优势 |
| 1.2.4 纤维二糖差向异构酶的氨基酸序列及蛋白结构分析 |
| 1.2.5 纤维二糖差向异构酶的催化机理 |
| 1.3 计算机技术在食品酶分子改造中的应用 |
| 1.3.1 生物信息学策略 |
| 1.3.2 蛋白质静态信息的计算 |
| 1.3.3 基于动力学模拟的计算 |
| 1.4 工程酶在枯草芽孢杆菌中的食品级表达 |
| 1.4.1 枯草芽孢杆菌 |
| 1.4.2 枯草芽孢杆菌的宿主与质粒 |
| 1.4.3 不含抗生素抗性的基因工程菌技术 |
| 1.5 课题立题依据与研究意义 |
| 1.6 课题主要内容 |
| 第二章 纤维二糖差向异构酶的分子改造 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 菌株、质粒及引物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 试剂配方 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 感受态细胞制备 |
| 2.3.2 两步法定点突变 |
| 2.3.3 突变体质粒转化 |
| 2.3.4 突变体重组菌的DNA验证 |
| 2.3.5 CsCE-M5 突变体酶表达 |
| 2.3.6 CsCE-M5 突变体酶纯化 |
| 2.3.7 纯化后的突变体酶SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.3.8 突变体酶活力测定 |
| 2.3.9 产物检测方法 |
| 2.3.10 温度与p H对突变体酶活的影响 |
| 2.3.11 圆二色谱分析 |
| 2.3.12 突变体酶结构获取 |
| 2.3.13 突变体酶稳定性静态预测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 半理性设计突变位点 |
| 2.4.2 突变体的验证 |
| 2.4.3 稳定突变体酶的筛选 |
| 2.4.4 突变体比酶活测定 |
| 2.4.5 突变体最适反应温度测定 |
| 2.4.6 突变体功能稳定性测定 |
| 2.4.7 突变体动力学参数测定 |
| 2.4.8 突变体产乳果糖反应进程研究 |
| 2.4.9 突变体结构分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 纤维二糖差向异构酶的分子模拟与催化机理研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 酶与底物分子对接 |
| 3.3.2 模拟体系的构建 |
| 3.3.3 无底物酶分子动力学模拟 |
| 3.3.4 与底物结合酶分子动力学模拟 |
| 3.3.5 分子动力学模拟分析 |
| 3.3.6 不同酶浓度差向异构化与异构化活力检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 纤维二糖差向异构酶的分子动力学模拟 |
| 3.4.2 野生型纤维二糖差向异构酶的温度稳定性预测 |
| 3.4.3 突变体纤维二糖差向异构酶稳定性预测 |
| 3.4.4 分子动力学模拟预测稳定性的影响因素 |
| 3.4.5 纤维二糖差向异构酶催化机理初步分析 |
| 3.4.6 纤维二糖差向异构酶结合自由能研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 低温高效纤维二糖差向异构酶的挖掘与表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 菌株及载体 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.2.5 试剂配方 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 目的基因序列的筛选 |
| 4.3.2 重组质粒构建 |
| 4.3.3 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制备 |
| 4.3.4 构建重组工程菌 |
| 4.3.5 重组菌的DNA验证 |
| 4.3.6 重组工程菌的培养及诱导表达 |
| 4.3.7 目的蛋白的纯化 |
| 4.3.8 蛋白相对分子质量的确定 |
| 4.3.9 测定重组纤维二糖差向异构酶酶活 |
| 4.3.10 温度与p H对酶活的影响 |
| 4.3.11 低温条件下反应进程的测定 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 蛋白的筛选 |
| 4.4.2 重组酶的纯化 |
| 4.4.3 Roin-CE酶活的测定 |
| 4.4.4 温度对Roin-CE酶活的影响 |
| 4.4.5 pH对 Roin-CE酶活的影响 |
| 4.4.6 Roin-CE低温生产依匹乳糖 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 纤维二糖差向异构酶的食品级表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.2.4 培养基 |
| 5.2.5 试剂配方 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 引物设计 |
| 5.3.2 P43 启动子、Thsa-CE基因、Caob-CE基因、整合载体p DG1730H的扩增 |
| 5.3.3 P43-Thsa-CE、P43-Caob-CE表达片段的构建 |
| 5.3.4 整合质粒pDG1730H-P43-ThsaCE和 p DG1730H-P43-CaobCE的构建 |
| 5.3.5 大肠杆菌DH5α感受态制备及转化 |
| 5.3.6 整合质粒pDG1730H-P43-ThsaCE和 p DG1730H-P43-CaobCE的单酶切 |
| 5.3.7 整合型重组枯草芽孢杆菌感受态的制备及转化 |
| 5.3.8 淀粉酶活性检测 |
| 5.3.9 整合型重组菌株抗生素抗性基因的敲除 |
| 5.3.10 无抗可复制重组质粒的构建 |
| 5.3.11 质粒型重组枯草芽孢杆菌表达系统构建 |
| 5.3.12 发酵液的SDS-PAGE分析 |
| 5.3.13 发酵浓度及酶活测定 |
| 5.3.14 质粒型重组枯草芽孢杆菌生产依匹乳糖 |
| 5.3.15 依匹乳糖的纯化 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 重组整合质粒p DG1730H-P43-ThsaCE和 p DG1730H-P43-CaobCE的构建 |
| 5.4.2 整合型重组枯草芽孢杆菌的构建 |
| 5.4.3 整合型重组枯草芽孢杆菌的酶活检测 |
| 5.4.4 含丙氨酸消旋酶基因质粒构建 |
| 5.4.5 质粒型重组枯草芽孢杆菌的纯化 |
| 5.4.6 质粒型重组枯草芽孢杆菌的发酵 |
| 5.4.7 乙醇处理质粒型重组枯草芽孢杆菌全细胞 |
| 5.4.8 重组菌全细胞反应生产依匹乳糖 |
| 5.4.9 依匹乳糖的纯化 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录二 |
（3）长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 普鲁兰酶概述 |
| 1.2 普鲁兰酶的研究进展 |
| 1.2.1 普鲁兰酶的产酶微生物及其酶学性质 |
| 1.2.2 普鲁兰酶异源表达的研究进展 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌表达系统 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌宿主菌株 |
| 1.3.3 枯草芽孢杆菌的启动子 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌整合载体 |
| 1.4.1 枯草芽孢杆菌整合载体的整合机理 |
| 1.4.2 枯草芽孢杆菌整合载体的整合方式 |
| 1.5 本课题的立题意义与研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株,质粒与引物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基与溶液 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 枯草芽孢杆菌整合质粒的构建 |
| 2.2.2 枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化 |
| 2.2.3 重组菌株的筛选与鉴定 |
| 2.2.4 重组菌株生长曲线和发酵曲线的测定 |
| 2.2.5 诱导型重组菌株的表达与诱导条件的优化 |
| 2.2.6 普鲁兰酶表达的SDS-PAGE分析 |
| 2.2.7 普鲁兰酶酶活的测定 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 整合质粒pDL-P_(HpaⅡ-pul)和pDL-P_(sacB-pul)的构建 |
| 3.1.1 普鲁兰酶基因表达框的扩增 |
| 3.1.2 整合质粒pDL-P_(HpaⅡ-pul)的构建 |
| 3.1.3 整合质粒pDL-P_(sacB-pul)的构建 |
| 3.2 枯草芽孢杆菌整合菌株的筛选与鉴定 |
| 3.2.1 氯霉素筛选枯草芽孢杆菌转化菌株浓度的确定 |
| 3.2.2 枯草芽孢杆菌整合菌株基因组的鉴定 |
| 3.3 组成型重组菌株的表达与发酵优化 |
| 3.3.1 重组菌普鲁兰酶的表达分析 |
| 3.3.2 重组菌8H发酵条件的优化 |
| 3.3.3 最佳发酵条件下的发酵过程曲线 |
| 3.4 诱导型重组菌株的表达与诱导条件的优化 |
| 3.4.1 蔗糖诱导型重组菌株的表达 |
| 3.4.2 蔗糖诱导表达条件的优化 |
| 3.4.3 最佳诱导条件下的发酵过程曲线 |
| 主要结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）第二代蛋白酶缺陷型枯草杆菌表达宿主的构建与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语说明 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 芽孢杆菌简介 |
| 2 枯草杆菌表达系统特点 |
| 3 枯草杆菌表达系统宿主菌株的改造与开发 |
| 3.1 枯草杆菌蛋白酶缺失宿主的研究 |
| 3.2 野生型枯草杆菌表达宿主的发掘 |
| 3.3 转录调节因子的研究 |
| 3.4 分泌途径的研究 |
| 3.5 改善细胞生长和自溶 |
| 3.6 基因组精简工程 |
| 4 枯草杆菌表达系统的载体研究 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 6 本研究技术路线 |
| 第二章 异源蛋白最适蛋白酶缺失菌株的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与培养基 |
| 1.2 供试菌株与引物 |
| 1.3 菌株B.subtilis 168总DNA的提取 |
| 1.4 枯草杆菌感受态的制备与转化 |
| 1.5 枯草杆菌中八个胞外蛋白酶基因的无痕敲除 |
| 1.6 构建表达单一蛋白酶的枯草杆菌突变体 |
| 1.7 外源蛋白在枯草杆菌突变体中的分泌表达 |
| 1.8 枯草杆菌八个蛋白酶位置整合载体的构建 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 枯草杆菌蛋白酶缺失菌株的构建 |
| 2.2 八株表达单一蛋白酶的枯草杆菌突变体的构建 |
| 2.3 B.subtilis PD8与WB800在异源蛋白生产方面的比较 |
| 2.4 甲基对硫磷水解酶(MPH)最适蛋白酶缺失宿主的构建 |
| 2.5 百菌清水解脱氯酶(Chd)最适蛋白酶缺失宿主的构建 |
| 2.6 α-淀粉酶(AmyM)最适蛋白酶缺失宿主的构建 |
| 2.7 枯草杆菌整合载体的构建 |
| 3 本章讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 野生型枯草杆菌表达宿主的筛选与改造 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 培养基与试剂 |
| 1.2 供试菌株与引物 |
| 1.3 可自发形成感受态的枯草杆菌菌株的筛选 |
| 1.4 AmyM作为筛选优良表达宿主依据 |
| 1.5 野生型枯草杆菌宿主改造 |
| 1.6 异源蛋白在枯草杆菌中分泌表达 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 AmyM作为报告蛋白进行野生菌株性能评估 |
| 2.2 野生型枯草杆菌菌株的筛选与鉴定 |
| 2.3 优良表达宿主的鉴定 |
| 2.4 野生菌株的宿主改造 |
| 2.5 MPH在PAA5菌株中的异源表达 |
| 3 本章讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 MPH在枯草杆菌中稳定高效的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 培养基与试剂 |
| 1.2 供试菌株与引物 |
| 1.3 DegU~(H12L)点突变表达宿主的构建 |
| 1.4 CcpA~(T19S)CodY~(R214C)双突变表达宿主的构建 |
| 1.5 ΔdltABCD表达宿主的构建 |
| 1.6 表达宿主MPH产量的测定 |
| 1.7 更换P_(ac)启动子控制MPH的生产 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 枯草杆菌突变体的构建 |
| 2.2 枯草杆菌突变体整合MPH表达盒 |
| 2.3 枯草杆菌突变体MPH酶活测定 |
| 2.4 P_(ac)启动子控制MPH的生产 |
| 3 本章讨论 |
| 4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）基于恰塔努加链霉菌的聚酮类底盘细胞构建与评估（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词和术语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 底盘细胞研究现状 |
| 1.2.1 底盘细胞的概念 |
| 1.2.2 核心基因组 |
| 1.2.3 构建较小基因组的策略 |
| 1.2.4 较小基因组菌株的应用 |
| 1.3 基因组编辑技术研究进展 |
| 1.3.1 同源重组技术 |
| 1.3.2 双链断裂修复重组技术 |
| 1.3.3 位点特异性重组技术 |
| 1.3.4 转座重组技术 |
| 1.4 基因簇克隆技术研究进展 |
| 1.4.1 基因组大片段的直接克隆 |
| 1.4.2 TAR克隆 |
| 1.4.3 Rec介导的克隆 |
| 1.4.4 Cas9介导的大片段克隆 |
| 1.4.5 TAR-CRISPR |
| 1.5 基因组分析技术研究进展 |
| 1.5.1 基因组注释及可视化技术 |
| 1.5.2 全基因组比对技术 |
| 1.5.3 生物合成基因簇(BGCs)分析技术 |
| 1.5.4 基因组岛(GIs)分析技术 |
| 1.5.5 可移动元件(MEs)分析技术 |
| 1.5.6 内源CRISPR/Cas分析技术 |
| 1.5.7 直系同源基因(COGs)分析技术 |
| 1.5.8 泛基因组(Pan-genome)分析技术 |
| 1.6 开发工业链霉菌底盘的必要性 |
| 1.7 本文的研究内容及意义 |
| 1.7.1 本文的研究内容 |
| 1.7.2 本文的研究意义 |
| 1.7.3 研究路线 |
| 1.7.4 本论文创新之处 |
| 第二章 L10基因组生物信息分析与冗余基因区定位 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 软件/数据库 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 基因组测序与注释 |
| 2.3.2 复制起始位点(oriC)分析 |
| 2.3.3 全基因组比对分析 |
| 2.3.4 生物合成基因簇(BGCs)分析 |
| 2.3.5 基因组岛(GIs)分析 |
| 2.3.6 可移动元件(MEs)分析 |
| 2.3.7 直系同源基因(COGs)分析 |
| 2.3.8 内源CRISPR/Cas分析 |
| 2.3.9 泛基因组(Pan-genome)分析 |
| 2.3.10 大片段冗余基因区的界定 |
| 2.4 总结与讨论 |
| 第三章 基因组大片段编辑技术的优化及应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 质粒 |
| 3.2.3 引物 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.2.5 仪器设备 |
| 3.2.6 常用试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 大肠杆菌质粒抽提(庄盟质粒抽提试剂盒) |
| 3.3.2 DNA片段PCR扩增 |
| 3.3.3 高质量链霉菌基因组DNA的抽提 |
| 3.3.4 质粒DNA限制性酶切和连接 |
| 3.3.5 DNA片段凝胶回收(Magen胶回收试剂盒) |
| 3.3.6 大肠杆菌超级感受态的制备与转化 |
| 3.3.7 大肠杆菌菌落PCR技术 |
| 3.3.8 大肠杆菌-链霉菌属间双亲本接合转导 |
| 3.3.9 恰塔努加链霉菌孢子的收集与保存 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 通用型含有loxP或突变体lox位点的穿梭载体的构建 |
| 3.4.2 Cre酶诱导型表达载体的优化改造及其适配性研究 |
| 3.4.3 Cre/loxP系统介导的恰塔努加链霉菌单基因簇敲除 |
| 3.4.4 Cre/loxP系统介导的恰塔努加链霉菌大片段敲除 |
| 3.5 总结与讨论 |
| 第四章 构建的聚酮底盘细胞的系统评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 质粒 |
| 4.2.3 引物 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.2.5 仪器设备 |
| 4.2.6 常用试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 本章所用分子生物学遗传操作方法同3.3 |
| 4.3.2 质粒的构建 |
| 4.3.3 大肠杆菌大型质粒的抽提 |
| 4.3.4 大肠杆菌-链霉菌属间三亲本接合转导 |
| 4.3.5 链霉菌重组蛋白的表达 |
| 4.3.6 链霉菌总蛋白的提取 |
| 4.3.7 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 4.3.8 Western Blot检测蛋白表达 |
| 4.3.9 链霉菌发酵液HPLC检测 |
| 4.3.10 链霉菌生长曲线测定 |
| 4.3.11 紫外分光光度法测定放线紫红素产量 |
| 4.3.12 紫外分光光度法测定indigoidine产量 |
| 4.3.13 酵母TAR克隆星形孢菌素基因簇 |
| 4.3.14 Red/ET技术直接克隆基因簇 |
| 4.3.15 大肠杆菌Re/ET技术改造载体骨架或基因簇 |
| 4.3.16 恰塔努加链霉菌发酵 |
| 4.3.17 RNA提取及基因组DNA的消解 |
| 4.3.18 反转录与qRT-PCR技术 |
| 4.3.19 胞内ATP和NADPH/NADP~+测定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 生长曲线测定 |
| 4.4.2 次级代谢谱分析 |
| 4.4.3 外源蛋白表达能力分析 |
| 4.4.4 胞内能量(ATP)与还原力(NADPH/NADP~+)分析 |
| 4.4.5 外源基因簇表达能力及遗传稳定性分析 |
| 4.4.6 链霉菌形态相关表型分析 |
| 4.4.7 转化效率分析 |
| 4.4.8 底盘细胞L321的优化 |
| 4.4.9 生物合成基因簇的克隆/组装技术 |
| 4.5 总结与讨论 |
| 第五章 研究成果及展望 |
| 5.1 创新点 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 微生物底盘细胞研究进展及展望(文献综述) |
| 文献综述相关参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（6）益生芽孢杆菌表达系统的研究进展（论文提纲范文）
| 1 芽孢杆菌表达系统 |
| 1.1 宿主菌株 |
| 1.2 载体系统 |
| 1.3 启动子 |
| 1.4 信号肽 |
| 2 芽孢杆菌表达系统的应用-抗原及佐剂递呈系统 |
| 3 展望 |
（8）基于南海海洋沉积物宏基因组学的新型抗菌肽挖掘与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 抗菌肽的研究现状与进展 |
| 1.1 抗菌肽的发现 |
| 1.2 抗菌肽的来源及种类 |
| 1.2.1 具有螺旋结构的线性抗菌肽 |
| 1.2.2 富含特定氨基酸的线性抗菌肽 |
| 1.2.3 具有一个二硫键的抗菌肽 |
| 1.2.4 具有两个或多个二硫键的抗菌肽 |
| 1.2.5 含羊毛硫及其它结构的抗菌肽 |
| 1.3 抗菌肽的作用特点 |
| 1.4 抗菌肽的作用机制 |
| 1.5 抗菌肽在不同领域的应用前景及其存在的问题 |
| 1.5.1 抗菌肽在生物医药领域的应用 |
| 1.5.2 抗菌肽在食品防腐领域的应用 |
| 1.5.3 抗菌肽在农业病害防控领域的应用 |
| 1.5.4 抗菌肽在应用中所存在的问题 |
| 1.6 海洋抗菌肽资源的优势 |
| 1.7 海洋抗菌物质资源挖掘的研究进展 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌表达系统 |
| 2.1 枯草芽孢杆菌表达系统的特点及研究进展 |
| 2.2 基因在枯草芽孢杆菌中表达所需的组件 |
| 2.2.1 多δ因子 |
| 2.2.2 启动子 |
| 2.2.3 终止子 |
| 2.3 蛋白质在枯草芽孢杆菌中的分泌 |
| 2.4 枯草芽孢杆菌提高基因表达量的影响因素 |
| 2.4.1 密码子的选取 |
| 2.4.2 目的基因的拷贝数 |
| 2.4.3 载体的选用 |
| 2.4.4 枯草芽孢杆菌的培养条件 |
| 2.4.5 启动子的强弱 |
| 2.4.6 翻译起始的效率 |
| 2.5 枯草芽孢杆菌表达体系中所存在的问题及发展方向 |
| 2.6 枯草芽孢杆菌表达系统的优势 |
| 2.7 本研究的目的和意义 |
| 2.8 本研究的技术路线 |
| 下篇 试验研究 |
| 第三章 深海沉积物宏基因组文库构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与样品 |
| 3.2.2 沉积物基因组总DNA的提取 |
| 3.2.3 沉积物基因组总DNA的纯化 |
| 3.2.4 基于枯草芽孢杆菌的宏基因组文库的构建 |
| 3.2.5 重组克隆子的鉴定 |
| 3.2.6 克隆子保存 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 沉积物基因组总DNA的提取 |
| 3.3.2 文库质量鉴定及评价 |
| 3.3.3 抗菌肽克隆筛选 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 所获抗菌肽结构分析及生物学特性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 抗菌肽抑菌活性分析 |
| 4.2.2 抗菌肽对HT-29细胞的裂解活性 |
| 4.2.3 抗菌肽稳定性测定 |
| 4.2.4 抗菌肽一级和二级结构分析 |
| 4.2.5 数据统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 抗菌肽对多种细菌的抑菌活性和细胞毒性 |
| 4.3.2 抗菌肽在不同条件下的稳定性测定 |
| 4.3.3 抗菌肽结构分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 新型抗菌肽Naseain 9的高效表达 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 重组枯草芽孢杆菌BNAS菌株的构建 |
| 5.2.2 重组枯草芽孢杆菌BNAS的摇瓶发酵 |
| 5.2.3 总RNA的分离和实时定量PCR |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 重组枯草芽孢杆菌BNAS菌株的构建 |
| 5.3.2 重组枯草芽孢杆菌BNAS菌株的摇瓶水平发酵 |
| 5.3.3 抗菌肽Naseain 9的表达合成 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 参考文献 |
| 附录一 质粒转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞的方法 |
| 附录二 比浊法测定抗菌肽抑菌率方法 |
| 附录三 质粒转化大肠杆菌DH5α方法 |
| 致谢 |
| 博士生期间发表的学术论文,专着 |
| 博士后期间发表的学术论文,专着 |
| 个人简历 |
| 永久通信地址 |
（9）昆虫抗菌肽枯草芽孢杆菌工程菌构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 抗菌肽研究进展 |
| 1.1.1 抗菌肽概述 |
| 1.1.2 抗菌肽的作用 |
| 1.1.3 抗菌肽的应用 |
| 1.1.4 昆虫抗菌肽来源 |
| 1.1.5 黑水虻抗菌肽研究进展 |
| 1.1.6 抗菌肽基因工程表达系统构建研究进展 |
| 1.2 本试验研究内容及思路 |
| 1.2.1 研究内容 |
| 1.2.2 创新性 |
| 第2章 黑水虻抗菌肽粗提液抑菌活性检测 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验菌株、昆虫 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.2.3 实验试剂及药品 |
| 2.2.4 试剂及培养基配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 黑水虻抗菌肽粗提取 |
| 2.3.2 黑水虻抗菌肽粗提液抑菌活性鉴定 |
| 2.3.3 提取方法优化 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 抗菌肽粗提液蛋白质含量 |
| 2.4.2 黑水虻抗菌肽粗提液抑菌活性鉴定 |
| 2.4.3 提取方法优化 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第3章 昆虫抗菌肽游离型质粒基因工程菌株构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验试剂及仪器 |
| 3.2.1 实验试剂及培养基 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 抗菌肽重组质粒提取 |
| 3.3.2 重组质粒枯草芽孢杆菌转化 |
| 3.3.3 工程菌发酵液抑菌活性 |
| 3.3.4 发酵菌液蛋白电泳 |
| 3.3.5 工程菌株生长曲线测定 |
| 3.4 试验结果与分析 |
| 3.4.1 抗菌肽重组质粒提取 |
| 3.4.2 重组质粒枯草芽孢杆菌转化 |
| 3.4.3 发酵液抑菌活性检测 |
| 3.4.4 发酵菌液蛋白电泳 |
| 3.4.5 工程菌株生长曲线测定 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第4章 昆虫抗菌肽整合型质粒基因工程菌株构建 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验试剂及仪器 |
| 4.2.1 实验试剂及培养基 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 质粒载体构建 |
| 4.3.2 重组质粒大肠杆菌转化 |
| 4.3.3 重组质粒枯草芽孢杆菌转化 |
| 4.3.4 工程菌发酵液抑菌活性 |
| 4.3.5 发酵菌液蛋白电泳 |
| 4.3.6 工程菌株生长曲线测定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 质粒载体构建 |
| 4.4.2 重组质粒大肠杆菌转化 |
| 4.4.3 重组质粒枯草芽孢杆菌转化 |
| 4.4.4 菌落PCR检测 |
| 4.4.5 发酵液抑菌活性检测 |
| 4.4.6 发酵菌液蛋白电泳 |
| 4.4.7 工程菌株生长曲线测定 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（10）乳二糖磷酸化酶的表达与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 乳二糖磷酸化酶 |
| 1.1.1 乳二糖磷酸化酶概述 |
| 1.1.2 乳二糖磷酸化酶的应用 |
| 1.1.3 乳二糖磷酸化酶的研究进展 |
| 1.2 蛋白表达系统 |
| 1.2.1 原核表达系统 |
| 1.2.2 真核表达系统 |
| 1.3 本论文研究的主要内容及意义 |
| 1.3.1 研究目的及意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 第二章 LNBP在大肠杆菌中的表达 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 培养基及培养条件 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 2.2.2 重组菌E.coli BL21/pET28a-LNBP的验证 |
| 2.2.3 重组菌E.coli BL21/pET28a-LNBP的表达 |
| 2.2.4 粗酶液的制备 |
| 2.2.5 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 重组菌E.coli BL21/pET28a-LNBP的构建 |
| 2.3.2 重组LNBP在大肠杆菌BL21 中的表达 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 LNBP在大肠杆菌中的表达条件优化 |
| 3.1 实验材料与设备 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 培养基及培养条件 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 诱导条件的优化 |
| 3.2.2 显着性分析 |
| 3.2.3 LNBP酶活性的测定 |
| 3.2.4 蛋白含量的测定及SDS-PAGE分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Gal1-P浓度的标准曲线 |
| 3.3.2 初始菌密度对重组LNBP表达的影响 |
| 3.3.3 IPTG浓度对重组LNBP表达的影响 |
| 3.3.4 诱导温度对重组LNBP表达的影响 |
| 3.3.5 诱导时间对重组LNBP表达的影响 |
| 3.3.6 振荡培养的转速对重组LNBP表达的影响 |
| 3.3.7 正交试验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 LNBP工程菌的构建及在枯草芽孢杆菌中的表达优化 |
| 4.1 实验材料与设备 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂及配置 |
| 4.1.3 主要仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 LNBP基因的克隆 |
| 4.2.2 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 4.2.3 重组菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP的验证 |
| 4.2.4 LNBP的表达和纯化 |
| 4.2.5 诱导条件的优化 |
| 4.2.6 LNBP酶活性的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Gal1-P浓度的标准曲线 |
| 4.3.2 LNBP的扩增 |
| 4.3.3 双重消化表达载体和PCR产物 |
| 4.3.4 重组菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP在平板上的生长情况 |
| 4.3.5 重组LNBP在枯草芽孢杆菌中的表达 |
| 4.3.6 诱导时间对重组LNBP表达的影响 |
| 4.3.7 诱导温度对重组LNBP表达的影响 |
| 4.3.8 振荡速度对重组LNBP表达的影响 |
| 4.3.9 初始细胞密度对重组LNBP表达的影响 |
| 4.3.10 IPTG浓度对重组LNBP表达的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 LNBP的纯化及部分酶学性质分析 |
| 5.1 实验材料与设备 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要试剂及试剂的配制 |
| 5.1.3 主要仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 重组LNBP的纯化 |
| 5.2.2 重组LNBP的部分酶学性质分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组LNBP的纯化 |
| 5.3.2 重组LNBP的最适反应温度 |
| 5.3.3 重组LNBP的最适pH |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表文章 |
| 攻读硕士期间申请国家发明专利 |
四、枯草芽孢杆菌整合载体研究进展（论文参考文献）
- [1]枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶及酶电极的制备[D]. 林平. 齐鲁工业大学, 2021(09)
- [2]纤维二糖差向异构酶的分子改造、定向挖掘与食品级表达[D]. 陈秋铭. 江南大学, 2019(05)
- [3]长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达[D]. 王越. 江南大学, 2019(12)
- [4]第二代蛋白酶缺陷型枯草杆菌表达宿主的构建与应用[D]. 赵雷真. 南京农业大学, 2019(08)
- [5]基于恰塔努加链霉菌的聚酮类底盘细胞构建与评估[D]. 卜庆廷. 浙江大学, 2019(03)
- [6]益生芽孢杆菌表达系统的研究进展[J]. 王振华,李建臻,潘康成. 畜牧与兽医, 2018(12)
- [7]芽孢杆菌的表达系统的研究进展[A]. 王振华,李建臻,潘康成. 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第五届第十三次全国学术研讨会论文集, 2018
- [8]基于南海海洋沉积物宏基因组学的新型抗菌肽挖掘与表达[D]. 姬生跃. 中国农业科学院, 2019
- [9]昆虫抗菌肽枯草芽孢杆菌工程菌构建[D]. 徐永洞. 南昌大学, 2018(12)
- [10]乳二糖磷酸化酶的表达与优化[D]. 佟超男. 沈阳农业大学, 2019(02)