一、乙型肝炎病毒X基因酵母表达载体构建及表达（论文文献综述）
王凯航[1]（2019）在《一种内毒素合成途径抑制的整合表达型大肠杆菌菌株的构建及应用》文中提出疫苗在预防和治疗多种人类疾病中发挥着重要的作用。大肠杆菌具有生长快速、培养简单、遗传背景清楚等特点,已被广泛地应用于重组蛋白的表达和生产,但被应用于基因工程疫苗的研发和生产直至近年来才取得突破。目前,大肠杆菌表达系统应用于重组蛋白的表达仍存在一些问题,例如蛋白产物中存在内毒素污染、质粒载体具有不稳定性以及药用重组蛋白生产过程中的抗生素添加问题等。这些不利因素将对重组蛋白的性质、产量、纯化工艺以及使用的安全性带来一定影响。为了解决这些问题,本研究首先从参与大肠杆菌ER2566菌株脂多糖合成途径的关键基因入手并对其进行改造,构建了一种低内毒素水平的菌株,并利用该菌株进行乙肝疫苗候选抗原分子的大规模生产。结果表明与ER2566菌株相比,改造菌株保持了原有的重组蛋白表达能力且获得的重组蛋白具有良好的理化性质,改造菌株表达产物中的内毒素具有起始含量更低（约两个数量级）、经过相同纯化工艺更易去除等特点。我们进一步探索了这些基因位点用于异源基因整合表达的可行性。构建了一种低内毒素水平的整合表达型菌株,并用于HPV疫苗候选抗原分子的表达研究。结果表明基于脂多糖合成途径基因位点构建的整合表达型菌株与基于质粒载体进行表达的原始菌株ER2566相比具有更优良的性质,具体表现为:在无抗生素添加的高密度发酵条件下,3-5拷贝整合表达型菌株中的重组蛋白总体表达量更高且具有更低的内毒素水平。此外,两种表达方式获得的重组蛋白之间具有相似的理化性质。这些结果说明了参与脂多糖合成途径的基因位点可以用于重组蛋白的整合表达。总而言之,本论文中构建的大肠杆菌菌株将为包括基因工程疫苗在内的重组蛋白类药物的研发和生产提供一种新的表达方式。
周兵[2]（2018）在《快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究》文中研究表明感染性疾病是指由细菌、病毒等致病微生物侵袭人体,进而引起机体所发生的一系列具有感染性临床症状的疾病,严重威胁着人类的生命及健康。近年来,抗感染的抗体药物研究发展十分迅速,目前,已经有25种抗感染的抗体药物正在进行临床研究。HBV感染可以导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病,全世界每年约有88万人死于急性或慢性HBV感染。尽管现有预防性疫苗已显着减少了新发HBV感染,全球仍有3亿的慢性HBV感人者需要得到有效的治疗,以预防该病的并发症。当前FDA批准用于慢乙肝治疗的药物有两大类,干扰素和核苷类似物,分别通过调节宿主免疫和抑制病毒的复制从而起到抗病毒的效果。现有的药物虽有着很强的安全性和抗病毒活性,但治疗效果十分有限。这些药物HBsAg的阴转率都不足5%,无法实现临床治愈。因此,需要开发更有效的新药物,以改善HBV相关疾病的临床管理。尽管全人源抗体技术的发展极大增加了全人源抗体成为临床候选株的数量,但FDA批准的大部分治疗性抗体药物仍然以人源化抗体为主。抗体人源化技术主要包括CDR移植（常用噬菌体展示等抗体库技术）、表面重塑、链替换以及计算机辅助设计等,但是现有技术存在改造后人源化抗体亲和力降低、具有较大的免疫原性、工作量大、筛选不可视以及与转换成完整抗体活性不一致等问题,这些都延长了抗体人源化的时间,因此发展新的快速人源化方法势在必行。本研究旨在建立快速点突变抗体人源化新方法,实现快速获得人源化程度高、保持亲本鼠抗活性的人源化抗体。并利用该方法对HBV鼠抗E6F6进行人源化改造,获得有临床治疗潜力的人源化抗体。本研究分为两部分,第一部分是快速点突变抗体人源化平台的建立。通过对CDR划分方法、人源化模板选择方法的比较和分析,确定结合采用Kabat和Contact定义CDR区域,并选择同源性最高的人胚系基因作为模板。通过对现有大量上市或者临床试验中抗体序列和结构的分析以及一些前期人源化改造工作经验总结,抗体序列中每个氨基酸的位置和功能是有一定的规律可寻的。总结规律包括:（1）FR中有些氨基酸存在于CDR接触面上,直接或间接参与抗体与抗原的结合或者对维持抗体CDR构象具有重要的作用,突变时通常选择保留;（2）有些FR残基存在于VH-VK的交界面上,突变时通常选择保留;（3）还有些FR残基属于抗体序列中内部包埋的氨基酸,突变时选择性保留;（4）最后剩下的FR残基就是对抗体活性影响很小的氨基酸,可以直接突变。不管是属于哪一种功能的FR残基,它的位置是相对固定的。12G6是本实验室筛选获得的一株能高效中和乙型流感病毒（Flu-B）的具有广谱性的鼠源单克隆抗体,我们首先分别对它的轻重链可变区进行Kabat编号,然后按照Kabat和Contact定义的CDR区域划分CDR。再利用IMGT网站搜索比对,找出同源性最高的2-3条人胚系基因,进行序列比对。最后根据上述总结的氨基酸规律,对和胚系基因FR中存在的差异氨基酸进行选择性突变,共设计4条重链和4条轻链,分别将其两两互搭进行真核表达,以亲本鼠抗为对照,检测16株人源化抗体的表达情况、结合活性、中和活性等生物学功能。最终,针对12G6,我们挑选出7株优势的人源化抗体。发现在2个不同亚系的乙型流感病毒HA蛋白的结合实验、中和实验和HI实验中,7株人源化抗体保留了 12G6的生物学活性。5B11和7G5是本实验室筛选获得的两株能同时高效中和A/B型呼吸道合胞病毒（RSV）的鼠源单克隆抗体。根据12G6的实验结果,分别对5B11和7G5各设计一种人源化方案,获得N-5B11和N-7G5两株人源化抗体。两株人源化抗体均显示出良好的反应活性和中和活性,且活性与亲本相当。至此我们针对12G6、5B11和7G5三株鼠抗的人源化改造初步完成,验证了改造方案的可行性,完成快速点突变抗体人源化平台的构建。本研究第二部分是利用第一部分建立的新的人源化平台对乙型肝炎病毒鼠抗E6F6人源化,并对获得的人源化抗体进行性质验证及成药性评估。E6F6是本实验室筛选获得的一株针对HBV外膜蛋白（HBsAg）上一个特定表位的鼠源单克隆抗体;它能够有效并持久地清除转基因小鼠体内的HBV和HBsAg,具有发展成为HBV治疗性抗体的潜力。在前期研究中,我们利用噬菌体展示技术对其进行了人源化及亲和力成熟,成功获得了人源化程度为89%,体内外活性与鼠抗相当的人源化抗体162。本研究利用BIAcoreT200对162进行了亲和力测定,其亲和力为4.18×10-10M。通过对162 Fab的晶体培养及结构解析,获得了 162晶体三维结构。将162与HBsAg表位短肽进行对接,得到抗原-抗体相互作用的重要氨基酸。为了验证第一部分所建立的人源化平台的可行性及提高抗体的人源化程度,本研究第二部分利用第一部分中建立的快速点突变抗体人源化平台,结合162氨基酸序列、162晶体结构、与HBsAg短肽对接数据及Discovery Studio模拟平台,对E6F6进行人源化改造,获得3株人源化抗体,huAb1、huAb2和huAb3。在CHO-S细胞中瞬时表达和纯化,并从抗体的均一性、与抗原反应性、中和活性、体内病毒清除效果、成药性评估等方面进行综合分析。huAb1、huAb2和huAb3的人源化程度高达97%,体外结合及中和活性与162相当,但是在HBV转基因小鼠体内持续清除HBsAg的能力有所下降。C57b1/6小鼠体内发现人源化程度为97%的huAb1清除速率较快。说明人源化程度高的抗体在异源小鼠动物模型中免疫原性增加,被较快的清除,但是人源化程度高的抗体在人体内可能具有更高的优势。同时,huAb1、huAb2和huAb3的反嵌合抗体的体外结合、中和以及体内活性均与鼠抗E6F6相当。162、huAb1、huAb2和huAb3的溶解度高达140mg/mL以上,粘度小于14,等电点在8-9之间,达到了抗体药物的标准,TM值大于80℃,具有较好的热稳定性。在人体内环境和药物储存环境的模拟条件下同样具有较好的稳定性。食蟹猴体内药代动力学实验评估162、huAb1、huAb2和huAb3的半衰期符合标准,均能持续有效的清除食蟹猴体内的HBsAg,其中意外发现huAb3的半衰期较长,分析与其表面电荷分布有关,表面电荷降低可能会延缓抗体的清除。药代动力学参数及食蟹猴血常规和血生化结果提示,162、huAb1、huAb2和huAb3具有良好的药物有效性和安全性。进一步研究发现162、huAb1、huAb2和huAb3与HBsAg形成免疫复合物较小,有利于细胞的高效吞噬。通过对人IgG1Fc区域的突变,获得了体外活性与162相当,吞噬效应显着提高的162-IgG1-KD突变体。发现CH的替换可能导致Fc不依赖与FcγR作用途径,而是通过改变Fab与靶标的结合方式,形成不同大小的免疫复合物,影响吞噬效应。同时首次发现了抗体VH和CH1之间的linker对吞噬的影响,在162重链可变区末端引入柔性linker（Gly4Ser）3可能会增大Fab双臂间的距离,降低抗体的吞噬功能。综上所述,本研究建立了快速点突变抗体人源化方法并利用3株不同靶点的鼠抗完成了全面的验证,大大缩短了改造的时间,为鼠源抗体人源化的改造奠定了坚实的基础,丰富了人源化技术手段,为抗体人源化改造提供了新的选择。获得了具有专利保护的用于HBV感染相关疾病治疗的人源化抗体分子162、huAb1、huAb2和huAb3,并完成了较为全面的体内外活性评估及成药性分析,完善了抗体人源化改造平台,为相应疾病治疗性人源化抗体的研发奠定了坚实的基础,有望成为治疗慢乙肝的新药物。
张烜[3]（2010）在《乙型肝炎病毒X基因整合/X蛋白与肝癌发生关系的研究》文中指出乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）的持续感染是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）发生的最主要因素。HBV X （HBx）基因在肝细胞基因组中的整合和X蛋白的反式激活作用对HCC的发生和发展具有重要意义,但其致癌的分子机制目前尚不十分清楚。对HBx的研究大多着眼于X蛋白的反式激活功能,而忽略了HBx基因在肝细胞基因组整合的作用。研究表明,在HBV导致肝癌发生过程中,病毒DNA在宿主基因组中有高频率的整合,整合部位随机分布于多条染色体上,这种整合多发生在HBV X基因区域。前期研究发现,稳定整合HBx基因的人正常肝胞系（L-02-X）发生恶性转化,推测HBx基因的整合可能与肝癌发生有直接关系。此外,HBx蛋白对HCC的发生和转移具有重要作用。近年来研究发现,骨桥蛋白（osteopontin, OPN）及钙蛋白酶小亚基1（calpain small subunit 1,Capn4）与肿瘤细胞的生长、增殖、浸润及转移密切相关。因此,HBx蛋白可能通过OPN及Capn4促进肝癌细胞迁移。为了进一步阐明HBx基因/蛋白与肝癌发生发展的关系,本研究应用细胞模型和病人肝癌组织标本,探讨了HBx基因整合在肝癌发生中的直接作用和HBx蛋白促进肝癌细胞迁移作用的分子机制,主要研究内容如下：第一部分：HBx基因整合与肝癌发生关系的研究一、HBx基因突变体稳定整合细胞模型的建立前期研究发现,稳定整合HBx基因的人正常肝胞系（L-02-X）发生了恶性转化,因此推测HBx基因的整合可能与肝癌发生有直接关系。但是,其中包含了HBx蛋白的反式激活作用。为了探讨HBx基因整合与肝细胞转化的直接关系,首先建立了无反式激活功能的HBx基因突变体稳定整合的细胞模型。本研究中,HBx基因被随机分成五个片段,并分别克隆到真核表达载体pCMVTag-2B,获得的质粒分别命名为pCMV-X1、pCMV-X2、pCMV-X3、pCMV-X4和CMV-X5。将此五个质粒及克隆有全长HBx基因的质粒分别瞬时转染人肝细胞L-02使其蛋白过表达,同时检测对核因子-κB（NF-κB）和人端粒酶反转录酶（hTERT）启动子活性的影响,发现与野生型相比,五个突变的HBx基因片段失去了对NF-κB和hTERT启动子活性的上调作用。通过基因转染技术将克隆有这五个片段的质粒分别导入人正常肝细胞系L-O2和人肝癌细胞系H7402中,经G418筛选,获得了稳定转染细胞系,分别命名为L-02-X1、L-O2-X2、L-O2-X3、L-O2-X4和L-02-X5（或H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4和H7402-X5）。二、HBx基因片段整合导致肝细胞恶性转化的作用为了阐明L-02-X1、L-O2-X2、L-O2-X3、L-O2-X4和L-02-X5细胞系的恶性表型,进行了免疫印迹实验。结果显示,与对照组相比,在L-02-X3和L-02-X5细胞中有甲胎蛋白（AFP）表达,而L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4则检测不到AFP。软琼脂克隆形成实验显示,与对照组相比,L-02-X3和L-02-X5细胞克隆形成能力显着增强,而L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4细胞克隆形成能力与对照组相比无明显差异。进一步研究发现,将L-02-X1、L-02-X2、L-02-X3、L-02-X4和L-02-X5分别皮下接种裸鼠后,L-02-X3和L-02-X5细胞接种的裸鼠在接种部位形成原位瘤,而L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4细胞接种的裸鼠则未能成瘤。本结果说明,整合有HBx基因片段的L-02-X3和L-02-X5细胞发生了恶性转化,HBx基因整合与肝细胞的转化直接相关。三、HBx基因整合导致肝细胞转化分子机制的研究1、HBx基因整合模式的鉴定。提取L-02-X细胞基因组DNA,应用HBx-AluPCR方法检测HBx基因整合模式,测序结果显示,HBx基因整合到Alu核心序列和亚端粒DNA（subtelomeric DNA）序列上游,整合后HBx基因发生了3’末端（381-465 bp）缺失,产生HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体。然后,设计针对该重组体中HBx基因和亚端粒的引物进行PCR,在其他HBx基因稳定整合的细胞系（如H7402-X、3T3-X、HepG2-X和HepG2.2.15）中检测上述重组体是否存在。结果显示,仅在H7402-X细胞系中检测到该重组体。2、HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体与肝细胞转化的关系。为了阐明该重组体是否参与肝细胞的转化,应用上述特异于HBx基因和亚端粒的引物,在稳定整合HBx基因突变体的细胞系（L-02-X1、L-02-X2、L-02-X3、L-02-X4和L-02-X5；H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4和H7402-X5）中进行验证。结果显示,在上述发现的已发生恶性转化的L-02-X3和L-02-X5（或H7402-X3和H7402-X5）细胞中检测到HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体,而未发生转化的细胞无该重组体。为了进一步提供HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组导致肝细胞发生转化的证据,应用报告基因及免疫印迹的方法对L-02-X1、L-02-X2、L-02-X3、L-02-X4、L-02-X5和L-02-X（或H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4、H7402-X5和H7402-X）细胞系转录因子启动子活性及癌蛋白表达进行检测,结果显示NF-κB、AP-1和hTERT启动子活性在L-02-X3、L-02-X5和L-02-X、（或H7402-X3、H7402-X5和H7402-X）细胞中显着增强,而在L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4则与对照组无明显差异。c-Myc、PCNA和Bcl-2蛋白表达在L-02-X3、L-02-X5和L-02-X、（或H7402-X3、H7402-X5和H7402-X）细胞中显着上调,而在L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4细胞中则与对照组无明显差异。提示,HBx基因整合导致的HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组是肝细胞转化的重要原因之一。3、在肝癌和癌旁组织中检测HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体。应用PCR方法对60例肝癌组织和癌旁组织中HBx基因进行检测,发现HBx在60例肝癌组织及其癌旁组织中有44例（73.3%）。然后,应用PCR方法在44例HBx阳性的肝癌组织及其癌旁组织中检测上述重组体,结果发现其中有5例肝癌组织中存在与细胞模型中相同的HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体,而在其对应的癌旁组织无上述重组体,临床标本检测结果进一步证实HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组与肝癌发生有密切的关系。本研究发现HBx基因整合与肝细胞转化具有直接的关系,HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组导致基因组不稳定是肝细胞转化的重要原因之一。这一发现首次为揭示HBV DNA在肝细胞基因组中整合的致癌作用提供了直接证据,对于肝癌的预防具有重要的指导作用。第二部分：HBx蛋白促进肝癌细胞迁移分子机制的研究近年研究发现OPN和Capn4与肿瘤细胞的生长、增殖、浸润及转移密切相关。因此,HBx蛋白可能通过OPN及Capn4促进肝癌细胞迁移,为此进行了以下研究：一、HBx蛋白促进肝癌细胞迁移信号传导途径的研究本研究对HBx蛋白促进肝癌细胞迁移的信号传导途径进行了探讨。前期研究发现HBx蛋白通过NF-κB上调肝癌细胞HepG2和H7402中Capn4的表达；在此基础上,进一步研究显示HBx蛋白在启动子转录活性、mRNA及蛋白等水平通过5-脂氧化酶（5-LOX）上调肝癌细胞HepG2和H7402中OPN的表达；进而,OPN可以通过NF-κB上调肝癌细胞HepG2和H7402中Capn4的表达；而Capn4则以正反馈的形式对肝癌细胞HepG2和H7402中OPN的表达起调节作用。体外划痕实验显示,HBx蛋白可显着增强肝癌细胞HepG2的迁移能力,而对HepG2-X细胞中OPN或Capn4进行RNA干扰后,其迁移能力受到明显抑制。表明,HBx蛋白通过正反馈环HBx/5-LOX/OPN/NF-κB/Capn4/OPN促进肝癌细胞迁移。二、HBx蛋白突变体HBxΔ127促进肝癌细胞迁移分子机制的研究实验室前期研究发现了一个新的HBx蛋白突变体,将其命名为HBx△127。研究表明,HBx△127具有明显促进肝癌细胞增殖的作用。在此基础上,本研究探讨了HBx△127对肝癌细胞迁移的影响,结果发现HBx△127具有促进肝癌细胞迁移的作用。HBx△127可通过5-LOX上调肝癌细胞中OPN的表达,进而促进肝癌细胞迁移。与野生型HBx蛋白相比,HBx△127促进肝癌细胞迁移的作用更强。上述实验结果进一步丰富了HBx蛋白及其突变体促进肝癌细胞迁移的分子机制,为肝癌的治疗提供了理论基础。
陈宗艳[4]（2008）在《DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用》文中认为鸭乙型肝炎病毒（Duck Hepatitis B Virus,DHBV）与乙型肝炎病毒（Hepatitis BVirus,HBV）同属嗜肝DNA病毒科,这类病毒的特征是有强的嗜肝细胞特性,在病毒形态、基因组结构、复制过程等生物学特性相似。DHBV感染鸭模型是研究HBV的生物学特性、致病机制和抗HBV药物的实验动物模型。本文通过调查四川地区麻鸭自然携带DHBV的情况,分离DHBV毒株,以此毒株为模板,扩增主要抗原基因preS。通过构建DHBV-preS原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化检测人工感染DHBV后在体内的蛋白定位分析与侵染规律,以期系统地了解的入侵方式和复制机理,为阐明DHBV的发病机制提供关键的实验数据。同时建立基于定量检测DHBV的FQ-PCR方法,用于DHBV疾病模型研究,并结合体外模型HepG2.2.15细胞研究抗乙型肝炎新药,结果如下:DHBV毒株的分离及分子特征解析结果表明:四川麻鸭自然携带DHBV 4%,证实四川麻鸭是研究实验性DHBV感染动物模型的良好鸭种;对分离到的其中3株DHBV阳性血清全基因克隆、测序并进行生物信息学分析,发现全基因组均含3006个核苷酸（GenBank登录号EU429324,EU429325,EU429326）,具有X-like开放阅读框特征;进一步研究ORF-S还表明该基因编码33个氨基酸,有四个疏水区,无N-糖基化位点,也无豆蔻酰化位点,在1～30aa内有一个明显的信号肽,在19～20aa处有断点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白,抗原位点主要分布于preS区氨基酸序列中。根据DHBV-preS序列,设计一对特异性引物,以分离的DHBV毒株为模板扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将DHBV-preS基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的ApaI和NcoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a（+）/DHBV-preS。重组表达质粒pET32a（+）/DHBV-preS转化表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,能表达出了大小约为37kD的preS重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a（+）/DHBV-preS的最佳诱导条件为0.8mmol/LIPTG、37℃条件下诱导4h。表达产物用镍柱亲和层析纯化后,将得到的preS重组蛋白做梯度稀释,初步建立ELISA检测DHBsAb的方法（间接法）;同时将纯化的重组蛋白与等量弗氏佐剂混合制备preS重组蛋白免疫原,四次免疫家兔,获得的兔抗DHBV-preS高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。建立DHBV-preS基因表达蛋白抗体介导的免疫组化方法;针对DHBV的保守序列设计并合成引物及荧光标记探针,建立实时荧光定量聚合酶链反应（fluorsescencequantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）检测方法。建立的标准曲线循环阈值（cycle threshold,Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.993,将其检测极限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为5copies/L,未检测到鸭病毒性肝炎、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌,表明FQ-PCR检测DHBV方法灵敏、特异性强。采用鸭乙型肝炎病毒人工方法感染1日龄四川麻鸭,攻毒后于不同时间采血分离血清,采集肝脏、胰腺、肾脏、脾脏等组织或器官,经建立的DHBV-preS基因表达蛋白抗体免疫组化方法和FQ-PCR方法检测DHBV在感染鸭体内侵染过程与定位分布,并结合组织学和血液生化指标对DHBV在感染鸭体模型侵染规律进行系统观察。结果显示:感染后2d可在血清和肝组织中检测出DHBV DNA,血清中DHBV DNA从感染后第10d～30d DHBV DNA的拷贝数保持在1.00E+09以上,肝组织中DHBVDNA的含量从感染后第5d～52d保持在5.00E+09以上;肝脏DHBV DNA第14d达到最高水平,而血清中DHBV DNA第22d达到最高水平。肝脏、胰腺、肾脏、脾脏的损伤程度与DHBV DNA水平成正相关;在感染后3～52d内的不同时间点从肝脏、胰腺、肾脏、脾脏及大脑六种组织器官中检测出DHBsAg,DHBsAg主要分布在细胞浆,少部分分布于细胞核,未能从食道、腺胃、肺、心脏、生殖器和肌肉中检测到DHBsAg,表明DHBV嗜肝的同时具有泛嗜性,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性;在感染后1～3d、52d以后各组织相继不能检出DHBsAg,感染后12～31d病毒在机体内各组织的分布最为广泛,感染后4d肝脏开始出现DHBsAg阳性细胞,感染后6d肾脏、胰腺、脾脏相继开始出现DHBsAg阳性细胞,而脑组织在感染后10d出现阳性细胞;肝脏的检出率最高,持续至52d,大脑的检出率最低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。DHBV感染后第4d,总蛋白和白蛋白含量开始降低,谷丙、谷草转氨酶活性升高（P＜0.01）,乳酸脱氢酶活性升高（P＜0.01）,肌酐和尿素有变化但无规律,表现为升高趋势,感染后44d开始,各项血液生化指标逐渐趋于正常值,表明DHBV引起肝脏损伤的同时累及肾脏。在建立的抗人类乙型肝炎新药体内药效评价的技术平台和体外模型HepG2.2.15上评价抗乙型肝炎新研制药物-核苷类似物（代号PNA）的作用。在HepG2.2.15细胞系中,PNA有明确的抑制HBV DNA复制作用,抑制HBsAg和HBeAg,在7.8～62.5μg/mL剂量范围内有剂量—时间依赖关系,未见到明显细胞学毒性;在鸭乙肝动物模型中,PNA对DHBV DNA抑制率达50%的最低用药剂量为口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kg PNA对DHBV的抑制率与拉米夫定口服组（50mg/kg）基本一致,可以减轻鸭脏炎症,抑制DHBsAg在肝脏中的表达。
张艳[5]（2008）在《HBsAg真核表达载体的构建及在CHO细胞高效表达的研究》文中研究说明以pCI和pCIneo为起始质粒,通过改造目的基因及表达载体,对CHO细胞系统高效表达乙肝表面抗原进行了初步探索。结果显示,通过更换启动子、引入内含子、去除目的基因的5′和3′非翻译区、弱化抗性标记基因、改造目的基因中的稀有密码子等方法,成功构建了乙型肝炎病毒表面抗原S基因的新型表达载体。将构建的表达载体分别转染到CHO/dhfr-细胞中,均表达出了乙型肝炎表面抗原（HBsAg）,经三轮梯度加压筛选获得抗性细胞群。单层培养分泌动态研究表明其HBsAg表达量稳定在512～1024/两天,比原有生产细胞株HBsAg表达量提高近2倍,为提高基因工程乙肝疫苗的产量奠定了实验基础。
田江克[6]（2007）在《乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究》文中认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化（LC），甚至肝细胞癌（HCC）。HBV感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究HBV抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对HBV的致病机制做出解释，为寻找有效防治HBV的方法提供新线索。HBV基因组具有4个主要的开放读码框架（ORF），分别命名为S、C、P、X区，其中S区通过三个框架（in-frame）内起始密码子（ATG）分为三个结构域：前-S1，前-S2和S结构域，由此3个ATG开始编码产生3种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白（SHBs），中蛋白（MHBs．前-S2+S）和大蛋白（LHBs：前-S1+前-S2+S）。完整的MHBs多肽链是由55个aa的PreS2区和226个aa的S区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白（MHBst）具有反式调节功能，在HBV致病（癌）过程中发挥着重要的作用，但MHBst与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。为研究羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型cDNA白细胞文库中与MHBst的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白-蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母a和α接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率；在原技术基础上增加了3个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达95％。我们首先利用多聚酶链反应（PCR）方法扩增羧基末端167位aa截短的HBV表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体pGBKT7中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞AH109（a型）并在其内表达，Western-blotting验证。然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187（α型）进行配合。结果成功克隆出MHBst蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺（SD／-Trp-Leu-Ade-His）培养基又能在铺有X-α-半乳糖（X-α-gal）的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落10个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到9种已知基因，ADP核糖基因子2个，RAB6相互作用蛋白1个，CCR4-NOT转录复合体亚基10（CCR4-NOT-10）1个，脂多糖蛋白结合蛋白（LBP）1个，醛缩酶B（ALDOB）1个，补体成分3（C3）1个，丙酮酸脱氢酶（PDH）1个，人类细菌人工染色体（BAC）1个。为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白（LBP）基因并克隆入酵母表达载体pGADT7，在TNT网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素35S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实LBP可以与MHBst特异性结合。本研究成功克隆出MHBst结合蛋白，为进一步研究其在HBV感染中的作用提供了新线索。
钱炳俊[7]（2007）在《乙型肝炎新型植物口服疫苗的研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎（Hepatitis B,HB）是一种由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染所引起的传染性疾病,我国大约有10%的人群是乙肝病毒携带者。目前仍然缺乏有效的治疗手段治疗HB,因此,主要靠接种疫苗来进行预防HB。由于现在使用商业化HBV疫苗主要通过酵母表达系统生产,存在较高的生产成本,而且需要冷藏,因此对边远和经济不发达地区人群疫苗接种普及带来困难。此外,大约有10%的接种人群对现在商业化HB疫苗不产生明显免疫反应。因此,探索研制新型价廉的HB疫苗成为疫苗研究关注的焦点。本研究在国内外已有工作基础上,对人新型HBV表面抗原融合基因SS1进行了改造,并将SS1基因转入植物中,开展了相关研究,取得以下主要结果。1、为了分析新型乙肝表面抗原SS1（在乙肝主要表面抗原（S）的C端融合了乙肝表面抗原前体肽preS1（21-47aa））是否具有preS1的免疫原性,并在体内激起针对preS1的抗体反应,我们依照大肠杆菌B株系的密码子偏爱特性改造和合成了全长的adr血清型preS1基因（spreS1）并在大肠杆菌进行了表达。结果显示表达产物以可溶性形式存在,表达量占到总蛋白的44%,经过Ni-NTA亲和层析纯化,纯化的蛋白纯度达到98%以上,western blot和间接ELISA结果表明该重组蛋白具有preS1的抗原性,而且抗原性与现在商业化的preS1相当。这些克服了以往在表达全长preS1蛋白时遇到的包涵体、表达产物不稳定或低表达的难题。2、为了探索生产一种新型的HB口服疫苗形式,我们选择了水稻作为新型乙肝表面抗原SS1的表达宿主。我们通过目前的文献报道选取了水稻种子表达的高效表达启动子PGluB-4,构建乙型肝炎抗原基因SS1的水稻种子高效表达载体p1300GSS1,通过农杆菌转化,实现了其在水稻种子中的表达。重组蛋白的表达量为31.5 ng/g DW种子,且能够自组装成病毒样颗粒结构（virus-like particles,VLP）,颗粒的粒径大约为22±2 nm,沉降系数为1.25 g.cm-3。Western blot结果显示同时具有S和preS1抗原性。动物免疫试验显示重组蛋白能够在小鼠体内激起针对S和preS1的抗体反应,这些为今后的临床评价提供理论基础。3、为了进一步提高新型乙肝表面抗原SS1在植物体内的表达水平,我们首次尝试利用植物叶绿体表达系统进行这种新型乙肝表面抗原的表达。越来越多的研究表明植物叶绿体表达系统具有诸多优越性,其中外源基因的高效表达最引人注目。乙肝表面抗原是一种糖蛋白,而且它的糖基化程度与其抗原性直接相关,本研究构建了其烟草的叶绿体表达载体并进行了烟草的遗传转化,结果显示外源基因被正确地整合到叶绿体基因组中预定的位点,表达的重组蛋白经乙肝表面抗原检测试剂盒检测具有抗原性,相关的研究还在继续中。4、为了提高口服疫苗的免疫效果,我们对目前常用的免疫佐剂分子霍乱毒素B亚基蛋白（cholera toxin B,CTB）进行了大肠杆菌表达。本研究首先克隆了去除信号肽编码序列的霍乱毒素B亚基基因CTB,构建了大肠杆菌表达载体,进行表达,结果显示表达产物以包函体的形式出现,表达量占到总蛋白的25%,经过包函体的变性和复性,纯化的蛋白纯度达到98%,体外生活性试验表明纯化的蛋白主要以五聚体的形式出现,western blot结果显示五聚体大约占到总纯化蛋白的66.8%。由于现在商业化的疫苗中还没有添加任何佐剂成份,尤其是CTB蛋白,所以口服免疫佐剂表达系统的建立为今后水稻表达的新型乙肝表面抗原的动物口服试验提供了基础。
陈国凤[8]（2005）在《乙型肝炎病毒DNA聚合酶功能域结合蛋白和反式调节基因的研究》文中研究指明乙型肝炎病毒（HBV）是嗜肝DNA病毒,HBV DNA长度约为3.2kb,含4个开放读码框架（ORF）,分别编码HBV的表面抗原蛋白,核心/e抗原蛋白,X蛋白以及HBV DNA聚合酶（HBV Pol）。HBV Pol基因在ORF中最长,并且与C、S、X基因区有重叠,其编码的P蛋白含有3个功能域和1个无意义的隔离片（spacer,SP）,排列顺序为N-末端蛋白（TP）,SP,逆转录酶（RT）/DNA聚合酶（PR）和核糖核酸酶H（RNase H）。由于受到不能从病毒体直接纯化和在不同的系统中表达有活性的酶的限制,目前对聚合酶及其所编码的各个功能区域蛋白质的功能的认识还不是很清楚。为了研究病毒蛋白质对肝细胞的作用,用酵母双杂交技术筛选HBV Pol蛋白与肝细胞相互作用蛋白的编码基因;用基因表达谱芯片技术,筛选各功能域的反式调节基因。 根据含有HBV Pol全基因组cDNA的质粒G318A7 AF384372,设计了TP、PR和RNase H引物,PCR扩增后构建酵母表达载体pGBKT7-TP、pGBKT7-PR、pGBKT7-RNase H,用醋酸锂法转入酵母细胞AH109后,表达各自蛋白,用Western blotting确定蛋白表达。将转化好的AH109/pGBKT7-TP酵母菌与含有肝cDNA文库的酵母菌Y187在营养缺陷培养基（三缺培养基:SD/-His/-Leu/-Trp,四缺培养基:SD/-Trp-Leu-His-Ade）上进行配合,在铺有X-α-gal的四缺培养基上进一步筛选。挑取蓝色阳性菌落提取酵母质粒。测序并进行生物信息学分析。 对TP的研究中,成功得到47个与TP特异性结合的阳性克隆,包括人类固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）、Ⅰ型乙醇脱氢酶γ亚基（ADH3）,也称为依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶,RNA聚合酶Ⅱ亚单位（hsRPB7）、血浆铜蓝蛋白（CP）,去唾液酸糖蛋白受体2（ASGR2）等21种已知功能蛋白质基因和19个假设蛋白基因。提示TP可以与人肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,具有较广泛的生物学功能。
万家余[9]（2005）在《甲、乙型肝炎口服二价DNA疫苗的研究》文中研究指明我国属于甲、乙型肝炎高发区,主要靠接种甲、乙型肝炎疫苗加以预防,由于现有的疫苗生产成本高,接种次数多等特点,使得这些疫苗难以推广应用,特别在贫困地区,需要研制一种安全、高效、方便和经济等优点的甲、乙型肝炎双价疫苗。目前,利用减毒沙门氏菌作为载体的多价DNA 口服疫苗,具有生产、免疫方便等优良特点。本实验构建甲、乙型肝炎病毒的融合抗原基因SVPX,首先进行体外毕赤酵母细胞和CHO 细胞表达研究,结果表明,融合抗原基因在真核细胞里表达的蛋白具有甲、乙型肝炎抗原特性。构建含融合抗原基因的重组DNA 疫苗,以减毒沙门氏菌载体,进行小鼠口服免疫研究,结果表明,重组DNA 疫苗能够诱导机体产生针对两种抗原特异性体液和细胞免疫反应。同时,用IL-18 作为基因佐剂,能够进一步增强体液和细胞免疫的作用。本实验首次进行以减毒沙门氏菌为载体的甲、乙型肝炎口服二价DNA 疫苗的研究。
成军[10]（2004）在《科学研究的设计和方法中的科学性》文中研究表明生物学和医学的研究发展很快,不断有新的理论和技术出现,推动着生物学和医学领域的不断发展.现代分子生物学技术和理论为肝脏病学的研究提供了前所未有的机遇.由于发展不平衡,对于新理论和新技术的接受程度和推广还有一段艰难的过程.在这一过程中,不可避免地存在一些认识上的误差和偏差.因此本文选取3个有代表性的例子, 阐明科学研究的设计和方法中的科学性.
二、乙型肝炎病毒X基因酵母表达载体构建及表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒X基因酵母表达载体构建及表达（论文提纲范文）
（1）一种内毒素合成途径抑制的整合表达型大肠杆菌菌株的构建及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.1.1 大肠杆菌K-12系和B系菌株 |
| 1.1.2 重组蛋白在大肠杆菌中表达的调控体系 |
| 1.1.3 基于质粒载体的表达研究 |
| 1.1.4 基于大肠杆菌染色体的表达研究 |
| 1.2 外源基因在大肠杆菌染色体中的整合策略 |
| 1.2.1 位点特异性重组系统 |
| 1.2.2 λ-Red同源重组系统 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9基因编辑系统 |
| 1.3 细菌内毒素 |
| 1.3.1 大肠杆菌脂多糖合成途径 |
| 1.3.2 内毒素的检测方法 |
| 1.3.3 内毒素的去除方法 |
| 1.4 基于原核表达系统的基因工程疫苗现状 |
| 1.4.1 现阶段基因工程疫苗研发及上市情况 |
| 1.4.2 基因工程疫苗中活性成分的主要形式 |
| 1.4.3 常用的表达系统及比较 |
| 1.5 本研究的目的和意义以及研究思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 菌株及质粒 |
| 2.1.3 常用酶及单克隆抗体 |
| 2.1.4 培养基及其他常规溶液 |
| 2.1.5 软件 |
| 2.1.6 分子克隆实验所用到的引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 λ-Red同源重组鉴定及抗性标签去除 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9基因编辑及鉴定 |
| 2.2.4 细菌总基因组的提取及基因组测序和分析 |
| 2.2.5 细菌总mRNA提取及转录组测序和分析 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.2.7 质粒保有率测定 |
| 2.2.8 蛋白表达及纯化 |
| 2.2.9 蛋白的质量分析 |
| 2.2.10 细菌内毒素定量检测 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 大肠杆菌ER2566菌株基因组学研究 |
| 3.1 大肠杆菌ER2566菌株的基因组学研究 |
| 3.1.1 大肠杆菌ER2566菌株基因组测序数据统计 |
| 3.1.2 基因组拼接组装 |
| 3.1.3 基因功能预测及注释 |
| 3.1.4 基因共线性分析 |
| 3.2 第一部分小结 |
| 第二部分 低内源性内毒素的大肠杆菌ER2566菌株改造及应用 |
| 3.3 大肠杆菌脂多糖突变菌株的构建 |
| 3.3.1 基因敲除及鉴定 |
| 3.3.2 基因点突变及鉴定 |
| 3.4 改造菌株脂多糖分子的定量检测 |
| 3.5 改造菌外源蛋白表达情况研究及生长曲线绘制 |
| 3.6 改造菌株高密度发酵研究 |
| 3.6.1 高密度发酵条件下改造菌株的生长情况 |
| 3.6.2 培养及表达条件优化 |
| 3.6.3 HBVCR-T3B蛋白表达后纯化及质量等同性研究 |
| 3.7 第二部分小结 |
| 第三部分 单拷贝整合表达菌株的构建及评价 |
| 3.8 单拷贝染色体整合表达菌株构建及染色体整合位点研究 |
| 3.8.1 整合位点处转录本丰度的测定 |
| 3.8.2 整合表达菌株构建及蛋白表达情况鉴定 |
| 3.9 外源基因整合表达稳定性研究 |
| 3.10 高密度发酵研究 |
| 3.11 HPV L1蛋白在整合表达菌株中的表达情况及性质鉴定 |
| 3.12 第三部分小结 |
| 第四部分 多拷贝整合表达菌株的构建及评价 |
| 3.13 多拷贝整合菌的构建及鉴定 |
| 3.14 摇瓶培养条件下蛋白表达情况研究 |
| 3.15 发酵培养条件下蛋白表达情况研究 |
| 3.16 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 大肠杆菌ER2566菌株的基因编辑策略 |
| 4.2 异源基因整合位点和拷贝数对其表达量的影响 |
| 4.3 大肠杆菌脂多糖合成途径的改造 |
| 4.4 低内毒素的整合表达型大肠杆菌应用于重组蛋白类药物生产中的优势 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 在校期间发表的论文 |
| 在校期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
（2）快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗体(Antibody)的概述 |
| 1.1.1 抗体的结构与功能 |
| 1.1.2 抗体的人源化 |
| 1.1.3 抗体药物市场 |
| 1.1.4 抗感染抗体药物的概况及趋势 |
| 1.1.5 Fc改造对效应功能的影响 |
| 1.2 乙型肝炎病毒(HBV)的概述 |
| 1.2.1 HBV基因组 |
| 1.2.2 HBV的病毒结构 |
| 1.2.3 HBV的生命周期 |
| 1.2.4 HBV基因编码的蛋白 |
| 1.2.5 HBV的基因型 |
| 1.2.6 HBV的流行病学 |
| 1.2.7 HBV的预防 |
| 1.2.8 HBV感染的抗病毒治疗 |
| 1.3 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验常用溶液及试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 常规细胞生物学方法 |
| 2.2.3 抗体的表达、纯化及鉴定 |
| 2.2.4 免疫学相关实验方法 |
| 2.2.5 体外调理吞噬实验 |
| 2.2.6 抗原-抗体免疫复合物特征分析 |
| 2.2.7 HBV相关抗体的小鼠体内实验方法 |
| 2.2.8 亲和力常数测定 |
| 2.2.9 抗体晶体培养及结构解析 |
| 2.2.10 食蟹猴体内评估抗体的药代动力学 |
| 2.2.11 抗体生物物理特性相关实验方法 |
| 2.2.12 数据处理统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 快速点突变抗体人源化平台的构建 |
| 3.1 流感病毒鼠源抗体12G6的人源化 |
| 3.1.1 12G6-cAb体外活性的评估 |
| 3.1.2 12G6-cAb的人源化设计 |
| 3.1.3 12G6人源化抗体真核表达载体的构建 |
| 3.1.4 12G6人源化抗体小量转染细胞上清性质鉴定 |
| 3.1.5 12G6人源化抗体大量表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.2 呼吸道合胞病毒鼠源抗体5B11和7G5的人源化 |
| 3.2.1 5B11-cAb和7G5-cAb体外活性的评估 |
| 3.2.2 5B11-cAb和7G5-cAb的人源化设计 |
| 3.2.3 5B11和7G5人源化抗体构建、表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒治疗性抗体的改造及成药性评估 |
| 3.4 E6F6人源化抗体162的亲和力测定 |
| 3.4.1 E6F6人源化抗体162的晶体培养及结构解析 |
| 3.4.2 E6F6鼠抗的人源化改造 |
| 3.4.3 E6F6人源化抗体体内外活性的评估 |
| 3.4.4 E6F6人源化抗体的成药性评估 |
| 3.4.5 E6F6人源化抗体与HBsAg免疫复合物的结构特征分析 |
| 3.4.6 E6F6人源化抗体162 Fc改造对吞噬的影响 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼠源抗体人源化方法 |
| 4.2 抗体CDR的划分和人源化模板的选择 |
| 4.3 FR区人源化点突变规则 |
| 4.4 E6F6人源化抗体在小鼠体内的清除速率 |
| 4.5 E6F6人源化抗体huAb1和huAb3在食蟹猴体内的半衰期 |
| 4.6 抗原-抗体复合物电镜观察与纳米流式检测 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（3）乙型肝炎病毒X基因整合/X蛋白与肝癌发生关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 符号说明 第一章 引言 |
| 第一节 乙型肝炎病毒(HBV)分子结构 |
| 第二节 HBV DNA整合与肝癌发生 |
| 第三节 HBx基因/蛋白在肝癌发生发展中的作用 |
| 第四节 骨桥蛋白和钙蛋白酶小亚基1在肝癌转移中的作用 |
| 第五节 研究目的和意义 第一部分 乙肝病毒X基因整合致癌作用的研究 |
| 第二章 HBX基因突变体稳定整合细胞模型的建立 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 HBX基因片段整合导致肝细胞恶性转化作用的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 HBX基因整合导致肝细胞转化分子机制的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 第二部分 HBX蛋白促肝癌细胞迁移作用分子机制的研究 |
| 第五章 HBX蛋白促肝癌细胞迁移的信号传导途径 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第六章 小结与展望 参考文献 综述:乙肝病毒致癌分子机制研究进展 |
| 参考文献 致谢 附录 常规溶液配制 个人简历、在学期间发表的论文与研究成果 |
（4）DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用（论文提纲范文）
| 本研究的创新点 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 鸭乙型肝炎病毒的研究进展 |
| 1 DHBV生物学特性 |
| 1.1 包膜蛋白 |
| 1.2 核蛋白 |
| 1.3 P蛋白 |
| 1.4 X抗原 |
| 2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型 |
| 2.1 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的建立 |
| 2.2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的应用 |
| 3 DHBV感染鸭动物模型 |
| 3.1 DHBV感染动物模型的建立 |
| 3.2 DHBV感染动物模型的影响因素 |
| 4 DHBV感染动物模型的相关研究及应用 |
| 4.1 DHBV感染鸭的各种动物模型 |
| 4.2 DHBV突变株的生物学意义 |
| 4.3 抗HBV药物筛选模型 |
| 4.4 液制品消毒学领域的应用 |
| 5 小结 |
| 5.1 存在的问题 |
| 5.2 展望 |
| 第二章 病毒功能性蛋白的原核表达及其应用的研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 病毒功能性蛋白表达采用的原核表达系统 |
| 2.1 原核表达系统 |
| 2.2 外源基因在大肠杆菌细胞中的表达 |
| 2.3 影响克隆基因在大肠杆菌细胞中表达效率的因素 |
| 3 病毒功能性基因的原核表达 |
| 3.1 嗜肝DNA病毒的原核表达 |
| 3.2 鸭乙型肝炎病毒preS蛋白的功能及其原核表达 |
| 4 应用前景 |
| 4.1 preS蛋白的功能研究 |
| 4.2 preS抗原的诊断及预后作用 |
| 4.3 preS抗原与疫苗 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 DHBV阳性血清的分离、全基因组的克隆及序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 菌株及质粒 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 阳性血清的分离 |
| 2.2 DHBV全基因组的克隆 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 血清DHBV-DNA的分离 |
| 3.2 DHBV全基因序列扩增和克隆 |
| 3.3 四川麻鸭DHBV全基因测序结果 |
| 3.4 四川麻鸭DHBV全基因序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 DHBV PRES基因表达质粒的构建与表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及表达载体 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 常用材料与试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 扩增目的基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增目的基因 |
| 2.3 PCR产物的鉴定 |
| 2.4 原核表达质粒的构建 |
| 2.5 转化表达菌株BL21 |
| 2.6 诱导表达 |
| 2.7 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.8 Western blotting检测 |
| 2.9 表达蛋白的可溶性和不可溶性分析 |
| 2.10 表达条件的优化 |
| 2.11 重组蛋白的大量诱导表达 |
| 2.12 Ni—NTA亲和层析纯化重组蛋白的纯化 |
| 2.13 纯化蛋白的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2 T载体克隆及测序鉴定 |
| 3.3 原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.4 诱导表达 |
| 3.5 可溶性分析 |
| 3.6 免疫印迹 |
| 3.7 表达条件的优化 |
| 3.8 重组蛋白的纯化 |
| 3.9 SDS-PAGE分析纯化蛋白 |
| 3.10 纯化蛋白的应用 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 基于鸭乙型肝炎病毒PRES蛋白免疫组化方法建立及其病毒感染鸭的抗原定位 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制 |
| 2.2 雏鸭人工感染DHBV标本采集 |
| 2.3 免疫组化检测DHBV方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫组化方法的建立 |
| 3.2 免疫组化检测各组织器官的定位研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫组化方法检测DHBsAg的建立 |
| 4.2 免疫组化方法检测DHBsAg建立的意义 |
| 4.3 免疫组化方法对DHBsAg的定位研究 |
| 5 小结 |
| 第六章 实时荧光定量PCR检测鸭乙型肝炎病毒方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 标准品的制备 |
| 2.2 待检标本的来源 |
| 2.3 FQ-PCR条件的建立和优化 |
| 2.4 FQ-PCR的敏感性检测 |
| 2.5 FQ-PCR的特异性检测 |
| 2.6 FQ-PCR的可重复性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 反应体系的优化 |
| 3.2 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.3 荧光定量PCR稳定性和重复性试验 |
| 3.4 荧光定量PCR特异性试验 |
| 3.5 荧光定量PCR敏感性试验 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第七章 鸭乙型肝炎病毒在感染鸭体内侵染规律 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制 |
| 2.2 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的病理组织学研究 |
| 2.3 DHBV在感染鸭体内的侵染和分布规律 |
| 2.4 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的血液生化指标的研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 病理组织学变化 |
| 3.2 免疫组化检测各组织器官的变化规律 |
| 3.3 DHBV-DNA在血清和肝组织中的变化规律 |
| 3.4 血液病理学变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 雏鸭人工感染DHBV后在体内的侵染规律及其意义 |
| 4.2 DHBV感染发病机理探讨 |
| 4.3 病理组织学和血液生化指标变化规律 |
| 5 小结 |
| 第八章 免疫组化、FQ-PCR和鸭乙型肝炎病毒感染模型联合评价抗人类乙肝新药的实验研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试药物 |
| 1.2 常用材料与试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2 体外实验方法 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 HepG2 2.2.15细胞的传代与培养 |
| 2.3 细胞毒性试验 |
| 2.4 对细胞分泌(上清)的HBsAg、HBeAg的抑制试验 |
| 2.5 上清病毒基因组DNA的分离及定量检测 |
| 2.6 细胞总DNA的提取及定量检测 |
| 3 体内实验方法 |
| 3.1 毒株 |
| 3.2 主要试剂 |
| 3.3 实验动物及分组 |
| 3.4 鸭肝组织标本形态学观察 |
| 4 结果 |
| 4.1 受试药物对HepG 2.2.15细胞毒性作用结果 |
| 4.2 受试化合物细胞水平药效学研究结果 |
| 4.3 FQ-PCR检测血清和肝组织中DHBV-DNA的结果 |
| 4.4 病理学检查结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻博期间发表的论文 |
（5）HBsAg真核表达载体的构建及在CHO细胞高效表达的研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 第一章 绪论 |
| 一、病毒性肝炎 |
| 二、乙型肝炎 |
| 三、乙型肝炎病毒 |
| 四、乙型肝炎的治疗与预防 |
| 五、乙型肝炎疫苗的研究进展 |
| 六、基因工程乙肝疫苗的表达系统 |
| 七、CHO 细胞系统高效表达外源基因的研究进展 |
| 八、本论文选题依据和可行性分析 |
| 第二章 乙肝表面抗原（HBsAg）S 基因的克隆及基因突变 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第三章 表达载体的构建 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第四章 重组CHO 高产细胞株的构建及筛选 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 仪器设备 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 |
| 前言 |
| 1 己知基因的克隆化鉴定 |
| 2 体外翻译 |
| 3 体外免疫共沉淀 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 论着 |
| 致谢 |
（7）乙型肝炎新型植物口服疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 植物口服疫苗的原理及其研究现状 |
| 1: 口服疫苗的免疫原理 |
| 1.1 口服疫苗的免疫机制 |
| 1.2 粘膜免疫应答的效应 |
| 1.3 公共粘膜免疫系统的响应 |
| 2: 植物作为口服疫苗的生产优势 |
| 3: 植物口服疫苗的生产流程 |
| 4: 植物表达系统 |
| 4.1.植物品种的选择 |
| 4.2 植物生产系统的选择 |
| 4.2.1 植物细胞培养 |
| 4.2.2 植物组织培养 |
| 4.2.3 整株植物 |
| 4.3 表达系统的选择 |
| 4.3.1.稳定整合表达 |
| 4.3.2.植物病毒瞬间表达 |
| 5.利用植物表达系统可以生产的疫苗种类 |
| 5.1.传染性疾病的疫苗 |
| 5.2.自主免疫性疾病的疫苗 |
| 5.3.人肿瘤疫苗 |
| 6: 植物疫苗目前的主要生产种类和临床研究状况 |
| 6.1 产肠毒素型大肠杆菌疫苗 |
| 6.2 乙肝病毒疫苗 |
| 6.3 诺瓦克病毒疫苗 |
| 6.4 狂犬病毒疫苗 |
| 7.植物口服疫苗的安全性与公众关注 |
| 8.植物疫苗的未来前景 |
| 参考文献 |
| 第二章 植物乙肝疫苗的生产和免疫呈递方式研究进展 |
| 1.口服递呈方式的选择 |
| 2.乙肝口服疫苗的植物表达系统标准 |
| 3.乙肝抗原的植物表达体系 |
| 4.植物组织表达的乙肝主要表面抗原的特征 |
| 5.植物组织表达的乙肝主要表面抗原的免疫效果 |
| 6.植物组织表达的乙肝主要表面抗原的临床试验 |
| 7.展望 |
| 本研究立题依据和意义 |
| 试验部分 |
| 第一章 利用大肠杆菌偏爱密码子的乙型肝炎病毒preS1基因的合成及其表达 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 工具酶及其它生物学试剂 |
| 1.2.方法 |
| 1.2.1 adr血清型preS1基因改造和合成 |
| 1.2.2 spreS1基因原核表达载体pET30S1的构建 |
| 1.2.3 重组蛋白His6preS1的表达 |
| 1.2.4 重组蛋白His6preS1的纯化 |
| 1.2.5 重组蛋白His6preS1的抗原性分析 |
| 2 结果和讨论 |
| 2.1 利用大肠杆菌密码子偏爱性进行preS1基因的人工合成 |
| 2.2 原核表达载体pET30S1的构建 |
| 2.3 preS1蛋白的表达与纯化 |
| 2.4 重组蛋白的抗原性 |
| 3.小结 |
| 参考文献: |
| 第二章 新型乙肝抗原基因SS1在水稻种子中的特异表达及免疫原性研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 植物材料 |
| 1.1.3 工具酶及生物学试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 水稻基因组DNA的分离 |
| 1.2.2 表达载体构建 |
| 1.2.2.1 GluB-4启动子和GluB-1信号肽编码核苷酸融合DNA片段的克隆 |
| 1.2.2.2 新型乙肝抗原基因SS1的改造与克隆 |
| 1.2.2.3 GluB-1基因3′ UTR区克隆 |
| 1.2.2.4 植物双元表达载体p1300GSS1的构建 |
| 1.2.3 植物双元表达载体p1300GSS1的农杆菌EHA105的转化 |
| 1.2.3.1 农杆菌EHA105电击感受态细胞的制备 |
| 1.2.3.2 电击法转化 |
| 1.2.3.3 阳性克隆的鉴定 |
| 1.2.4 水稻愈伤的遗传转化 |
| 1.2.4.1 培养基组成 |
| 1.2.4.2 水稻愈伤的准备 |
| 1.2.4.3 农杆菌感染 |
| 1.2.5 转基因植株的鉴定 |
| 1.2.6 转基因植株的southern blotting分析 |
| 1.2.7 转基因植株的RNA dot blotting分析 |
| 1.2.7.1 Trizol法提取植物总RNA |
| 1.2.7.2 点膜 |
| 1.2.8 Western blot分析 |
| 1.2.8.1 膜转移Western blot分析 |
| 1.2.8.2 In Situ Western Blotting Hybridization分析 |
| 1.2.9 重组蛋白的表达水平的初步分析 |
| 1.2.9.1 蛋白浓度的标准曲线的绘制及成熟种子总可溶蛋白浓度的测定 |
| 1.2.9.2 重组蛋白的表达水平测定 |
| 1.2.10 重组蛋白的特征分析 |
| 1.2.10.1 CsCl等密度梯度离心 |
| 1.2.10.2 免疫电镜观察 |
| 1.2.11 重组蛋白的对小鼠的免疫原性分析 |
| 1.2.11.1 动物免疫试验 |
| 1.2.11.2 免疫小鼠的抗血清分析 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 水稻胚乳特异性表达载体的构建 |
| 2.2 水稻的遗传转化 |
| 2.3 转化植株的筛选 |
| 2.4 转基因植株的southern blotting和RNA dot blotting分析 |
| 2.5 SS1蛋白在转基因水稻种子中表达量分析 |
| 2.6 转基因水稻种子中表达量的SS1蛋白抗原性分析 |
| 2.7 转基因水稻种子中表达量的SS1蛋白理化特性分析 |
| 2.8 转基因水稻种子中表达量的SS1蛋白的动物免疫原性分析 |
| 3.小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 新型乙肝抗原基因SS1在烟草叶绿体中的表达及抗原性分析 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.1.3.工具酶及生物学试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 烟草叶绿体表达载体构建 |
| 1.2.1.1 筛选标记基因aadA的启动子的克隆 |
| 1.2.1.2 表达载体的整合 |
| 1.2.1.3 新型乙肝抗原基因SS1的改造与克隆 |
| 1.2.2 基因枪转化 |
| 1.2.2.1 烟草无菌苗的培养和继代 |
| 1.2.2.2 烟草受体细胞的准备 |
| 1.2.2.3 微粒子弹(DNA coated microprojectiles)的制备 |
| 1.2.2.4 装备基因枪 |
| 1.2.2.5 轰击 |
| 1.2.3 转化抗性植株的获得及同质化筛选 |
| 1.2.3.1 过渡培养 |
| 1.2.3.2 抗性筛选培养 |
| 1.2.3.3 同质化筛选 |
| 1.2.4 转基因植株的鉴定 |
| 1.2.4.1 烟草叶绿体DNA提取(高离子强度低pH法) |
| 1.2.4.2 转基因植株的PCR鉴定 |
| 1.2.5 转基因植株的同质化分析 |
| 1.2.5.1 利用实时荧光定量PCR对T0代植株进行同质化分析 |
| 1.2.5.2 利用semi-quantitive PCR进行同质化程度分析 |
| 1.2.5.3 利用复合PCR进行同质化的鉴定 |
| 1.2.6 Northern blot分析 |
| 1.2.6.1 Trizol法提取植物总RNA |
| 1.2.6.2 转膜 |
| 1.2.6.3 杂交和显影(参照上一章) |
| 1.2.7 蛋白质分析 |
| 1.2.7.1 蛋白的提取 |
| 1.2.7.2 蛋白浓度的标准曲线的绘制和总可溶蛋白浓度的测定 |
| 1.2.7.3 表达重组蛋白的相对表达水平测定 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2 基因枪转化和同质化植株的获得 |
| 2.3 转基因植株的鉴定 |
| 2.4 转基因植株的同质化的鉴定 |
| 2.5 外源基因的转录分析 |
| 2.6 外源基因的表达分析 |
| 3.小结 |
| 参考文献: |
| 结论与展望 |
| 附 免疫佐剂分子霍乱毒素B亚单位(CTB)在大肠杆菌中的表达及分析 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 工具酶及其它生物学试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 古典型霍乱弧菌基因组DNA的制备 |
| 1.2.2 CTB基因的克隆 |
| 1.2.3 CTB基因原核表达载体构建 |
| 1.2.4 CTB基因的诱导表达 |
| 1.2.5 CTB表达的包涵体蛋白纯化 |
| 1.2.6 CTB蛋白的Western blotting检测 |
| 1.2.7 CTB的体外生物活性分析 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 CTB基因的克隆与序列分析 |
| 2.2 CTB基因原核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3 CTB基因的诱导表达与包函体的纯化 |
| 2.4 CTB重组蛋白的Western印迹检测 |
| 2.5 CTB蛋白体外生物活性检测 |
| 3.小结 |
| 参考文献: |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（8）乙型肝炎病毒DNA聚合酶功能域结合蛋白和反式调节基因的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 正文 |
| 第一部分 基因表达谱芯片技术筛选HBV DNA聚合酶三个功能域反式调节基因 |
| 引言 |
| 第一章 HBV DNA聚合酶TP反式调节基因的筛选研究 |
| 第二章 HBV DNA聚合酶PR反式调节基因的筛选研究 |
| 第三章 HBV DNA聚合酶RNase H反式调节基因的筛选研究 |
| 讨论 |
| 第二部分 HBV DNA聚合酶功能域蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建与表达 |
| 引言 |
| 第一章 HBV DNA聚合酶TP蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建与表达 |
| 第二章 HBV DNA聚合酶PR蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建与表达 |
| 第三章 HBV DNA聚合酶酶RNase H蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建与表达 |
| 讨论 |
| 第三部分 酵母双杂交筛选与TP蛋白相互作用蛋白 |
| 引言 |
| 第一节 酵母配合筛选 |
| 第二节 从阳性酵母中提取质粒 |
| 第三节 复杂方法冰冻高效价感受态方案 |
| 讨论 |
| 总结及展望 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 文献综述一 |
| 文献综述二 |
| 附录一 主要仪器设备 |
| 附录二 英文缩略词 |
| 致谢 |
（9）甲、乙型肝炎口服二价DNA疫苗的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 甲、乙型肝炎疫苗研究进展 |
| 1 甲型肝炎疫苗的研究进展 |
| 2 乙型肝炎疫苗的研究进展 |
| 3 甲、乙型肝炎联合疫苗研究进展 |
| 第二章 载体—宿主平衡致死系统减毒沙门氏菌口服疫苗的研究 |
| 1 沙门氏菌减毒的相关基因 |
| 2 载体疫苗常用的质粒和启动子 |
| 3 载体减毒沙门氏菌表达系统的构建 |
| 4 沙门氏菌进入机体免疫系统的机制 |
| 5 减毒沙门氏菌传递外源抗原基因诱导宿主免疫应答的可能机理 |
| 6 减毒沙门氏菌载体疫苗的优越性 |
| 7 携带DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌的应用及前景 |
| 第三章 DNA 疫苗基因佐剂研究进展 |
| 1 细胞因子佐剂作为DNA疫苗免疫调节剂 |
| 2 CpG 基序佐剂作为DNA 疫苗免疫调节剂 |
| 3 趋化性细胞因子和共刺激分子基因作为 DNA 疫苗的免疫调节剂 |
| 4 抗原定向来提高 DNA 疫苗的免疫效果 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章HBV/HAV 融合抗原基因在毕赤酵母细胞中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 HBV/HAV 融合抗原基因真核表达载体构建及转化减毒沙门氏菌 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 HBV/HAV融合抗原基因在CHO细胞中表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 减毒沙门氏菌为载体的HBV/HAV二价DNA疫苗免疫小鼠的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 减毒沙门氏菌为载体的HBV/HAV二价DNA 疫苗与IL-18 共免疫小鼠的研 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的主要论文 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
（10）科学研究的设计和方法中的科学性（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 研究基因转录水平主要考虑的是启动子的转录活性 |
| 2 肝炎病毒准种特点是一个不能忽视的问题 |
| 3结合蛋白和受体的区别 |
四、乙型肝炎病毒X基因酵母表达载体构建及表达（论文参考文献）
- [1]一种内毒素合成途径抑制的整合表达型大肠杆菌菌株的构建及应用[D]. 王凯航. 厦门大学, 2019(08)
- [2]快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究[D]. 周兵. 厦门大学, 2018(06)
- [3]乙型肝炎病毒X基因整合/X蛋白与肝癌发生关系的研究[D]. 张烜. 南开大学, 2010(07)
- [4]DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用[D]. 陈宗艳. 四川农业大学, 2008(01)
- [5]HBsAg真核表达载体的构建及在CHO细胞高效表达的研究[D]. 张艳. 吉林大学, 2008(11)
- [6]乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究[D]. 田江克. 中国人民解放军军事医学科学院, 2007(04)
- [7]乙型肝炎新型植物口服疫苗的研究[D]. 钱炳俊. 复旦大学, 2007(07)
- [8]乙型肝炎病毒DNA聚合酶功能域结合蛋白和反式调节基因的研究[D]. 陈国凤. 中国人民解放军军医进修学院, 2005(06)
- [9]甲、乙型肝炎口服二价DNA疫苗的研究[D]. 万家余. 吉林大学, 2005(06)
- [10]科学研究的设计和方法中的科学性[J]. 成军. 世界华人消化杂志, 2004(07)