一、应用抑制性消减杂交技术从斑秃脱发区毛乳头中克隆出一条自身抗原基因（论文文献综述）
宋志强,阎衡,李春兰,郝飞,钟白玉[1]（2006）在《休止期毛乳头细胞差异表达基因的分析》文中研究表明目的筛选休止期毛乳头细胞差异表达基因,探讨脱发机制。方法从同一斑秃患者头皮获得脱发区和非脱发区毛乳头,应用SMARTcDNA和抑制性消减杂交建立消减文库,对部分克隆进行杂交筛选、测序及同源性检索分析。结果成功构建了休止期（斑秃脱发区）毛乳头cDNA消减文库,代表毛乳头在休止期表达上调的基因,测序发现1条与甲状腺相关的自身抗原基因,还发现脱发区毛乳头差异表达与抑制性信号转导途径有关的基因。这些基因多是首次发现在毛囊中有表达。结论斑秃毛乳头可能由于表达自身抗原基因而导致针对其的自身免疫反应的启动,后者通过多种信号转导途径影响毛乳头的生长和功能发挥。
张万坡[2]（2006）在《禽流感病毒感染鸡的病毒定位及基因差异表达研究》文中指出禽流感（Avian Influenza，AI）是由A型流感病毒（Avian Influenza virus，AIV）引起的一种禽类的感染和／或疾病综合征。近年来，AI的流行愈演愈烈，特别是2003年至今，该病已经从亚洲蔓延到欧洲和非洲。自1997年香港AIV感染人事件以来，已有近百人被发现死于AIV感染，而且仍不断有新病例出现。科学家们预测AI的流行可能会再次引发人类流感的大暴发。目前对AI的研究热点集中在病毒基因的克隆、病毒的检测方法研究、疫苗的研制等方面，而针对AI的基础研究的报道不多，且研究方向大多为AIV对人的影响。迄今为止，关于AIV对天然宿主鸡致病机制的研究，仍停滞在组织和细胞水平。对AIV感染过程中宿主的应答机制，感染后引起动物快速死亡的分子机制，宿主细胞蛋白和病毒蛋白之间的相互作用及其意义，以及不同毒力AIV在宿主体内的分布规律等方面的研究并不多见。弄清AIV对鸡的致病机制，不仅有助于防制动物的AIV感染，而且对研究AIV对人的感染机制也有重要的参考意义。为进一步研究AIV的致病机制，作者对AIV抗原在鸡体内的分布规律，AIV感染过程中鸡的基因差异表达，以及宿主蛋白和病毒蛋白之间的相互作用等进行了研究。主要工作和研究结果如下：1 原位杂交检测禽流感病毒方法的建立 以A／V感染MDCK培养细胞，建立了感染模型。通过RT-PCR扩增大小为543bp的病毒核蛋白（NP）基因的保守片段，经地高辛标记，制备NP基因核酸探针，建立了AIV的细胞原位杂交检测方法。通过对原位杂交条件的优化，使该检测方法具有了良好的特异性、敏感性和可重复性。该方法的建立为AIV的精确定位和研究其致病机制提供了较好的选择。2 禽流感病毒感染鸡的病毒定位 以低致病性AIV感染鸡，建立病理模型，取各器官组织制备石蜡切片。利用原位杂交检测AIV，研究病毒在组织内的分布。结果显示，AIV在感染鸡以后，病毒抗原主要分布于肠上皮细胞、喉和气管软骨细胞的基质以及肺泡壁上皮细胞内，而且只能在感染初期检测到病毒核酸，其他的内脏器官内则始终检测不到病毒核酸。试验表明，低致病性AIV只能存在于实质器官以外的器官组织，并很快被宿主清除。AIV抗原在喉和气管软骨细胞的基质内的出现，是本试验的一个新发现，这可能是病毒躲避宿主免疫的一种手段。3 鸡对禽流感病毒感染应答基因的筛选与鉴定 通过高致病性AIV感染鸡，建立了试验动物模型。利用抑制性差减杂交技术，成功构建了AIV感染过程中鸡的肾脏组织双向差减cDNA文库。通过PCR和斑点杂交，从文库中筛选出271个差异克隆，经序列测定共获得205个差异表达EST。
张轶文,王少元[3]（2005）在《抑制性消减杂交筛选疾病相关基因的研究进展》文中研究说明
朱培成[4]（2005）在《斑秃患者PBMC中Th1/Th2型细胞因子、转录因子T-bet mRNA表达状况及中药对其调节作用》文中研究表明目的 探讨肝肾不足型斑秃患者外周血单一核细胞（PBMC）中Th1/Th2型细胞因子、转录因子T-bet mRNA表达状况与斑秃中医证型及发病的关系;中药原花青素（PC）、黄芪多糖（APS）对斑秃患者PBMC中Th1/Th2型细胞因子、T-bet基因表达的调节作用。 方法 用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测8例轻型斑秃、12例重型斑秃患者及10例正常人经PHA刺激后PBMC中Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-12）、Th2型细胞因子IL-10及转录因子T-bet mRNA的表达水平;同时还检测经PC、APS分别与PHA共同刺激斑秃患者PBMC后Th1/Th2型细胞因子、转录因子T-bet mRNA表达水平的改变情况。 结果 经PHA刺激后轻型斑秃患者PBMC中Tb1型细胞因子（IFN-γ、IL-12）基因表达水平轻度升高,与正常对照比较无显着性差异（P>0.05）;Th2型细胞因子（IL-10）基因表达下降,显着低于正常对照组（P<0.05）;而转录因子T-betmRNA表达水平明显升高,显着高于正常对照组（P<0.05）。经PHA刺激后重型斑秃患者PBMC中Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-12）及转录因子T-bet基因表达不仅显着高于正常对照组（P<0.01）,而且还高于轻型斑秃病人（P<0.05）;Th2型细胞因子（IL-10）基因表达显着低于正常对照组（P<0.05）,与轻型斑秃病人比较无显着性差异。PC、APS分别与PHA共同刺激斑秃患者PBMC后可抑制Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-12）及转录因子T-bet基因表达,逆转斑秃病人Th1型反应。相关性分析表明:转录因子T-bet与IFN-γ呈高度正相关（R=0.806,P<0.001）;转录因子T-bet与IL-12呈高度
张轶文[5]（2005）在《家族性急性髓系白血病cDNA消减文库的构建和差异表达基因的克隆、筛选及序列分析》文中认为白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤。白血病的发生是一个涉及多基因、多阶段的复杂过程,因此,全面分离与分析参与白血病发生的生物活性物质,揭示这些生物活性物质的功能与途径,对于系统研究与阐明白血病发生的分子机制尤为重要。遗传家系为我们提供了很好的样本来源,是获得疾病相关致病基因的一条重要途径。【目的】分离家族性急性髓系白血病患者骨髓中差异表达的基因,在基因水平上探讨急性白血病发生发展的分子机制。【方法】采用Super SMART和SSH 技术,以患者骨髓作为Tester,正常人骨髓作为Driver,分离患者骨髓细胞中差异表达的基因片段;连接T 载体,转化宿主菌,构建家族性急性髓系白血病cDNA 抑制性消减文库;采用DIG 标记探针的改良Differential Screening技术进行筛选和鉴定;阳性克隆送交测序,BLAST 同源性比对分析,新基因片段提交GenBank。【结果】成功构建了家族性急性髓系白血病cDNA 抑制性消减文库,巢式PCR 进一步使差异表达基因得到了指数扩增。产物连接载体并成功转化TOPO10F’大肠杆菌感受态细胞,使文库中的差异表达基因得到分离。经Differential Screening 技术筛选鉴定,确认28 个基因为阳性差异表达基因。测序结果提交GenBank 进行同源性比对分析,其中17 条与已知基因同源,11 条为未知基因片段。【结论】1. SSH 技术是筛选差异表达基因的有效方法。2. 采用DIG 标记探针替代同位素P32-dCTP 标记探针,除继承了其高度灵敏度和良好的特异性之外,还避免了放射性污染,简化了实验操作。3. 获得多个与细胞增殖和分化相关的基因,说明急性白血病的发生是一个涉及多基因、多阶段发生的复杂过程。4. 获得11 条在文库中差异表达的新基因EST 片段,并被GenBank 收录,登录号分别为CX129926-7,CV884199,CV884202-3,CV973096-101。
冷怀明[6]（2004）在《第三军医大学学报 2004年第26卷总目次》文中认为
杨希川[7]（2004）在《毛囊生长期毛乳头细胞差异表达基因文库的构建及筛选》文中研究说明毛囊有许多有益的生物学功能,具有重要的心理社会学作用,脱发或多毛症会给患者带来沉重的精神负担甚至心理障碍。对毛囊生物学及病理学的深入研究对今后建立毛发疾病治疗的新方法具有指导意义。毛囊周期性进行以下阶段:器官生长和毛干形成（生长期）、器官退化（退行期）和相对的静止状态（休止期）。毛囊高度发育的特性,特别是它所具有的周期生长能力,引起生物学专家的浓厚兴趣,毛囊的生长周期是凋亡和分化、毛囊周围蛋白水解和基质重建以及毛囊黑素合成高度协调的结果。毛囊上皮细胞与间质细胞即毛囊角质形成细胞与毛乳头细胞的相互作用调控着其生长周期。毛囊从休止期向生长期转换时,毛囊隆突部的干细胞在毛乳头细胞的作用下被激活增殖,此过程是一个独特的器官再生现象。 目前对生长期毛囊的研究主要集中在细胞因子、化学介质和炎性细胞浸润等方面,而对毛囊生长期基因的表达变化所知甚少。因为每个毛囊都有自己固有的生长节律,其生长周期是非同步的,所以研究毛囊周期的主要障碍是缺乏三个生长阶段的模型,特别是其生长期和休止期。许多证据表明斑秃是研究毛发生长周期的理想模型,斑秃的最早临床表现为休止期脱发,呈局限性离心性向外发展。Eckert 等认为斑秃发病过程是生长期毛囊成批的提前进入休止期造成的,在已形成的秃发斑中主要是休止期毛囊,说明毛囊向生长期发展的过程受到阻碍。因此,可将非斑秃区和斑秃区毛囊分别作为生长期和休止期毛囊模型,研究毛囊生长期的基因调控机制。通过对许多生物学过程中基因表达水平变化的研究,可有效揭示此过程的遗传学本质。检测正常组织和异常组织之间差异表达基因的方法有许多种,如差异显示技术（DD）、表达序列标签法（EST）、消减杂交法和基因表达的系列分析（SAGE）,最近建立的微阵列技术更是引起人们浓厚兴趣,在人类疾病状态的研究中仍有很高应用前景。尽管如此,这些方法过程繁琐,需要昂贵的设备,而且需要大量mRNA,临床标本尤其是毛囊由于取材量少很难达到要求。 国家自然科学基金资助课题（编号30200249）及重庆市科委重点攻关课题（编号2001-8-4）<WP=12>最近的研究表明,在种类上,稀有mRNA（在细胞中少于5个拷贝）在整个转录子中占大多数,但在量上只占总转录子的一小部份,而少数高表达的基因是总转录子的主要组成部份。需要强调的是即使低表达丰度的基因也同样具有重要的生物学功能。一般认为在一个细胞中有大约2万个基因表达,应用SAGE或高密度微阵列的研究表明,在肿瘤与正常组织表达丰度变化超过10倍的基因只占mRNA种类的0.5～2% 。 本研究中,采用SMART cDNA合成技术合成的两组cDNA电泳条带非常相似,也说明两种状态的细胞mRNA差异非常小。抑制性消减杂交技术（uppression subtractive hybridization, SSH）可高度敏感的检测到低丰度的差异表达基因,因为它具有正常化（normalization）的作用,通过两次削减杂交和两次抑制性PCR使每种cDNA的量相对平衡,这样就避免了对高丰度基因的优先筛选,因此相对于传统的筛选方法可高度敏感的筛选低表达的基因,而且通过SSH还有可能发现新基因,同时SSH具有更强的可操作性,在很大程度上克服了假阳性高、工作量大的缺点。另外大量研究表明,采用SMARTTM cDNA 合成技术可从少量的RNA合成完整的cDNA文库,明显优于普通的RT-PCR。毛乳头细胞位于毛囊底部,它在毛囊形成、毛发生长和毛发周期转换中起关键作用。从Oliver的研究开始,毛乳头所固有的诱导毛囊形成的特性得到了多次证明。即使将体外培养的毛乳头细胞移植入正常皮肤,仍然具有诱导毛发生长作用。我们已建立了高效简便分离毛乳头细胞的方法,并用于毛发生长研究,为了进一步阐明毛发周期调控的分子机制,我们以斑秃作为模型,采用抑制性消减杂交技术及SMART cDNA合成技术筛选生长毛囊期毛乳头细胞的差异表达基因。由于Northern印迹需要大量的mRNA,不适用于小量的临床标本,所以本实验用反向Northern替代了Northern印迹,对所筛选的差异表达基因进行验证,此方法的特异性与Northern杂交接近,敏感性高于标准的Northern杂交。本实验的主要研究结果如下:（1）两步酶消化法是一种快速、简单、经济的分离培养毛乳头细胞的方法。我们针对斑秃区生长期毛囊及秃发区休止期毛囊的不同特点,对分离方法作了相应的改进,成功的分离到高纯度的生长期及休止期毛囊的毛乳头。（2）毛乳头细胞在毛囊周期中起关键作用,其基因表达水平的变化可能在毛发生长周期中起着重要作用。本研究中为了从斑秃的临床标本中筛选差异表达基因,我们以斑秃为模型,采用SSH和SMART cDNA 合成技术成功的建立了毛囊生长期毛乳头细胞差异表达基因文库。尽管在以往很多研究中采用SSH成功地从其它组织不同的病理状态下分离出了差异表达的基因,但本实验是第一次研究生长期毛乳头细胞基因表达变化。<WP=13>（3）通过测序和BLAST同源性搜索,共找到42个在生长期毛乳头细胞高表达的基因。这些克隆可分为:功能已知基因和功能未知基因。大多数功能已知基因按功能属于核酸合成、细胞周期和生长调节、蛋白合成、能量代谢、细胞角蛋白和染色体结构调节等相关的基因,其中包括17-β羟基类固醇脱氢酶、Dermatopontin、属于金属蛋白酶家族的ADAMTS4、?
宋志强,郝飞,杨希川,钟白玉,杨卫兵,叶庆佾[8]（2004）在《应用抑制性消减杂交技术从斑秃脱发区毛乳头中克隆出一条自身抗原基因》文中提出目的 寻找斑秃脱发区毛乳头中特异表达的基因片段 ,探讨斑秃发病机制。方法 应用抑制性消减杂交构建斑秃脱发区毛乳头差异表达基因的cDNA文库 ,并通过PCR筛选、杂交验证和同源性检索对差异表达基因进行分析。结果 成功建立了高消减效率的斑秃脱发区毛乳头cDNA消减文库 ,并克隆到一条斑秃毛乳头特异表达的基因片段DP3（ 3 0 7bp） ,应用cDNA斑点杂交及Northern杂交证实它仅在脱发区毛乳头特异表达 ,同源性检索其为一条甲状腺相关的自身抗原基因。结论 DP3在斑秃脱发区毛乳头的特异表达提示其可能参与斑秃的发病过程 ,它的克隆为斑秃发病机制的自身免疫学说进一步提供了实验依据
宋志强,郝飞[9]（2002）在《毛乳头细胞生长相关基因的筛选》文中认为
宋志强,郝飞,钟白玉,向明明,刁庆春,刘荣卿[10]（2002）在《应用抑制性消减杂交技术筛选和克隆斑秃脱发相关基因》文中进行了进一步梳理目的筛选和克隆斑秃脱发相关基因。方法分别分离斑秃脱发区和非脱发区毛乳头后,应用抑制性消减杂交比较脱发区和非脱发区毛乳头基因表达的差异,对脱发区毛乳头特异表达的基因进行克隆、测序和同源性分析。结果建立了斑秃脱发区毛乳头cDNA消减文库,并成功地克隆到一条斑秃毛乳头特异表达的基因片段,同源性检索证实其为一条自身抗原基因。结论所建立的消减文库可能含有斑秃发病相关基因,所克隆的到自身抗原基因在斑秃发病中的作用值得进一步研究。
二、应用抑制性消减杂交技术从斑秃脱发区毛乳头中克隆出一条自身抗原基因（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用抑制性消减杂交技术从斑秃脱发区毛乳头中克隆出一条自身抗原基因（论文提纲范文）
（1）休止期毛乳头细胞差异表达基因的分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.1.1 临床标本 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 主要方法 |
| 1.2.1 毛乳头细胞的分离 |
| 1.2.2 总RNA的提取 |
| 1.2.3 双链cDNA的合成 |
| 1.2.4 抑制性消减杂交 |
| 1.2.5 插入片段的斑点杂交 |
| 1.2.6 序列测定和同源性析 |
| 2 结果 |
| 2.1 毛乳头的分离 |
| 2.2 总RNA的定性定量分析 |
| 2.3 消减cDNA文库的构建和筛选结果 |
| 2.4 斑秃脱发区毛乳头差异表达基因cDNA文库的构建及初步筛选 |
| 2.5 斑秃脱发区毛乳头差异表达基因的验证 |
| 2.6 DNA测序结果与同源性检索分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 斑秃休止期毛乳头差异表达基因分析 |
| 3.2 从差异表达基因看斑秃的发病机制 |
| 3.3 毛乳头细胞非凝集性生长与疾病/脱发状态下基因表达关系 |
（2）禽流感病毒感染鸡的病毒定位及基因差异表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 禽流感和禽流感病毒研究进展 |
| 1.1 禽流感的流行和危害 |
| 1.1.1 国外禽流感的流行现状 |
| 1.1.2 国内禽流感的流行现状 |
| 1.1.3 禽流感的危害 |
| 1.2 禽流感病毒及其特性 |
| 1.2.1 禽流感病毒的形态和结构 |
| 1.2.2 禽流感病毒的理化特性 |
| 1.2.3 禽流感病毒的复制 |
| 1.2.4 禽流感病毒的宿主特异性 |
| 1.2.5 禽流感病毒的免疫原性 |
| 1.3 禽流感病毒的分子生物学 |
| 1.3.1 病毒基因编码蛋白的结构和功能 |
| 1.3.2 禽流感病毒的分子进化 |
| 1.3.3 禽流感病毒宿主间跨越的分子基础 |
| 1.4 禽流感的检测方法 |
| 1.4.1 病毒的分离鉴定 |
| 1.4.2 凝(HA)和血凝抑制(HI)试验 |
| 1.4.3 神经氨酸酶抑制试验(NIT) |
| 1.4.4 琼脂凝胶扩散试验(AGID) |
| 1.4.5 病毒中和试验(NT) |
| 1.4.6 免疫荧光技术(IFT) |
| 1.4.7 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.4.8 分子生物学诊断技术 |
| 1.5 禽流感病毒的致病机制 |
| 1.5.1 禽流感病毒的毒力 |
| 1.5.2 禽流感病毒与细胞凋亡 |
| 2 动物的抗病毒机制 |
| 2.1 抗病毒的特异性免疫应答 |
| 2.2 非特异性免疫细胞 |
| 2.3 干扰素抗病毒机制 |
| 2.3.1 干扰素的种类和特性 |
| 2.3.2 干扰素抗病毒的分子机制 |
| 2.3.3 IFN刺激基因的诱导和调控 |
| 2.3.4 IFN诱导ISG的途径 |
| 2.3.5 IFN诱导的抗病毒蛋白 |
| 3 流感病毒感染过程中宿主的应答基因 |
| 4 差异表达基因的筛选方法及其应用 |
| 4.1 差异表达基因的筛选方法 |
| 4.1.1 消减杂交法 |
| 4.1.2 mRNA差异显示 |
| 4.1.3 代表性差别分析法 |
| 4.1.4 抑制性差减杂交 |
| 4.2 抑制性差减杂交技术在筛选疾病相关基因中的应用 |
| 5 本研究的目的、意义和试验总体设计 |
| 第二章 禽流感病毒原位杂交检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 病毒 |
| 1.4 细胞 |
| 1.5 核酸探针的制备 |
| 1.5.1 引物设计合成 |
| 1.5.2 禽流感病毒RNA提取 |
| 1.5.3 RT-PCR扩增NP基因片段 |
| 1.5.4 DNA片段的回收 |
| 1.5.5 地高辛标记NP基因片段 |
| 1.5.6 探针标记效率与灵敏度测定 |
| 1.5.7 探针特异性鉴定 |
| 1.6 细胞涂片的制备 |
| 1.6.1 细胞培养与病毒感染 |
| 1.6.2 载玻片的准备 |
| 1.6.3 细胞收集与涂片 |
| 1.6.4 细胞接毒后病毒检测 |
| 1.7 原位杂交 |
| 1.7.1 细胞的固定 |
| 1.7.2 蛋白酶K消化 |
| 1.7.3 DNA酶消化 |
| 1.7.4 原位杂交 |
| 1.8 原位杂交方法的重复性试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 禽流感病毒NP基因片段的RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 地高辛标记效率与灵敏度检测结果 |
| 2.3 探针特异性检验 |
| 2.4 MDCK细胞接毒后的检测 |
| 2.5 禽流感病毒的细胞内原位杂交检测 |
| 2.6 原位杂交方法的重复性试验 |
| 3 讨论 |
| 3.1 禽流感病毒原位杂交检测方法的建立及其意义 |
| 3.2 原位杂交方法的影响因素 |
| 3.2.1 原位杂交标本的固定 |
| 3.2.2 原位杂交标本组织的通透性处理 |
| 3.2.3 原位杂交的探针制备 |
| 4 小结 |
| 第三章 禽流感病毒感染鸡的病毒定位 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 病毒 |
| 1.4 试验动物 |
| 1.5 病毒增殖 |
| 1.6 病毒半数感染量的测定 |
| 1.7 动物感染试验 |
| 1.8 组织样品的采集与固定 |
| 1.9 石蜡组织切片的制备 |
| 1.9.1 载玻片和盖玻片的处理 |
| 1.9.2 组织包埋 |
| 1.9.3 组织切片的制备 |
| 1.10 禽流感病毒NP基因核酸探针的制备 |
| 1.11 原位杂交 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 禽流感病毒感染后的鸡的临床症状及剖检变化 |
| 2.2 原位杂交结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 鸡对禽流感病毒感染应答基因的筛选与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 病毒 |
| 1.5 动物饲养与病毒感染 |
| 1.6 试验组织样本的采集 |
| 1.7 组织总RNA的提取 |
| 1.8 mRNA的分离 |
| 1.9 SMART cDNA的合成 |
| 1.10 差减cDNA文库构建 |
| 1.10.1 Driver和Tester cDNA的制备 |
| 1.10.2 差减杂交 |
| 1.10.3 PCR扩增 |
| 1.10.4 Tester cDNA的接头连接效率和文库差减效率的检测 |
| 1.10.5 差减cDNA质粒文库的构建 |
| 1.11 差减cDNA克隆的筛选 |
| 1.11.1 PCR筛选 |
| 1.11.2 斑点杂交筛选 |
| 1.12 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析 |
| 1.13 RT-PCR检验差异表达基因 |
| 1.13.1 差异表达基因引物的设计与合成 |
| 1.13.2 RT-PCR检验 |
| 1.14 Northern杂交检验差异表达基因 |
| 1.14.1 探针标记 |
| 1.14.2 甲醛变性电泳分离RNA |
| 1.14.3 转膜 |
| 1.14.4 杂交 |
| 1.15 ISG12和LY6E基因在禽流感病毒感染鸡不同组织中的表达分析 |
| 1.16 ISG12和LY6E基因克隆及序列分析 |
| 1.16.1 ISG12和LY6E基因克隆 |
| 1.15.2 ISG12和LY6E基因序列的分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 组织总RNA的提取 |
| 2.2 mRNA的分离 |
| 2.3 Driver cDNA和Tester cDNA的制备 |
| 2.4 鸡对禽流感病毒感染应答基因差减cDNA文库的构建 |
| 2.5 差减cDNA文库的差减效率检测 |
| 2.6 差减cDNA克隆的筛选 |
| 2.6.1 PCR筛选 |
| 2.6.2 斑点杂交筛选 |
| 2.7 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析 |
| 2.8 差异表达基因的RT-PCR检验和Northern杂交检测 |
| 2.9 Northern杂交检验ISG12和LY6E基因在鸡的不同组织中的表达 |
| 2.10 鸡ISG12和Lv6E基因克隆及序列分析 |
| 2.10.1 鸡ISG12基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的分析 |
| 2.10.2 鸡ISG12蛋白分子进化树分析 |
| 2.10.3 鸡LY6E基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的分析 |
| 2.10.4 鸡LY6E蛋白分子进化树分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鸡禽流感病毒感染应答基因的筛选鉴定及其意义 |
| 3.1.1 ISG12基因 |
| 3.1.2 LY6E基因 |
| 3.1.3 溶菌酶基因 |
| 3.1.4 基质Gla蛋白基因 |
| 3.1.5 谷光苷肽转移酶基因 |
| 3.1.6 葡萄糖6磷酸酶催化亚基基因 |
| 3.1.7 酒精脱氢酶基因 |
| 3.1.8 突触结合蛋白基因 |
| 3.1.9 钠／二羧酸转运蛋白基因 |
| 3.1.10 禽流感病毒感染鸡的机制 |
| 3.2 抑制性差减杂交技术的应用 |
| 3.2.1 抑制性差减杂交技术在筛选疾病相关基因中的应用 |
| 3.2.2 应用SSH筛选鸡对禽流感病毒感染的应答基因 |
| 3.2.3 鸡对禽流感病毒感染应答基因的鉴定以及cDNA序列的完整性 |
| 3.2.4 RT-PCR分析宿主应答基因的表达 |
| 4 小结 |
| 第五章 禽流感病毒NS1蛋白与鸡差异表达蛋白间的相互作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 质粒 |
| 1.3.1 pBT质粒 |
| 1.3.2 pTRG质粒 |
| 1.3.3 对照质粒 |
| 1.4 重组诱饵质粒的构建 |
| 1.4.1 NS1基因的克隆 |
| 1.4.2 插入片段的准备 |
| 1.4.3 诱饵质粒和插入片段的连接和转化 |
| 1.4.4 阳性转化子的验证 |
| 1.4.5 NS1蛋白和λ噬菌体阻遏蛋白λcI融合蛋白的诱导表达 |
| 1.5 重组目标质粒的构建 |
| 1.5.1 LY6E和ISG12基因的克隆 |
| 1.5.2 插入片段及目标质粒的准备 |
| 1.5.3 目标质粒和插入片段的连接与转化 |
| 1.5.4 阳性转化子的验证 |
| 1.5.5 ISG12、LY6E蛋白和RNA聚合酶a-亚基氨基末端融合蛋白的诱导表达 |
| 1.6 重组诱饵质粒和目标质粒的共转化 |
| 1.6.1 重组诱饵质粒和目标质粒的制备 |
| 1.6.2 重组诱饵质粒和目标质粒的共转化 |
| 1.6.3 阳性共转化子的鉴定 |
| 1.6.4 阳性共转化子的第一轮筛选 |
| 1.6.5 阳性共转化子第二轮筛选 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组诱饵质粒的构建 |
| 2.1.1 NS1基因的RT-PCR扩增、克隆与鉴定 |
| 2.1.2 NS1基因的序列分析 |
| 2.1.3 重组诱饵质粒的构建 |
| 2.1.4 NS1蛋白和λ噬菌体阻遏蛋白λcI融合蛋白的诱导表达 |
| 2.2 重组目标质粒的构建 |
| 2.2.1 LY6E和ISG12基因的PCR扩增及克隆 |
| 2.2.2 LY6E和ISG12基因的序列测定 |
| 2.2.3 目标质粒与LY6E、ISG12基因片段的连接与转化 |
| 2.2.4 转化子的PCR鉴定和酶切鉴定 |
| 2.2.5 ISG12、LY6E蛋白和RNA聚合酶a-亚基氨基末端融合蛋白的诱导表达 |
| 2.3 重组诱饵质粒和重组目标质粒的共转化 |
| 2.4 阳性共转化子的筛选 |
| 3 讨论 |
| 3.1 NS1蛋白和ISG12蛋白、LY6E蛋白之间的相互作用 |
| 3.2 关于细菌双杂交系统 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
（3）抑制性消减杂交筛选疾病相关基因的研究进展（论文提纲范文）
| 一、SSH技术的基本原理及过程 |
| 二、对SSH技术的评价 |
| 1.优点: |
| 2.局限性: |
| 三、SSH在筛选疾病相关基因中的应用 |
| 四、SSH技术的进展 |
（4）斑秃患者PBMC中Th1/Th2型细胞因子、转录因子T-bet mRNA表达状况及中药对其调节作用（论文提纲范文）
| 前言 |
| 第1部分 文献研究 |
| 第1章 斑秃的病因学研究进展 |
| 1.1 中医对斑秃病因病机的认识 |
| 1.2 现代医学有关斑秃病因学研究进展 |
| 第2章 斑秃治疗研究进展 |
| 2.1 现代医学治疗斑秃的研究进展 |
| 2.2 中医药治疗斑秃的研究进展 |
| 第2部分 斑秃患者PBMC中Th1／Th2型细胞因子、转录因子T-bet mRNA表达状况及中药对其调节作用 |
| 1 立题依据及研究目的 |
| 2 研究对象和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第3部分 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）家族性急性髓系白血病cDNA消减文库的构建和差异表达基因的克隆、筛选及序列分析（论文提纲范文）
| 一、论文 |
| (一) 中文摘要 |
| (二) 英文摘要 |
| (三) 前言 |
| (四) 第一部分:家族性急性髓系白血病差异表达基因消减cDNA 文库的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| (五) 第二部分:cDNA 消减文库的克隆、筛选、鉴定及序列同源性分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| (六) 结论 |
| (七) 参考文献 |
| (八) 致谢 |
| 二、文献综述 |
| (一) 正文 |
| (二) 参考文献 |
（7）毛囊生长期毛乳头细胞差异表达基因文库的构建及筛选（论文提纲范文）
| 英文缩写 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 毛囊生长期毛乳头细胞差异表达基因文库的构建及筛选 |
| 前 言 |
| 第一部分 毛乳头细胞的分离及总RNA提取 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
| 第二部分 生长期毛乳头细胞差异表达基因cDNA文库的构建 |
| 前 言 |
| 材料与方法 |
| 结 果 |
| 讨论 |
| 第三部分 毛囊生长相关基因的筛选、测序及同源性分析 |
| 前 言 |
| 材料与方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
| 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 致 谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 毛囊形态发生的基因调控研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 毛囊的分子遗传学 |
| 参考文献 |
| 文献综述三 细胞因子对毛囊形成及毛发周期的调节 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 攻读博士学位期间申请的课题 |
（8）应用抑制性消减杂交技术从斑秃脱发区毛乳头中克隆出一条自身抗原基因（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.1.1 标本 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 Biofuge |
| 1.2 主要方法 |
| 1.2.1 毛乳头细胞的分离、培养 |
| 1.2.2 细胞总RNA提取 |
| 1.3 双链cDNA合成 |
| 1.4 抑制性消减杂交 |
| 1.5 cDNA 消减文库的构建 |
| 1.6 巢式PCR验证插入片段 |
| 1.7 反向Northern blot |
| 1.8 阳性克隆的测序于同源性分析 |
| 1.9 Northern blot鉴定差异表达基因 |
| 2 结果 |
| 2.1 总RNA的定性定量分析 |
| 2.2 cDNA合成及酶切 |
| 2.3 DNA消减杂交效果 |
| 2.4 正向消减cDNA文库的构建筛选结果 |
| 2.5 斑秃脱发区毛乳头差异表达基因的验证 |
| 2.6 DNA测序结果与同源性检索分析 |
| 2.7 Northern blot杂交 |
| 3 讨论 |
四、应用抑制性消减杂交技术从斑秃脱发区毛乳头中克隆出一条自身抗原基因（论文参考文献）
- [1]休止期毛乳头细胞差异表达基因的分析[J]. 宋志强,阎衡,李春兰,郝飞,钟白玉. 第三军医大学学报, 2006(07)
- [2]禽流感病毒感染鸡的病毒定位及基因差异表达研究[D]. 张万坡. 华中农业大学, 2006(02)
- [3]抑制性消减杂交筛选疾病相关基因的研究进展[J]. 张轶文,王少元. 中华内科杂志, 2005(06)
- [4]斑秃患者PBMC中Th1/Th2型细胞因子、转录因子T-bet mRNA表达状况及中药对其调节作用[D]. 朱培成. 广州中医药大学, 2005(06)
- [5]家族性急性髓系白血病cDNA消减文库的构建和差异表达基因的克隆、筛选及序列分析[D]. 张轶文. 福建医科大学, 2005(08)
- [6]第三军医大学学报 2004年第26卷总目次[J]. 冷怀明. 第三军医大学学报, 2004(24)
- [7]毛囊生长期毛乳头细胞差异表达基因文库的构建及筛选[D]. 杨希川. 第三军医大学, 2004(01)
- [8]应用抑制性消减杂交技术从斑秃脱发区毛乳头中克隆出一条自身抗原基因[J]. 宋志强,郝飞,杨希川,钟白玉,杨卫兵,叶庆佾. 第三军医大学学报, 2004(01)
- [9]毛乳头细胞生长相关基因的筛选[J]. 宋志强,郝飞. 重庆医学, 2002(09)
- [10]应用抑制性消减杂交技术筛选和克隆斑秃脱发相关基因[J]. 宋志强,郝飞,钟白玉,向明明,刁庆春,刘荣卿. 中华皮肤科杂志, 2002(01)