一、植物中转录后基因沉默的启动、传导与抑制（论文文献综述）
向高青[1]（2021）在《葡萄霜霉菌CRN效应因子鉴定与功能分析》文中认为葡萄霜霉病是世界葡萄生产上危害最为严重的病害之一,主要使用化学药物防治,但是化学药物防治成本高并且威胁环境安全和人类健康,因此,需要开发既经济又对环境友好的新型防治策略。充分认识葡萄霜霉病发生机制和葡萄抗病/感病的机制是制定有效防治措施的必要前提。引起葡萄霜霉病的病原菌为葡萄生轴霜霉[Plasmopara viticola（Berk.&M.A.Curtis）Berl.&De Toni],属于专性活体寄生型卵菌。关于葡萄霜霉菌与寄主葡萄在分子层面如何相互作用、葡萄霜霉菌如何逃避和抑制寄主的免疫反应国内外的报道较少。卵菌在与寄主互作过程中会分泌RXLR和CRN（Crinkling and necrosis）效应因子以干扰寄主的抗病性反应,本研究根据葡萄霜霉菌菌株‘YL’基因组中35个CRN基因（PvCRN）序列的信息,成功克隆了其中27个PvCRN基因,并对它们的序列特征和毒性进行了分析和鉴定,从中筛选出毒性较强的PvCRN17,进行了深入研究。主要研究结果如下:1、PvCRN家族蛋白的N端序列较为保守,C端序列差异较大,因此PvCRN蛋白C端的结构可能决定其毒性。系统进化分析表明,27个PvCRN蛋白可分为7个分支。PvCRN基因家族存在基因复制和基因重组现象,表明PvCRN家族进化活跃。PvCRN蛋白大部分不具备典型的信号肽序列,酵母蔗糖酶分泌实验证明预测的8个PvCRN蛋白信号肽序列都具有分泌功能。亚细胞定位实验结果表明PvCRN蛋白家族在植物细胞的多个区域都有分布,预示PvCRN蛋白进入寄主细胞后有多个靶标区域和多种靶标分子。2、在本氏烟草叶片中瞬时表达克隆到的PvCRN基因,结果显示除PvCRN11外PvCRN基因都不能诱导烟草叶片发生过敏性坏死。在抗病的河岸葡萄（Vitis riparia Michx.）叶片中瞬时表达PvCRN基因,所有PvCRN都不能诱导河岸葡萄叶片发生过敏性坏死,结果与在烟草中瞬时表达的实验结果一致。抑制过敏性坏死实验结果显示,多数PvCRN蛋白（23/27）不能完全抑制INF1激发子诱导的烟草叶片过敏性坏死,15个PvCRN能够抑制Bax诱导的烟草叶片细胞程序性死亡。在烟草叶片中瞬时表达PvCRN17、PvCRN19、PvCRN20和PvCRN23能够显着增加烟草叶片对半活体寄生型卵菌辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）的敏感性。3、在葡萄霜霉菌‘YL’侵染欧洲葡萄黑比诺（V.vinifera Pinot Noir）叶片过程中,PvCRN14、PvCRN16和PvCRN17基因在接种后72 h和96 h两个时期的转录水平均较高。进一步实验发现PvCRN17可抑制部分ETI反应,并可抑制感染辣椒疫霉菌的烟草叶片H2O2的积累。转入PvCRN17基因的拟南芥植株生长发育缓慢,T2代种子无法正常成熟或萌发。以上充分说明PvCRN17是一个毒性效应因子。同时,实验发现PvCRN17的毒性依赖其细胞膜定位。4、酵母双杂交实验、双分子荧光互补实验和免疫共沉淀实验证明葡萄VAE7L1蛋白（protein ASYMMETRIC LEAVES 1/2 ENHANCER 7-Like 1）和VvNRPPⅡ-X1蛋白（Nitrogen regulatory protein P-II homolog isoform X1）为PvCRN17的靶标蛋白。烟草和拟南芥中与葡萄VAE7L1蛋白同源的Nb AE7L1和At AEL1蛋白也分别与PvCRN17互作。蛋白互作验证实验表明VAE7L1蛋白与VvCIA1和VvAE7（protein ASYMMETRIC LEAVES1/2 ENHANCER 7）分别互作,表明VAE7L1与VvAE7可能形成二聚体共同参与细胞质铁硫簇组装（CIA）过程。感病葡萄黑比诺和抗病葡萄留坝-8（V.piasezkii Liuba-8）的VAE7L1基因均受到葡萄霜霉菌侵染诱导而在某些时期上调表达。在烟草中瞬时表达VAE7L1蛋白可显着增强烟草对辣椒疫霉菌的抗病性。由此说明VAE7L1蛋白的功能与葡萄的抗病性相关。5、葡萄铁硫簇组装核心复合体成员VvMET18基因响应葡萄霜霉菌的侵染上调表达,表明VvMET18参与葡萄与葡萄霜霉菌的互作过程。同时,三个铁硫蛋白的编码基因VvABCE2（VIT＿02s0087g00770）、VvACOL-12S（VIT＿12s0059g02150）和VvACOL-19S（VIT＿19s0090g00460）都响应葡萄霜霉菌侵染的诱导而发生上调表达。其中,VvABCE2和VvACOL-19S分别在烟草叶片中瞬时表达都增强了烟草叶片对辣椒疫霉菌的抗性。这些结果表明葡萄部分铁硫蛋白在葡萄的抗病过程中可能发挥重要作用。6、PvCRN17与VvAE7蛋白互作,然而不与VvCIA1直接互作。竞争Co-IP实验表明PvCRN17与VvCIA1竞争结合VAE7L1和VvAE7,暗示PvCRN17可能干扰铁硫簇组装核心复合体的形成。另外,PvCRN17与VAE7L1蛋白共定位在植物细胞膜。由此推测,PvCRN17进入葡萄细胞后,可能通过与VCIA1竞争结合VAE7L1和VAE7,破坏细胞质铁硫簇组装核心复合体的完整性,影响下游铁硫蛋白的组装成熟,最终抑制葡萄铁硫蛋白介导的抗病反应。
崔维军[2]（2021）在《水稻条纹病毒调控寄主Ferredoxin 1基因表达的机制研究》文中研究指明水稻条纹叶枯病是由水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）侵染引起的一种重要的病毒病害。RSV侵染寄主后造成严重症状,甚至死亡,对水稻的生产造成严重的影响。研究RSV与植物寄主之间的互作模式,挖掘植物寄主潜在的抗病基因,能够为病害防治措施的制定以及培育抗病种质资源提供理论支持,对病害的防治以及水稻生产具有重大意义。Ferredoxin 1（FD1）编码植物光合作用电子传递链中电子受体蛋白。近年来,越来越多的研究证实FD1参与到植物免疫防卫反应中。病原物的侵染往往造成FD1表达下调,但关于该过程的调控机制尚不明确。我们针对RSV调控植物FD1表达的机制开展深入研究。研究发现,水稻和本氏烟FD1基因在RSV侵染后表达下调。进一步分析表明,本氏烟FD1（NbFD1）基因的沉默导致RSV病毒量的积累,而过量表达NbFD1的本氏烟和过表达水稻FD1（Os FD1）基因的水稻对RSV表现出一定的抗性。小RNA测序分析发现,一条病毒来源的小RNA—vsi R45349能够靶向并切割NbFD1的转录本。通过RSV基因组序列及MIR319前体瞬时表达vsi R45349,均引起NbFD1转录本丰度下调约30%。降解组测序结果进一步证实,vsi R45349参与到对NbFD1转录后水平的表达调控过程。然而小RNA介导的FD1表达下调幅度达不到病毒侵染达到的FD1下调幅度,我们推测还有其他调控途径在起作用。进一步分析NbFD1启动子序列发现,启动子序列中含有2个ABA（Abscisic acid）响应元件ABRE（ABA Responsive Element）,同时RSV侵染引起本氏烟中ABA的积累。外施ABA显着降低NbFD1的转录本丰度,并抑制NbFD1启动子驱动的报告基因的转录。分析已知的参与ABA调控的转录因子,发现ABI5（ABA Insensitive 5）可能参与FD1的表达调控。深入研究表明,NbABI5沉默导致本氏烟中NbFD1表达上调,瞬时表达NbABI5则抑制NbFD1表达;在NbABI5沉默的本氏烟中,ABA对NbFD1表达的抑制作用减弱,表明NbABI5参与到NbFD1表达调控过程。酵母单杂交实验发现,NbABI5能够与NbFD1启动子序列直接结合,与ABRE元件的突变NbFD1启动子之间的结合能力减弱甚至丧失。通过双荧光素酶分析发现,NbABI5可以抑制NbFD1启动子驱动的萤火虫荧光素酶的转录,但对2个ABRE突变的启动子驱动的转录过程无影响。这些结果表明,NbABI5是ABA调控NbFD1表达过程所必需的。在水稻中,Os FD1启动子序列中含有4个ABA响应元件ABRE,RSV侵染同样引起水稻组织中ABA的含量提高了约2倍。水稻幼苗经ABA处理后,Os FD1转录本丰度下调。与本氏烟中相同,RSV侵染和ABA处理显着诱导Os ABI5s的表达,瞬时超表达Os ABI5显着抑制Os FD1启动子驱动的萤火虫荧光素酶的转录。以上结果暗示,在水稻中RSV同样通过ABA调控Os FD1的表达。综上,我们认为RSV可能从转录及转录后两个层面调控寄主FD1转录本丰度,进而抑制FD1介导的植物对RSV的抗性。
郑蔚然[3]（2020）在《中国小麦花叶病毒诱导下长链非编码RNA的表达、鉴定及作用机制研究》文中指出小麦是目前世界上分布最广、栽培面积最大的粮食作物,一旦发生严重的小麦病毒病,会引起小麦产量大幅下降。由禾谷多黏菌（Polymyxa graminis L.）传播的小麦病毒病是其中一类世界性病害。在中国,禾谷多黏菌传小麦病毒主要有中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus,CWMV）和小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）。CWMV为单链正义RNA病毒（ss RNA）,研究发现CWMV侵染可以诱导大量的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lnc RNA）发生差异表达。这些lnc RNA在病毒侵染过程中参与调控寄主的抗病途径、参与病毒的致病过程以及上述参与的作用机制,都值得我们深入研究。本文主要以模式植物——本氏烟（N.benthamiana）为研究对象,在CWMV侵染下,系统分析了植物lnc RNA的表达特征,构建了lnc RNA调控植物相关基因表达的网络图谱,阐明了Nblnc81288作为mic RNA前体调控病毒的侵染机制。本文主要研究内容分为三个部分:（1）采用高通量测序技术对CWMV侵染的样品进行了转录组测序。鉴定到4044个差异表达的m RNA,包括1642个差异表达显着的基因,其中902个基因显着上调表达,740个基因显着下调表达;616个差异表达的Lnc RNA,包括375个差异表达显着的lnc RNA,其中120个Lnc RNA显着上调,255个Lnc RNA显着下调。通过GO和KEGG富集分析发现,大量差异表达lnc RNA的潜在靶基因广泛的参与植物的各种信号通路。这些结果表明了lnc RNA可能通过影响植物的各种信号通路,参与植物-病毒的互作过程。（2）对部分差异表达lnc RNA进行鉴定与克隆,获得17个lnc RNAs。利用q RT-PCR和Northern-blotting的技术对筛选出9个lnc RNA进行时空表达模式分析,结果显示lnc RNA在植物中呈组织特异性分布。进一步分析发现沉默Nblnc61988、Nblnc13750和Nblnc91573促进CWMV的侵染,而Nblnc81288促进CWMV的侵染。说明不同的lnc RNA在病毒侵染的过程中承担不同的作用。（3）验证了Nblnc81288是Nta-mi RNA6151c的前体。CWMV的侵染可以诱导Nblnc81288的表达,从而使得Nta-mi RNA6151c在植物体内发生积累。进一步分析发现,Nta-mi RNA6151c可以在转录水平上调控靶基因protein-tyrosine-phosphatase IBR5-like（IBR5）的表达,从而干扰寄主SA介导的抗病途径,促进CWMV的侵染。这可能是CWMV新的致病机制,但其具体的作用机理还需要进一步研究。
陈荣珠[4]（2020）在《龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析》文中指出龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国华南地区具有较高经济价值的热带亚热带果树。龙眼果实质量和产量与其胚胎发育息息相关。植物体细胞胚胎与合子胚在发育过程基本相似,可作为研究植物胚胎发生机制的优良替代体系。植物体胚发生过程不仅受特异基因的调控,还受表观遗传调控,尤其是DNA甲基化,一定水平的DNA甲基化对植物体胚的正常发育是必须的。mi RNA能够介导DNA的甲基化,该过程与mi RNA加工合成途径中的相关蛋白有关,AGO作为mi RNA加工合成途径中的关键蛋白,参与介导DNA的甲基化,因此,AGO基因可能参与调控植物的体胚发生过程,但是具体作用机制尚不清楚,目前,关于龙眼AGO表达调控和功能特异性研究仍有大量空白。因此,本研究首先从三代测序的龙眼基因组数据库中鉴定出AGO基因家族,对Dl AGOs家族的表达模式进行了分析,利用异位表达的方法对龙眼AGO基因及启动子功能进行研究。最后,进行了龙眼胚性愈伤组织去甲基化的转录组学分析。以此来探究AGO在龙眼体胚发生早期的甲基化调控机制。主要研究结果如下:1龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定、生物信息学分析及Dl AGO4、Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1 c DNA的克隆从龙眼基因组数据库中共鉴定出AGO家族10个成员,并根据注释到拟南芥或水稻中的成员进行命名。这些Dl AGOs基因分布于龙眼1、4、8、10、12、13、14和15号染色体,编码794-1064个氨基酸,含有AGO典型的保守结构域,且该家族的蛋白质均为亲水的碱性蛋白。系统进化树分析表明,不同物种的AGO可被分成4个分支,龙眼AGO与甜橙AGO亲缘关系最近。RT-PCR结合RACE法从龙眼EC中克隆获得了Dl AGO4、Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1基因的c DNA全长序列,其长度分别为3425 bp、3418 bp、3775 bp和3289 bp。Dl AGOs基因家族成员的氨基酸序列同源性较低,可能与其功能的多样性有直接的关系。2龙眼Dl AGOs启动子的克隆与生物信息学分析克隆获得了Dl AGOs基因5’端侧翼序列长度分别为1437 bp、1809bp、1514 bp、1807 bp、1707 bp、1722 bp、1784 bp、1746 bp、1794 bp和1512 bp。生物信息学分析表明,Dl AGO1、Dl AGO4和Dl AGO5-2启动子含有Cp G岛区域;Dl AGOs启动子序列除了含有大量的核心元件TATA-box和CAAT-box外,还含有多种光响应、激素应答、环境胁迫响应等元件,说明龙眼AGO基因在激素响应、光响应及抗逆等方面可能具有调控作用。3龙眼Dl AGOs家族的表达模式分析Dl AGOs不同成员在龙眼体胚发生早期阶段及合子胚发育阶段均有表达,尤其在胚胎发生的早中期具有较高的表达,不同成员具有一定功能的分工和互补,可能参与调控龙眼胚胎发生发育过程。Dl AGOs在龙眼不同组织部位中的时空表达具有特异性,可能参与龙眼种子、花、幼果和茎的发育调控。Dl AGOs基因在激素处理、不同光质处理、高温和低温处理、盐胁迫、渗透胁迫、干旱胁迫以及ABA处理下均有响应,说明它们广泛参与了激素应答、光响应及非生物胁迫应答,但是不同成员具有不同的表达模式,这也体现了AGO基因家族成员之间功能的多样性。4龙眼Dl AGOs启动子的功能验证构建龙眼Dl AGOs启动子表达载体瞬时转化烟草叶片和龙眼胚性愈伤组织EC,利用组织化学染色、GUS基因的瞬时表达及启动子激素应答分析。结果显示,Dl AGOs启动子均具有驱动GUS基因表达的活性,其中pro AGO5-1的驱动能力最强,ABA诱导Dl AGOs启动子的转录活性,部分启动子受Me JA、SA和GA3的诱导,推测龙眼Dl AGOs启动子为激素诱导型启动子。5 Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1的亚细胞定位研究构建融合表达载体,瞬时转化洋葱内表皮细胞,以GFP为报告基因,利用激光共聚焦显微镜观察表达情况,亚细胞定位结果表明,龙眼Dl AGO7主要定位于细胞核中,而Dl AGO10和Dl AGOMEL1主要定位于细胞质中。6 5-氮胞苷对龙眼体胚发生早期及Dl AGOs表达的影响2,4-D和5-azac均会影响植物体胚的发生,本研究用2,4-D（0.1、0.5、1.0 mg/L）与5-氮胞苷（5-azac:0、5、25、50、100 uM）配合处理龙眼胚性愈伤组织。显微观察发现,5 uM 5-azac与0.1 mg/L或0.5 mg/L 2,4-D配合使用,有利于球形胚产生;定量结果表明,Dl AGOs响应2,4-D和5-azac的处理,其中Dl AGO4在5 uM 5-azac处理下呈上调表达。在MS培养基中添加0、2.5、5 uM 5-azac处理龙眼EC 1、3、6、9和12 d,显微观察发现,培养第9 d,对照组未出现球形胚,而处理组中的龙眼胚性愈伤组织均发育至球形胚阶段;培养到第12 d,对照组和处理组均出现了球形胚;定量结果表明,低浓度5-azac处理9d促进Dl AGO4基因的表达。7 5-氮胞苷处理下龙眼体胚发生早期的转录组学分析用2.5 uM 5-azac处理龙眼EC 9 d,以不加5-azac为对照组,采用BGISEQ-500测序平台进行RNA高通量测序。测序结果表明,对照组与处理组相比总共有1,617个差异表达的基因,主要富集在植物病原互作、植物激素信号转导、植物MAPK信号通路、淀粉和糖代谢及丁酸盐代谢、C5-支化二元酸代谢、硫代谢、硒代化合物代谢等代谢通路。5-azac处理后,龙眼DNA甲基化水平降低,促进与龙眼体胚发生相关基因（FUS3、ABI3、FT1、GABA-T3、CAS、GLP等）和AGO4基因上调表达,从而促进龙眼早期体胚的发生。因此,5-azac处理促进龙眼Dl AGO4基因的表达,Dl AGO4与24-nt lmi RNA结合抑制DNA甲基化,促进龙眼体胚发生;5-azac抑制组蛋白乙酰化促进龙眼体胚发生;丁酸盐促进组蛋白丁酰化促进龙眼体胚发生,同时,丁酸盐代谢还参与植物抗逆。
陈景丽[5]（2020）在《拟南芥EMB1270调控叶绿体发育的机理研究与PPR蛋白功能分析新方法》文中进行了进一步梳理PPR（Pentatricopeptide repeat）蛋白是由35个氨基酸为基序的串联重复组成,在所有真核生物中保守。PPR蛋白结合单链RNA,参与细胞器基因的转录后调控,包括RNA切割、剪接、编辑和稳定等。PPR蛋白在高等植物中最为丰富,是陆生植物中最大的蛋白质家族之一,这是因为植物需要众多PPR蛋白来调控叶绿体和线粒体基因的表达,其中很多是植物生存所必需的基因。在本研究中,我们通过筛选叶绿体发育缺陷突变体,得到了拟南芥EMB1270的一个弱等位突变体,emb1270-2。它在幼苗时期表现出子叶黄化并逐渐转绿的表型,其PSII最大光化学量子产量（Fv/Fm）显着低于野生型。EMB1270编码一个定位于叶绿体的且具有24个PPR模体的P亚家族蛋白,其敲除突变体emb1270-1呈现胚胎致死表型。我们发现在emb1270-2突变体中叶绿体基因clpP1 intron 2和ycf3 intron1的剪接效率显着降低。进一步研究发现EMB1270与两个叶绿体定位的剪接因子蛋白CAF1和CFM2相互作用,由此我们推测EMB1270协同CAF1和CFM2特异性调控叶绿体clpP1 intron 2和ycf3 intron 1的剪接。由于许多PPR蛋白的缺失导致胚胎致死,因此敲除突变体难以用于这些PPR蛋白的功能研究。在本研究中,我们发现通过在野生型中过量表达一个突变的PPR基因,导致其内源基因的转录后沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS）,也称为共抑制（co-suppression）。这样的转基因株系类似于knockdown植株,从而为研究PPR蛋白,特别是胚胎致死型PPR蛋白的功能提供了一种替代方法。利用这种方法,我们创建了一个功能未知、胚胎致死型PPR蛋白——EMB976的共抑制株系,并找到了EMB976调控的位于叶绿体中的可能靶基因——ycf3和clpP1。
霍雯[6]（2020）在《龙眼miRNA合成途径相关基因的鉴定及DlAGO4功能的初步研究》文中提出龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国热带亚热带地区重要的经济型木本果树,具有极高的食用及药用价值,但是龙眼在生产上存在诸多限制其产业发展的问题。研究发现龙眼果实的产量、品质等与龙眼胚胎发育有着密切的关系,因此龙眼胚胎发育的研究具有重要意义。mi RNA（micro RNA）是一类21～24个核酸长度的小分子,在植物生长发育过程中起着重要作用。mi RNA的形成和作用机制需要很多基因的参与,且龙眼体胚中24nt的mi RNA序列最多。有研究表明一定程度的DNA甲基化有利于植物胚胎的正常发育,其中lmi RNA（long mi RNA）与DNA甲基化密切相关,其中Argonaute4蛋白在龙眼体胚发生中的功能尚不明确。本研究拟借助龙眼体胚发生系统,进行mi RNA合成途径相关基因的鉴定与分析、启动子分析、体胚不同阶段以及外源激素和非生物胁迫处理下的表达模式分析、Dl AGO4亚细胞定位分析以及沉默Dl AGO4对龙眼体胚发生早期形态建成影响的研究。主要研究结果如下:1龙眼mi RNA合成途径相关基因的鉴定和生物信息学分析从龙眼基因组中鉴定得到15条相关基因,分别命名为Dl DDL1、Dl DDL2、Dl DDL3、Dl DCL1、Dl SE、Dl HYL1a、Dl HYL1b、Dl HYL1c、Dl CBP20、Dl CBP80、Dl HEN1、Dl HASTY、Dl DCL3、Dl AGO4、Dl DRM2。生物信息学分析表明:Dl DDL1、Dl HYL1a、Dl HYL1c、Dl SE和Dl AGO4为碱性蛋白,其余成员均为酸性蛋白;除Dl HASTY为疏水性蛋白外,其余成员均为亲水性蛋白;所有基因均为不稳定蛋白;15条基因精确定位在8条染色体上;Dl CBP80为分泌蛋白,其余成员均不属于分泌蛋白;除Dl DDLs蛋白的三个成员不含跨膜结构外,其余蛋白均具有多个跨膜结构;蛋白保守结构域的结果显示各个成员均含有其典型结构域;蛋白互作分析表明,mi RNA合成途径相关基因之间具有较强的互作关系;不同基因与其它物种间在进化上呈现不同的远近关系;mi RNA合成途径相关基因在龙眼体细胞早期发育过程中呈现出不同的表达模式,提示不同成员在龙眼体胚发生早期具有不同的功能分工和特点。2龙眼mi RNA合成途径相关基因启动子分析在龙眼基因组中提取上述基因起始密码子ATG上游2000bp序列进行启动子分析。顺式作用元件分析发现:mi RNA合成途径相关基因均含有大量TATA-box和CAAT-box,表明均可以进行正常的转录,同时还包含各种光学响应元件、激素响应元件;同时还含有与细胞周期、昼夜控制、干旱、胁迫、胚乳、分生组织、低温等作用元件,提示这些基因可能参与激素应答、胁迫响应、光响应、生物钟、抗旱抗寒、种子生长、胚胎发育等过程。3龙眼mi RNA合成途径相关基因表达模式分析15条基因在龙眼体胚发生早期三个阶段的表达趋势有着明显的不同。其中Dl DDL1、Dl HYL1b不表达,Dl DDL2、Dl DDL3表达比较平稳,Dl SE、Dl HYL1c、Dl CBP80、Dl HEN1呈现先下降后上升的趋势,Dl HYL1a、Dl CBP20、Dl HASTY呈现下降趋势,Dl DCL1、Dl DCL3呈现下降趋势,Dl AGO4、Dl DRM2呈现先上升后下降的趋势,其中Dl AGO4在三个阶段表达量均为最高,推测Dl AGO4在龙眼体胚早期发生重要作用。在外源激素ABA处理24h后Dl HYL1c和Dl DCL3的表达量呈现明显上调;Me JA处理4h后Dl DDL2、Dl DDL3、Dl DCL1、Dl SE、Dl HYL1c、Dl CBP20的表达量均呈现明显上调,处理12h后Dl CBP80表达量出现明显上调,Dl DCL3在整个时间处理中表达量均上调;SA处理24h后Dl HYL1c表达量上升,Dl DDL3、Dl DCL1、Dl CBP80、Dl HASTY、Dl DCL3在处理48h后表达量明显上升;GA3处理4h后Dl DDL3、Dl DCL1、Dl HYL1c表达量上调,Dl DDL2在8h处表达量上调,Dl CBP80和Dl DCL3分别在24h和48h处表达量明显上调,表明龙眼mi RNA合成途径相关基因在外源激素处理下有不同的应答机制。经盐胁迫处理后,Dl DDL2和Dl SE在50mmol/L和100mmol/L浓度下表达量明显升高,Dl DDL3在50mmol/L浓度下表达量升高,Dl HYL1c在100mmol/L和200mmol/L浓度下表达量升高,其余处理表达量均下降表现为负调控。10%的PEG6000处理下,Dl DCL1在8h出表达量升高,Dl DDL2在12h和24h处表达量升高,Dl DDL3、Dl SE、Dl HYL1a、Dl DCL3在24h处表达量升高,Dl HYL1c在8h、12h、24h、48h表达量均有明显升高,其余处理下表达量明显降低表现为负调控。上述结果表明龙眼mi RNA合成途径相关基因广泛参与不同非生物胁迫,但不同成员的应答模式不同。4龙眼Dl AGO4的亚细胞定位研究采用Wo LF PSORT在线网站预测龙眼Dl AGO4可能定位于细胞核。同时,在龙眼Dl AGO4 c DNA全长序列的基础上构建了1302-Dl AGO4-GFP表达载体,采用农杆菌注射法侵染烟草叶片,在激光共聚焦显微镜下观察烟草叶片中的荧光。结果表明:龙眼Dl AGO4定位于细胞核,与预测结果一致。该结果为进一步探究该基因的功能奠定基础。5 Dl AGO4基因沉默对龙眼体胚发生早期形态发生的影响根据Dl AGO4基因的ORF序列设计并合成用于敲除靶基因的Si RNA,筛选抑制效果最好的靶点477进行龙眼愈伤组织转化实验结果表明:抑制Dl AGO4后与对照组相比,出现球形胚时间稍微提前,表明抑制Dl AGO4后龙眼体胚发生早期分化速度加快,推测这可能与降低龙眼体胚发生早期甲基化水平有关。
赵春丽[7]（2020）在《苋菜AtGAI基因克隆及功能分析》文中研究说明苋菜（Amaranthus tricolor L.）是石竹目苋科苋属一年生草本植物,茎和叶富含甜菜色素,因具有清除氧自由基、抗氧化、抗衰老、抑癌及着色能力好等作用被广泛应用于医药、化妆品及食品中。甜菜色素的合成不仅受内在遗传物质的影响,也受到温度、激素、光照和机械损伤等外界信号的影响,但外界信号调控甜菜色素代谢的分子机制尚不清楚。DELLA蛋白是植物对各种环境信号和激素信号系统反应的整合因子,研究DELLA蛋白基因对甜菜色素代谢的影响具有重要意义。本研究以‘大红’苋菜为试验材料,克隆出了苋菜DELLA蛋白基因AtGAI并对其进行生物信息学分析;探究了GA3、PP333及温度是否通过调控AtGAI基因的表达进而调控苋菜幼苗生长及甜菜色素代谢;最后采用VIGS技术进一步验证苋菜AtGAI基因的功能,以期为深入研究GAI基因对甜菜色素代谢机制的调控奠定基础,也为将来苋菜栽培中的环境调控提供理论参考。1苋菜AtGAI基因的克隆与生物信息学分析采用RT-PCR结合RACE技术从‘大红’苋菜中克隆出GAI基因c DNA全长序列,命名为AtGAI,全长为2 168 bp,含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸。生物信息学分析表明,苋菜AtGAI蛋白与其他物种GAI蛋白具有高度相似性,含有DELLA和GRAS两个保守结构域。进化树分析表明,苋菜AtGAI蛋白与籽粒苋GAI蛋白亲缘关系最近,且与石竹目植物聚为一个分支。综上所述,苋菜AtGAI基因是GAI家族成员且在生物进化过程中具有保守性,可能与其他植物中的GAI蛋白具有类似功能。密码子偏好性分析表明:苋菜AtGAI基因密码子偏好性符合双子叶植物对密码子的使用特性,且与亲缘关系较近的物种使用偏好性相似,密码子偏好性主要受碱基突变的影响,但也受自然选择等其他因素的影响;酵母真核表达系统更适用于苋菜AtGAI基因异源表达,甜菜是苋菜AtGAI基因最理想的遗传转化受体。2 GA3或PP333对苋菜幼苗生长及甜菜色素合成相关基因表达的影响通过对不同激素处理的苋菜组培苗和盆栽苗进行形态观察发现:GA3浓度与株高净增长量呈正相关,与植株红色程度呈负相关;PP333浓度与株高净增长量呈负相关与植株红色程度呈正相关;不同培养条件下,苋菜幼苗对外源GA3和PP333的敏感程度不同。显微观察及甜菜色素含量测定发现,甜菜色素主要分布于苋菜子叶和下胚轴的表皮及维管束鞘周围的薄壁细胞中,甜菜色素含量与GA3浓度呈负相关,与PP333浓度呈正相关。内源激素含量测定发现:外源GA3处理使内源GA3和IAA含量升高;外源PP333使内源IAA含量下降,使内源GA3含量略有升高但未出现显着差异。qPCR分析表明,苋菜组培苗子叶和下胚轴中AtGAI、Am MYB1、Am CYP76AD1、Ama DODA基因表达量与GA3浓度均呈负相关,且存在部位差异性。综上所述,AtGAI基因可能通过响应GAs信号参与调控苋菜幼苗生长及甜菜色素代谢。3温度处理对苋菜幼苗生长及甜菜色素合成相关基因表达的影响对7 d幼苗进行不同温度及不同时间处理。形态观察发现:不同温度处理3 d后,植株颜色差异较显着,15℃、20℃和40℃处理下苋菜幼苗中的红色变淡;处理6 d后,40℃处理下的幼苗细长、子叶闭合,25℃和30℃处理下的幼苗长出第1片真叶,15℃、35℃和40℃处理下苋菜幼苗中的红色变淡。甜菜色素含量测定发现,温度与甜菜色素含量呈倒U形曲线关系,25℃时最高,30℃和25℃未出现显着差异,且处理6 d的变化程度比3 d更明显。说明,温度是影响‘大红’苋菜幼苗形态的重要环境因子,最适温度范围为℃。qPCR分析发现,不同温度处理3 d后和6 d后,苋菜幼苗中AtGAI、Am MYB1、Am CYP76AD1和Ama DODA基因表达量基本呈现先上升后下降的趋势,处理时间越久变化趋势越明显。综上所述,温度可能通过调控AtGAI基因的表达来调控苋菜幼苗生长及甜菜色素代谢。4苋菜AtGAI基因的功能分析采用VIGS技术来进一步验证苋菜AtGAI基因在苋菜幼苗生长及甜菜色素代谢中的作用。表型观测发现,Uninoculated、p TRV1/p TRV2-empty和p TRV1/p TRV2-AtGAI 3组处理间,株高存在显着差异,且呈现高和矮两种株型。AtGAI基因表达水平检测发现,p TRV1/p TRV2-empty组及p TRV1/p TRV2-AtGAI组中较高植株显示阳性,较矮显示阴性,阳性率约为60%,基因沉默率约为17%。甜菜色素合成相关基因表达水平检测发现:对于AtGAI、Am MYB1和Am CYP76AD1基因而言,与Uninoculated组相比,接种p TRV1/p TRV2-AtGAI使基因表达量下降,接种p TRV1/p TRV2-empty使基因表达量升高;对于Ama DODA基因而言,与Uninoculated组相比,接种p TRV1/p TRV2-empty和接种p TRV1/p TRV2-AtGAI后基因表达量都下降,但接种p TRV1/p TRV2-AtGAI后基因表达量下降更明显。进一步说明,苋菜AtGAI基因可能通过调控甜菜色素合成关键基因Am MYB1、Am CYP76AD1和Ama DODA的表达进而调控甜菜色素代谢。对接种2周时的苋菜植株喷施外源GA3处理4 d后发现,与Uninoculated组相比,p TRV1/p TRV2-empty组株高净增长量略低,差异显着但未达到极显着水平,而p TRV1/p TRV2-AtGAI组株高净增长量较高且出现极显着差异。说明,将AtGAI基因部分沉默后,再喷施外源GA3植株生长更快,可能是由于此时AtGAI蛋白的阻碍作用减弱。
杨鹏[8]（2019）在《抗赤霉病RNA干扰片段的鉴定及转玉米VP1基因小麦的抗穗发芽机理》文中认为小麦赤霉病是我国小麦生产上的重要病害,不仅严重降低产量,还产生真菌毒素。抗病资源匮乏是赤霉病未能得到有效控制的重要原因之一。穗发芽是我国小麦主产区的重要灾害,穗发芽导致产量、品质及种子活力降低。转玉米Vp1基因可提高小麦的穗发芽抗性,但其调控机理仍不十分清楚。本研究包括两部分工作。在第一部分中,鉴定了4个赤霉菌基因RNAi片段（Chs7-3,Chs7-4,Gls-6和Myo II-14）,体外转录的双链RNA,能高效抑制赤霉病致病菌禾谷镰刀菌生长。将这些RNAi片段及赤霉菌其它基因的RNAi片段,与颖壳特异启动子Lem2或组成型启动子Ubiquitin结合,经农杆菌介导转入小麦品种,筛选获得转基因小麦株系25个,接种鉴定其赤霉病抗性的结果如下:1.转Lem2驱动的Chs7-3-Chs7-4小麦温室花期接种表明,T5代2个转基因株系（YULC2和YCLC）比未转化扬麦158对照的赤霉病抗性显着提高37%-43%;T6代田间花期接种鉴定中,3个株系（YULC2、YULC4和YCLC）比未转化扬麦158对照的抗性显着提高37%-49%,麦粒毒素含量降低53%-92%。2.转Ubiquitin驱动的Chs7-3-Chs7-4小麦温室T3代花期接种后,两个转基因株系（YU1和YU6）与未转化扬麦158对照相比,赤霉病抗性显着提高38%-39%;T3代苗期接种后,5个株系（YU1、YU3、YU4、YU6和YU7）的抗性,比与未转化扬麦158对照极显着提高17%-36%。3.转Ubiquitin驱动的5个不同赤霉菌基因RNAi片段Chs3b-5-Pkc-5-Chs7-4-Gls-6-Myo II-14小麦,以Fielder为受体获得的转基因株系T3代温室花期接种后,1个株系（5C3）的赤霉病抗性比未转化Fielder对照提高24%;苗期接种后,2个株系（5C1和5C3）比未转化Fielder对照的抗性极显着提高17%-23%。以扬麦158为受体的转基因株系T3代温室花期接种后,5CY1株系的赤霉病抗性比未转化扬麦158对照极显着提高77%,5CY2株系比未转化扬麦158对照显着提高62%。第二部分关于转玉米Vp1基因小麦株系转录组及蛋白组研究表明,在小麦种子发育过程中,Vp1基因调控0.7%-7.7%小麦基因转录本含量、1.1%-3.4%蛋白质含量,其中包括贮藏蛋白、水解酶抑制因子和脱水素等;综合转录组及蛋白组代谢路径分析发现,Vp1基因是调控激素信号通路中的关键基因,并参与脱落酸与其它植物激素之间的互作,从而增强了小麦种子的休眠性并提高了穗发芽抗性。本研究获得的RNAi片段及转基因株系,为小麦赤霉病抗性改良提供了材料和依据;揭示的VP1介导的抗穗发芽调控机理,为利用玉米Vp1基因提高小麦穗发芽抗性提供了信息和支撑。
吴会杰[9]（2019）在《SLCCNV和MNSV侵染性克隆的构建及致病因子鉴定》文中认为甜瓜（Cucumis melo）是我国重要的经济作物之一。近年来,新突发病毒病严重影响甜瓜产业发展。中国南瓜曲叶病毒（squash leaf curl China virus）和甜瓜坏死斑点病毒（melon necrotic spot virus）是中国新近报道为害甜瓜的种。为阐明两种病毒的致病机理,构建了SLCCNV和MNSV两种甜瓜病毒的侵染性克隆,分析了病毒编码的病毒致病因子,以期为防控该病毒病奠定基础。目前取得以下结果:1、鉴定了甜瓜是SLCCNV的新寄主,构建了SLCCNV侵染性克隆并进行了烟粉虱传染试验。测定了SLCCNV-HN全基因组序列并进行了系统进化分析,结果表明SLCCNV-HN甜瓜分离物与SLCCNV-Hn南瓜分离物、SLCCNV-Hn61和SLCCNV-SY西葫芦分离物聚为一类。构建了SLCCNV-HN侵染性克隆载体,接种甜瓜后植株矮化、叶片皱缩。进行了烟粉虱传染试验,发现烟粉虱接种的植株表现出与接种野生型一致的症状。2、明确了AC5基因是SLCCNV的致病因子,证实了AC5是SLCCNV编码的沉默抑制子,其沉默抑制活性与核定位信号相关。将表达AC5基因的PVX异源载体接种本氏烟后叶片表现枯斑、皱缩,表明AC5是致病因子并激发了植物的过敏性坏死反应,DAB染色说明过敏性坏死反应与H2O2的积累相关。不仅如此,利用SLCCNV侵染性克隆定点突变AC5基因,进一步证实了AC5基因是该病毒的致病因子。利用p35S-AC5与p35S-GFP共浸润接种16c本氏烟,接种5 d后接种部位出现明显的绿色荧光信号,表明了AC5基因可抑制局部沉默。利用p35S-GFP、p35S-dsGFP和p35S-AC5共浸润野生本氏烟,接种5 d后在接种部位未发现绿色荧光信号,表明AC5不抑制双链GFP（IR-PTGS）诱导的沉默。在AC5基因ORF之前引入终止密码子,明确了AC5是在蛋白水平发挥作用。利用AC5核定位信号缺失突变体与p35S-GFP共浸润16c本氏烟,发现该突变体失去了沉默抑制作用,表明AC5蛋白的核定位信号与沉默抑制活性相关。3、证实了p42是MNSV的致病因子,与寄主因子3-羟基异丁酸脱氢酶（3-Hydroxyisobutyrate dehydrogenase-like 1,3HID1）互作。将表达p42基因的PVX异源载体接种本氏烟后植株新叶枯死,证实p42是MNSV的致病因子。构建了MNSV侵染性克隆,在此基础上构建了携带GFP的MNSV侵染性克隆载体。在MNSV侵染性克隆的基础上进行了p42基因突变,发现p42的R-domain和S-domain是致病功能域。此外,构建了受MNSV侵染的甜瓜cDNA文库,筛选到与p42互作的6个寄主因子,经酵母双杂交、BIFC及共定位一对一验证,表明3HID1与p42互作,本研究为揭示p42与寄主互作的机制奠定了基础。
钟敏[10]（2019）在《多组学研究水稻幼苗响应镉胁迫的分子机制》文中认为镉对水稻的影响是一个日益受到全球关注的问题。虽然在水稻中已经鉴定出许多与水稻Cd转运、累积和耐受性相关的基因,但蛋白质磷酸化对Cd解毒和耐受的贡献（如果有的话）仍然是不确定,同时目前也还没有通过转录组、小RNA组和降解组测序整体鉴定和验证miRNA及其靶基因在水稻幼苗响应Cd胁迫中的调控作用。本研究首次采用转录组、小RNA组、降解组和磷酸蛋白组对处于不同Cd浓度（0μΜ、10μΜ和100μΜ）胁迫下的水稻幼苗进行联合组学分析鉴定水稻幼苗中miRNA/靶基因和磷酸蛋白质在响应镉胁迫中的作用。主要结果如下:（1）通过转录组分析一共鉴定到4,223个差异表达基因响应镉胁迫,其中有2,487基因受镉诱导表达,1736个基因表达被镉胁迫抑制。功能分析显示这些差异表达基因主要是参与光合作用（光收获、光系统I和II、光合作用、电子载体活性和叶绿素结合）和蛋白质降解代谢途径（萘、蒽降解、柠檬烯、蒎烯降解和γ-六氯化苯降解）。（2）通过miRNA组和降解组分析鉴定到40个miRNA在Cd胁迫下发生了显着改变,其中包括代表22个miRNA家族的38个已知miRNA和2个新的miRNA。18个差异表达的靶基因的表达量与18个Cd响应miRNA的表达量呈负相关。大多数miRNA的靶标基因是转录因子,如生长素响应因子13（ARF13）,类稻草蛋白6（SCL6）,类鳞状病毒启动子结合蛋白,核转录因子Y亚基A-6（NFYA6）,赤霉素依赖性禽髓母细胞病毒癌基因（GAMYB）和顶端分生组织蛋白质（NACs）,其中大多数是参与脱落酸（ABA）、生长素、赤霉素酸（GA）和MAPK（丝裂原激活蛋白激酶）等信号转导途径。功能分析表明,参与水稻光合作用通路（osa00196,osa00195,osa00710）和蛋白降解通路（osa04612）的miRNA和其靶标基因参与了Cd胁迫的响应,包括osa-mi R156I-5pR-1/SPLs、osa-mi R171a1ss12CT/DEGP10和osa-mi R169r-5pR/NFYA6。本研究将为研究miRNA介导的植物对Cd胁迫响应的分子机制提供一个有用的方法。（3）对不同Cd浓度（0μΜ、10μΜ和100μΜ）溶液中培养的幼苗进行定量磷蛋白组分析,共鉴定出1244个磷酸蛋白质和2454个磷蛋化修饰位点。在Cd胁迫下,共有482个蛋白的磷酸化修饰发生不同程度的改变;在100μΜCd2+处理样品中鉴定到的差异磷酸化的蛋白质数量是10μΜCd2+处理样本中的6倍。功能分析表明,大量差异磷酸化蛋白是参与信号传导、对胁迫的耐受性和活性氧的清除的转录因子。
二、植物中转录后基因沉默的启动、传导与抑制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、植物中转录后基因沉默的启动、传导与抑制（论文提纲范文）
（1）葡萄霜霉菌CRN效应因子鉴定与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 葡萄霜霉菌致病研究概况 |
| 1.1.1 葡萄霜霉菌的生活史和侵染过程 |
| 1.1.2 葡萄霜霉菌基因组学研究 |
| 1.2 卵菌效应因子研究进展 |
| 1.2.1 卵菌RXLR效应因子研究概况 |
| 1.2.2 葡萄霜霉菌RXLR效应因子研究进展 |
| 1.2.3 卵菌CRN效应因子研究概况 |
| 1.2.4 葡萄霜霉菌CRN效应因子研究进展 |
| 1.2.5 卵菌胞内效应因子作用机制研究进展 |
| 1.3 植物先天免疫机制概述 |
| 1.4 植物PTI和ETI下游信号传导 |
| 1.5 铁硫蛋白的功能概述 |
| 1.6 植物细胞内铁硫簇的组装和铁硫蛋白的成熟 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 葡萄霜霉菌CRN效应因子基因的克隆与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 植物材料和微生物菌株 |
| 2.2.2 载体 |
| 2.2.3 培养基、药品和试剂 |
| 2.2.4 主要仪器设备 |
| 2.2.5 植物材料和葡萄霜霉菌培养 |
| 2.2.6 葡萄霜霉菌基因组DNA提取 |
| 2.2.7 葡萄霜霉菌PvCRN基因的克隆及载体构建 |
| 2.2.8 葡萄霜霉菌PvCRN基因序列的生物信息学分析 |
| 2.2.9 信号肽分泌功能验证 |
| 2.2.10 农杆菌注射法介导基因瞬时表达 |
| 2.2.11 荧光成像实验 |
| 2.2.12 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.13 葡萄霜霉菌和辣椒疫霉菌接种实验 |
| 2.2.14 RNA提取和RT-PCR |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 葡萄霜霉菌PvCRN基因的序列特征 |
| 2.3.2 葡萄霜霉菌PvCRN基因系统进化分析 |
| 2.3.3 葡萄霜霉菌PvCRN的典型信号肽具有分泌功能 |
| 2.3.4 葡萄霜霉菌PvCRN蛋白在植物细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.5 葡萄霜霉菌PvCRN蛋白诱导植物细胞死亡活性分析 |
| 2.3.6 葡萄霜霉菌PvCRN蛋白抑制植物过敏性坏死活性分析 |
| 2.3.7 葡萄霜霉菌PvCRN蛋白对本氏烟草感病性的影响 |
| 2.3.8 葡萄霜霉菌PvCRN基因的转录表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 PvCRN17蛋白植物毒性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 植物材料和微生物菌株 |
| 3.2.2 培养基、药品和试剂 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 载体构建和转化农杆菌 |
| 3.2.5 植物外源基因瞬时表达和稳定遗传转化 |
| 3.2.6 核酸提取 |
| 3.2.7 病原菌接种 |
| 3.2.8 H_2O_2积累的检测 |
| 3.2.9 蛋白免疫印迹 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 葡萄霜霉菌PvCRN17抑制部分ETI反应 |
| 3.3.2 葡萄霜霉菌PvCRN17抑制植物ROS的积累 |
| 3.3.3 葡萄霜霉菌PvCRN17转基因拟南芥表型分析 |
| 3.3.4 葡萄霜霉菌PvCRN17的毒性与其膜定位有关 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 PvCRN17蛋白与植物AE7-Like1蛋白互作 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 植物材料和微生物菌株 |
| 4.2.2 载体 |
| 4.2.3 培养基、药品和试剂 |
| 4.2.4 主要仪器设备 |
| 4.2.5 酵母感受态细胞制备 |
| 4.2.6 重组质粒转化酵母细胞 |
| 4.2.7 重组诱饵质粒自激活检测 |
| 4.2.8 酵母双杂交(mating)筛选互作蛋白 |
| 4.2.9 酵母质粒的提取和猎物片段的鉴定 |
| 4.2.10 诱饵与猎物蛋白互作的回复验证 |
| 4.2.11 双分子荧光法(BiFC)验证蛋白互作 |
| 4.2.12 免疫共沉淀法(Co-IP)验证蛋白互作 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 葡萄霜霉菌PvCRN17互作蛋白筛选结果 |
| 4.3.2 Y2H实验证明PvCRN17与候选靶标蛋白互作 |
| 4.3.3 BiFC证明PvCRN17与候选靶标蛋白互作 |
| 4.3.4 Co-IP证明PvCRN17与候选靶标蛋白互作 |
| 4.3.5 PvCRN17与At AEL1、NbAE7L1互作 |
| 4.3.6 不同葡萄AE7-like1蛋白高度保守 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 葡萄VAE7L1蛋白调节植物抗病性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料方法 |
| 5.2.1 植物材料和微生物菌株 |
| 5.2.2 载体 |
| 5.2.3 培养基、药品和试剂 |
| 5.2.4 主要仪器设备 |
| 5.2.5 酵母双杂交实验验证蛋白互作 |
| 5.2.6 Bi FC实验验证蛋白互作 |
| 5.2.7 竞争Co-IP实验 |
| 5.2.8 病毒诱导烟草基因沉默(VIGS)实验 |
| 5.2.9 病原菌接种 |
| 5.2.10 RNA提取与Real Time-Quantitative PCR |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 葡萄VAE7L1蛋白参与细胞质铁硫蛋白组装 |
| 5.3.2 葡萄VAE7L1基因参与植物抗病反应 |
| 5.3.3 葡萄部分铁硫蛋白调控植物抗病性分析 |
| 5.3.4 PvCRN17与VCIA1竞争结合VAE7L1和VAE7 |
| 5.3.5 PvCRN17与VAE7L1共定位于细胞膜 |
| 5.4 .讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）水稻条纹病毒调控寄主Ferredoxin 1基因表达的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1 水稻条纹病毒的研究概况 |
| 1.1.1 水稻条纹叶枯病的发生与危害 |
| 1.1.2 水稻条纹病毒的基因组结构 |
| 1.1.3 水稻条纹病毒编码的蛋白及功能 |
| 1.1.4 水稻条纹病毒与寄主植物的互作 |
| 1.1.4.1 转录水平的调控 |
| 1.1.4.2 蛋白水平互作 |
| 1.1.5 抗RSV水稻育种策略 |
| 1.2 植物Ferredoxins蛋白研究进展 |
| 1.2.1 植物Ferredoxins蛋白的发现与命名 |
| 1.2.2 植物FDs的分类与结构 |
| 1.2.3 植物FDs的生物学功能 |
| 1.2.3.1 植物FDs与光合作用 |
| 1.2.3.2 植物FDs依赖的叶绿体代谢过程 |
| 1.2.3.3 植物FDs与植物病毒 |
| 1.2.4 植物FDs的表达调控 |
| 1.2.4.1 光照影响植物FDs的表达 |
| 1.2.4.2 胁迫条件下植物FDs的表达 |
| 1.3 高通量测序技术 |
| 1.3.1 RNA测序 |
| 1.3.2 小RNA |
| 1.3.2.1 小RNA的研究方法 |
| 1.3.2.2 病毒来源的si RNA研究 |
| 1.3.3 降解组测序 |
| 1.4 脱落酸与植物病毒 |
| 1.4.1 ABA的生物合成、信号转导以及响应基因 |
| 1.4.1.1 脱落酸的生物合成与代谢 |
| 1.4.1.2 脱落酸的信号转导 |
| 1.4.1.3 ABA响应基因及其bZIP转录因子 |
| 1.4.2 脱落酸与植物抗病毒反应 |
| 1.4.2.1 病毒侵染与ABA积累 |
| 1.4.2.2 ABA参与的抗病毒反应 |
| 2 FD1 参与植物抵抗RSV侵染过程 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料及毒源 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 本氏烟及水稻接种RSV |
| 2.2.2 叶片总RNA提取 |
| 2.2.3 RNA逆转录 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 RNA杂交 |
| 2.2.6 植物组织蛋白提取 |
| 2.2.7 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 2.2.8 Western blotting实验流程 |
| 2.2.9 载体构建 |
| 2.2.10 TRV介导的基因沉默 |
| 2.2.11 农杆菌浸润 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RSV侵染下调水稻FD1(Os FD1)表达 |
| 2.3.2 RSV侵染下调本氏烟FD1(NbFD1)表达 |
| 2.3.3 NbFD1 沉默有利于RSV在接种叶片中的积累 |
| 2.3.4 转NbFD1 基因超表达本氏烟抑制RSV侵染 |
| 2.3.5 转OsFD1 基因水稻对RSV抗性增强 |
| 2.4 讨论 |
| 3 vsi R45349 转录后水平调控寄主FD1 的表达 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 试验所用试剂及软件 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 小RNA建库与测序 |
| 3.2.2 小RNA测序数据分析 |
| 3.2.3 降解组建库与测序 |
| 3.2.4 降解组测序数据处理与分析 |
| 3.2.5 降解组数据筛选 |
| 3.2.6 小RNA Northernblot |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 RSV来源的vsi RNAs分析 |
| 3.3.2 一个来自RSV vRNA1的5’端热点区域的小RNA与 NbFD1 存在互补 |
| 3.3.3 含vsi R45349的RSV序列表达下调本氏烟NbFD1 转录本丰度 |
| 3.3.4 miR319-vis R45349 导致NbFD1 转录本下调 |
| 3.3.5 降解组证实RSV侵染后NbFD1 转录本的切割位点 |
| 3.4 讨论 |
| 4 RSV诱导的ABA抑制FD1 转录 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株与载体 |
| 4.1.3 试验所用试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 本氏烟及水稻FD1 启动子结构分析 |
| 4.2.2 激素处理 |
| 4.2.3 ABA含量测定 |
| 4.2.4 转录因子预测 |
| 4.2.5 NbFD1 启动子及突变体构建 |
| 4.2.6 酵母单杂株系构建 |
| 4.2.7 酵母单杂交 |
| 4.2.8 双荧光素酶实验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 NbFD1 启动子序列分析 |
| 4.3.2 类胡萝卜素生物合成途径在RSV侵染本氏烟中差异表达 |
| 4.3.3 RSV侵染诱导寄主体内ABA的积累 |
| 4.3.4 外施ABA降低NbFD1 转录本丰度 |
| 4.3.5 ABA抑制NbFD1 启动子活性 |
| 4.3.6 调控NbFD1 的转录因子预测及分析 |
| 4.3.7 ABI5 负调控NbFD1 转录水平的表达 |
| 4.3.8 ABI5 参与到ABA对 NbFD1 转录水平调控过程 |
| 4.3.9 NbFD1 启动子及ABRE突变体酵母单杂交菌构建 |
| 4.3.10 NbABI5 结合到NbFD1 启动子序列中的ABRE元件 |
| 4.3.11 NbABI5 抑制NbFD1 启动子活性 |
| 4.3.12 NbABI5 沉默提高NbFD1 启动子活性 |
| 4.3.13 NbABI5对NbFD1 启动子活性的调控依赖ABRE元件 |
| 4.3.14 水稻OsFD1 启动子序列分析 |
| 4.3.15 调控OsFD1 表达转录因子预测 |
| 4.3.16 RSV侵染诱导水稻中ABA的积累及OsABI5s转录水平高表达 |
| 4.3.17 ABA处理诱导OsABI5s并抑制OsFD1 转录水平表达 |
| 4.3.18 水稻生长发育中OsABI5s和 OsFD1 的表达谱分析 |
| 4.3.19 OsABI5s抑制OsFD1 启动子活性 |
| 4.4 讨论 |
| 5 全文总结和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ本文所使用引物列表 |
| 附录 Ⅱ术语缩写词及中英文对照 |
| 附录 Ⅲ实验中常用培养基以及缓冲液配方 |
（3）中国小麦花叶病毒诱导下长链非编码RNA的表达、鉴定及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物逆境胁迫与应答机制 |
| 1.2.1 植物的胁迫应答 |
| 1.2.2 胁迫应答机制 |
| 1.3 中国小麦花叶病毒 |
| 1.3.1 中国小麦花叶病毒病的分布、症状及其传播介体 |
| 1.3.2 中国小麦花叶病毒(CWMV)的分子生物学特性 |
| 1.4 植物中非编码RNA研究进展 |
| 1.4.1 非编码RNA及其分类 |
| 1.4.2 植物中主要的非编码RNA及其作用 |
| 1.4.3 植物中非编码RNA与生物胁迫关系的研究进展 |
| 1.5 植物中长链非编码RNA的研究进展 |
| 1.5.1 长链非编码RNA的分子特性 |
| 1.5.2 长链非编码RNA的分类 |
| 1.5.3 长链非编码RNA的作用机制 |
| 1.5.4 植物长链非编码RNA的功能特性 |
| 1.6 长链非编码RNA与病毒互作的研究进展 |
| 1.6.1 长链非编码RNA抗病毒分子机制 |
| 1.6.2 宿主细胞和病毒长链非编码RNA的改变 |
| 1.7 本文主要研究内容 |
| 第二章 中国小麦花叶病毒胁迫下差异表达长链非编码RNA的筛选及分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 植物总RNA提取、质量控制 |
| 2.1.3 RNA文库的构建 |
| 2.1.4 RNA测序、转录组的拼接及其基因表达水平定量 |
| 2.1.5 长链非编码RNA的鉴定 |
| 2.1.6 长链非编码RNA靶基因的预测 |
| 2.1.7 差异表达基因、差异表达lncRNA潜在靶基因的功能富集分析 |
| 2.1.8 长链非编码RNA的 PCR检测 |
| 2.1.9 构建克隆载体 |
| 2.1.10 数据统计与分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 测序数据概述 |
| 2.2.2 差异表达基因的功能富集分析 |
| 2.2.3 差异表达长链非编码RNA及其潜在靶基因的功能富集分析 |
| 2.2.4 蛋白互作网络构建 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 差异表达lncRNA的鉴定及其对中国小麦花叶病毒侵染的响应 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物取样 |
| 3.1.2 RT-PCR进行病毒检测 |
| 3.1.3 差异表达lncRNA的 qRT-PCR鉴定 |
| 3.1.4 构建烟草TRV VIGS表达载体 |
| 3.1.5 根瘤农杆菌浸润法接种 |
| 3.1.6 Northern-blotting鉴定lncRNA |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 用RT-PCR技术鉴定本氏烟中lncRNA |
| 3.2.2 长链非编码RNA的表达及特征分析 |
| 3.2.3 长链非编码RNA对中国小麦花叶病毒侵染的影响分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 Nblnc81288 促进CWMV侵染的分子机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 长链非编码RNA互作miRNA的预测 |
| 4.1.3 5’RACE切割验证 |
| 4.1.4 基因的体外切割验证 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 侵染中国小麦花叶病毒本氏烟中ceRNA网络的构建与分析 |
| 4.2.2 在烟草中体外切割验证 |
| 4.2.3 在烟草中沉默IBR5 基因对中国小麦花叶病毒的影响 |
| 4.2.4 在烟草中沉默IBR5 基因抑制SA通路基因的表达 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要试剂、培养基和仪器 |
| 附录2 缩略词及中英文对照 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 植物AGO蛋白研究进展 |
| 1.1 植物AGO蛋白的结构研究 |
| 1.2 AGO蛋白参与植物micro RNA(mi RNA)的生物合成 |
| 1.3 植物AGO蛋白的功能研究 |
| 1.3.1 AGO蛋白参与植物生长发育 |
| 1.3.2 AGO蛋白参与植物生物和非生物胁迫 |
| 1.4 AGO蛋白的分类研究 |
| 2 植物体胚发生研究进展 |
| 2.1 植物激素对体胚发育的影响 |
| 2.2 植物体胚发生过程的基因表达调控 |
| 2.3 植物体胚发生过程的转录组学研究 |
| 3 龙眼体胚发生的研究进展 |
| 3.1 龙眼体胚发生与植株再生 |
| 3.2 龙眼体胚发生过程的生理生化研究 |
| 3.3 龙眼体胚发生相关基因的克隆及表达分析 |
| 4 植物DNA甲基化的研究进展 |
| 4.1 DNA甲基化概述及DNA甲基化的维持 |
| 4.2 植物中DNA甲基化的特征及分布 |
| 4.3 RNA介导的DNA甲基化途径 |
| 4.4 植物DNA甲基化的作用 |
| 4.4.1 DNA甲基化在植物胁迫中的作用 |
| 4.4.2 DNA甲基化与植物生长发育的关系 |
| 4.4.3 DNA甲基化对植物体胚发生的影响 |
| 5 植物启动子的研究进展 |
| 5.1 植物启动子克隆技术的研究 |
| 5.2 植物启动子功能分析方法 |
| 6 本研究的意义及主要内容 |
| 6.1 研究意义 |
| 6.2 本研究的主要内容 |
| 第二章 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定、生物信息学分析及DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 c DNA的克隆 |
| 第一节 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 龙眼AGO家族成员的鉴定 |
| 1.2.2 龙眼AGO蛋白理化特性分析 |
| 1.2.3 龙眼AGO蛋白磷酸化位点、糖基化位点预测 |
| 1.2.4 龙眼AGO蛋白二级、三级结构预测 |
| 1.2.5 龙眼AGO基因的染色体定位、蛋白保守基序及基因结构分析 |
| 1.2.6 AGO家族氨基酸序列系统进化树的构建 |
| 1.2.7 龙眼AGO蛋白结构域分析 |
| 1.2.8 龙眼AGO蛋白互作预测分析 |
| 1.2.9 调控DlAGOs的 miRNA预测 |
| 1.2.10 DlAGOs在龙眼体胚发生早期的FPKM值分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定 |
| 2.2 龙眼AGO蛋白特性分析 |
| 2.3 DlAGOs蛋白二级、三级结构预测分析 |
| 2.4 DlAGOs蛋白磷酸化位点、糖基化位点预测分析 |
| 2.5 龙眼AGO基因家族染色体定位及基因结构分析 |
| 2.6 龙眼AGO家族的系统进化树分析 |
| 2.7 龙眼AGO蛋白结构域分析 |
| 2.8 DlAGOs蛋白互作网络预测分析 |
| 2.9 调控DlAGOs的 mi RNA预测分析 |
| 2.10 DlAGOs在体胚发生早期的特异表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利用生物信息学推测DlAGOs在龙眼体胚中的可能作用机理 |
| 3.2 AGO蛋白生物学功能多样性的研究 |
| 第二节 龙眼EC中 DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL cDNA全长的克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 1.2.2 引物的设计 |
| 1.2.3 cDNA全长序列的扩增 |
| 1.2.4 目的基因PCR扩增产物的回收和测序 |
| 1.2.5 龙眼DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼EC总RNA的提取 |
| 2.2 龙眼EC中 DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 cDNA全长序列的克隆和分析 |
| 2.3 龙眼DlAGOs氨基酸序列及亲缘关系分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 龙眼胚性愈伤组织AGO基因克隆的意义 |
| 3.2 龙眼DlAGOs UTR对龙眼体胚发生过程可能起着调控作用 |
| 第三章 龙眼DlAGOs启动子的克隆和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 DNA的提取 |
| 1.2.2 龙眼EC中 DlAGOs启动子的克隆 |
| 1.2.3 DlAGOs启动子的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼DlAGOs启动子序列的克隆 |
| 2.2 龙眼DlAGOs启动子CpG岛的预测 |
| 2.3 龙眼DlAGOs启动子转录起始位点和核心启动子区域的预测 |
| 2.4 龙眼DlAGOs启动子功能元件分析 |
| 2.4.1 龙眼DlAGOs启动子序列含有激素响应元件 |
| 2.4.2 龙眼DlAGOs启动子序列中含有光反应元件 |
| 2.4.3 龙眼DlAGOs启动子含有逆境响应元件 |
| 2.4.4 龙眼DlAGOs启动子含有参与分生组织表达、胚乳表达和昼夜节律调控的响应元件 |
| 2.4.5 龙眼DlAGOs启动子序列含有大量功能未知的特异元件 |
| 3 讨论 |
| 3.1 龙眼DlAGOs可能参与激素信号转导 |
| 3.2 龙眼DlAGOs可能参与不同逆境及其它响应调控 |
| 3.3 龙眼DlAGOs启动子“CpG”岛的潜在功能 |
| 第四章 龙眼DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 龙眼材料 |
| 1.1.2 龙眼胚性愈伤组织EC的不同激素处理 |
| 1.1.3 龙眼胚性愈伤组织EC的不同非生物胁迫处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.2.2 DlAGOs家族实时荧光定量PCR引物的合成及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DlAGOs家族在龙眼体胚发生早期阶段的表达分析 |
| 2.2 DlAGOs家族在龙眼合子胚发育过程中的表达分析 |
| 2.3 DlAGOs家族在龙眼不同组织部位的特异性表达分析 |
| 2.4 不同激素处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.1 不同浓度2,4-D处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.2 不同浓度KT处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.3 茉莉酸甲酯(Me JA)处理下龙眼DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.4 水杨酸(SA)处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.5 非生物胁迫处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.1 不同光质处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.2 不同温度处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.3 盐胁迫处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.4 甘露醇处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.5 聚乙二醇-4000 处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.6 脱落酸处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DlAGOs在龙眼体胚与合子胚发育可能发挥相同的作用 |
| 3.2 DlAGOs可能参与调控龙眼胚胎发生发育过程 |
| 3.3 DlAGOs可能参与龙眼种子、叶片和花器官的发育 |
| 3.4 DlAGOs可能响应多种激素的应答 |
| 3.5 DlAGOs可能参与非生物胁迫应答机制 |
| 第五章 龙眼DlAGOs启动子的功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要载体和试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 龙眼DlAGOs启动子表达载体的构建 |
| 1.3.2 重组质粒转化农杆菌和PCR验证 |
| 1.3.3 DlAGOs启动子瞬时转化本氏烟烟草叶片 |
| 1.3.4 DlAGOs启动子瞬时转化烟草叶片的不同激素处理 |
| 1.3.5 GUS活性检测 |
| 1.3.6 DlAGOs启动子瞬时转化龙眼EC |
| 1.3.7 总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 1.3.8 GUS基因相对表达水平的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DlAGOs启动子表达载体的构建 |
| 2.2 瞬时转化烟草叶片的GUS组织化学染色 |
| 2.3 DlAGOs启动子转化烟草叶片驱动GUS基因表达的定量分析 |
| 2.4 不同激素处理下转化烟草叶片的GUS活性测定 |
| 2.5 DlAGOs启动子转化龙眼EC驱动GUS基因表达的定量分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 高等植物启动子的基本结构和作用 |
| 3.2 龙眼DlAGOs可能参与激素调控 |
| 3.3 龙眼遗传转化体系的研究 |
| 第六章 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 的亚细胞定位研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 菌种和载体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 瞬时表达载体构建引物的设计 |
| 1.4.2 目的片段的克隆 |
| 1.4.3 亚细胞定位表达载体的构建 |
| 1.4.4 重组质粒转化农杆菌 |
| 1.4.5 农杆菌侵染转化洋葱内表皮细胞 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼AGO蛋白信号肽和亚细胞定位预测分析 |
| 2.2 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 亚细胞定位融合表达载体的构建 |
| 2.3 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 的亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 3.1 亚细胞定位的研究进展 |
| 3.2 AGO蛋白在植物细胞中亚细胞定位的研究进展 |
| 第七章 5-氮胞苷对龙眼体胚发生早期及DlAGOs表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 不同浓度5-azac的配置 |
| 1.2.2 材料的处理 |
| 1.2.3 龙眼体胚发生早期阶段的形态观察 |
| 1.2.4 总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 5-azac与2,4-D处理对龙眼体胚发生早期和DlAGOs表达的影响 |
| 2.1.1 5-azac与2,4-D处理对龙眼体胚生长状态的影响 |
| 2.1.2 5-azac与2,4-D处理对龙眼早期体胚发生的影响 |
| 2.1.3 5-azac与2,4-D处理对DlAGOs表达的影响 |
| 2.2 低浓度5-azac对龙眼体胚发生的影响和DlAGOs的表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA甲基化水平对龙眼体胚发生的影响 |
| 3.2 2,4-D与5-azac处理对植物体胚发生的影响 |
| 3.3 龙眼AGO基因可能参与DNA甲基化机制 |
| 第八章 5-氮胞苷处理下龙眼体胚发生早期的转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 总RNA的提取、cDNA文库构建与高通量测序 |
| 1.3 测序数据的生物信息学分析 |
| 1.3.1 转录组分析 |
| 1.3.2 基因聚类分析 |
| 1.3.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序数据分析 |
| 2.2 基因表达量水平的分析和差异表达基因的筛选 |
| 2.3 转录因子及植物抗病基因结构域分析 |
| 2.4 差异表达基因的功能富集分析 |
| 2.4.1 差异表达基因GO富集分析 |
| 2.4.2 差异表达基因KEGG富集途径分析 |
| 2.5 5-azac处理下丁酸盐代谢途径相关基因差异表达分析 |
| 2.6 5-azac处理下硫代谢途径相关基因差异表达分析 |
| 2.7 5-azac处理下硒代化合物代谢途径相关基因的差异表达分析 |
| 2.8 5-azac处理下龙眼体胚发生早期差异表达基因的q PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DlAGO4基因在龙眼早期体胚发生的作用 |
| 3.2 DNA甲基化水平降低促进龙眼体胚发生相关基因的表达 |
| 3.3 丁酸盐代谢对植物体胚发育的影响 |
| 3.4 硫代谢对龙眼体胚发生早期的重要作用 |
| 第九章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（5）拟南芥EMB1270调控叶绿体发育的机理研究与PPR蛋白功能分析新方法（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写 |
| 第一章 植物PPR蛋白的研究进展 |
| 1.1 PPR蛋白的进化 |
| 1.2 植物PPR蛋白的结构特点及类型 |
| 1.3 植物PPR蛋白的定位 |
| 1.4 植物PPR蛋白调控细胞器基因的表达 |
| 1.5 Designer PPR蛋白研究进展 |
| 第二章 转录后基因沉默及其应用研究进展 |
| 2.1 转录后基因沉默现象的发现及定义 |
| 2.2 转录后基因沉默的分子机制 |
| 2.3 转录后基因沉默的调控 |
| 2.4 PTGS在植物中的应用 |
| 第三章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料及生长条件 |
| 3.2 菌株和质粒 |
| 3.3 抗生素和主要试剂 |
| 3.4 Gateway体系构建质粒 |
| 3.5 大肠杆菌与农杆菌转化 |
| 3.6 质粒抽提 |
| 3.7 转基因植株的构建 |
| 3.8 拟南芥的杂交 |
| 3.9 叶绿素含量测定 |
| 3.10 DNA提取和聚合酶链式反应(PCR) |
| 3.11 植物总RNA提取、反转录以及定量PCR |
| 3.12 拟南芥原生质体分离和转化 |
| 3.13 EMB1270 蛋白亚细胞定位观察 |
| 3.14 酵母双杂交相互作用蛋白鉴定 |
| 3.15 Northern blot分析 |
| 3.16 叶绿素荧光测定 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 拟南芥PPR蛋白EMB1270 调控叶绿体发育的分子机制研究 |
| 4.1.1 emb1270 突变体鉴定和表型分析 |
| 4.1.2 EMB1270 编码一个叶绿体定位的PPR蛋白 |
| 4.1.3 EMB1270 参与叶绿体内含子的剪接 |
| 4.1.4 EMB1270 与质体剪接因子CFM2和CAF1 之间的相互作用 |
| 4.1.5 EMB1270 突变抑制var2 的斑叶表型以及质体rRNA加工 |
| 4.1.6 EMB1270 调控叶绿体发育机制的讨论 |
| 4.2 胚胎致死型PPR蛋白功能研究方法 |
| 4.2.1 在野生型背景下过表达EMB2279 的突变版本导致叶片黄化 |
| 4.2.2 35S:sot5-m/Col的黄化表型依赖于RDR6 介导的转录后基因沉默途径 |
| 4.2.3 运用共抑制机理研究胚胎致死型PPR蛋白的功能 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 在野生型背景下过表达突变的PPR基因序列可获得呈现明显突变表型的共抑制株系 |
| 4.3.2 一些过表达截短的PPR序列的转基因植株不出现共抑制表型或可见表型的原因分析 |
| 4.3.3 ClpP1和Ycf3 的功能丧失可能是EMB976 敲除突变体中胚胎发育缺陷的原因 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）龙眼miRNA合成途径相关基因的鉴定及DlAGO4功能的初步研究（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 植物miRNA的研究进展 |
| 1.1 植物miRNA的生物合成 |
| 1.2 miRNA 在植物生长发育中的作用 |
| 1.3 植物体胚发生过程中miRNA的研究进展 |
| 2 植物miRNA合成途径相关基因研究进展 |
| 2.1 植物 mi RNA 合成途径主要相关基因研究进展 |
| 2.2 植物 lmi RNA 与 DNA 甲基化 |
| 3 植物 AGO 蛋白研究进展 |
| 4 植物体胚发生研究进展 |
| 5 本实验研究意义及主要内容 |
| 5.1 研究意义 |
| 5.2 研究内容 |
| 第二章 龙眼miRNA合成途径相关基因的鉴定及生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 龙眼miRNA合成途径相关基因的鉴定及基本理化性质 |
| 1.2.2 龙眼miRNA合成途径相关基因结构与染色体定位 |
| 1.2.3 龙眼miRNA合成途径相关基因信号肽预测 |
| 1.2.4 龙眼miRNA合成途径相关基因跨膜螺旋结构 |
| 1.2.5 龙眼miRNA合成途径相关基因保守结构域 |
| 1.2.6 龙眼miRNA合成途径相关基因进化树构建 |
| 1.2.7 龙眼miRNA合成途径相关基因蛋白互作预测 |
| 1.2.8 龙眼体胚发生早期mi RNA合成途径相关基因的FPKM值分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因的鉴定及理化性质分析 |
| 2.2 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因的基因结构及染色体定位分析 |
| 2.3 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因信号肽分析 |
| 2.4 龙眼miRNA合成途径相关基因跨膜螺旋结构预测分析 |
| 2.5 龙眼miRNA合成途径相关基因保守结构域预测分析 |
| 2.6 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因进化树构建 |
| 2.7 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因蛋白互作预测分析 |
| 2.8 龙眼miRNA合成途径相关基因不同阶段特异性表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 龙眼体胚发生早期miRNA合成途径相关基因启动子分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因启动子顺式作用元件分析 |
| 2.1.1 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因 5’调控序列光反应元件分析 |
| 2.1.2 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因 5’调控序列激素响应元件分析 |
| 2.1.3 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因 5’调控序列逆境响应元件分析 |
| 2.1.4 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因 5’调控序列生长发育相关元件分析 |
| 2.1.5 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因 5’调控序列其它元件分析 |
| 2.2 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因启动子 Cp G 岛预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 龙眼miRNA合成途径相关基因可能参与激素信号传导 |
| 3.2 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因可能参与不同逆境胁迫及其他响应调控 |
| 第四章 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因定量表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 龙眼体胚早期三个阶段愈伤组织的获得 |
| 1.1.2 四种激素不同时间处理下愈伤组织的获得 |
| 1.1.3 不同非生物胁迫处理下愈伤组织的获得 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取及第一链c DNA的合成 |
| 1.2.2 qPCR引物设计及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因体胚发生早期不同阶段的表达模式分析 |
| 2.2 龙眼miRNA合成途径相关基因不同激素处理下的表达模式分析 |
| 2.2.1 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因 ABA 激素处理不同时间的表达模式分析 |
| 2.2.2 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因 Me JA 激素处理不同时间的表达模式分析 |
| 2.2.3 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因 SA 激素处理不同时间的表达模式分析 |
| 2.2.4 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因 GA3 激素处理不同时间的表达模式分析 |
| 2.3 龙眼 mi RNA 合成途径相关基因非生物胁迫处理下表达模式分析 |
| 2.3.1 龙眼miRNA合成途径相关基因不同浓度盐胁迫处理的表达模式分析 |
| 2.3.2 龙眼mi RNA合成途径相关基因PEG6000 干旱胁迫处理的表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 DlAGO4的亚细胞定位研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 受体材料 |
| 1.1.2 菌株及载体 |
| 1.1.3 主要实验试剂 |
| 1.1.4 主要实验仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 龙眼总 RNA 提取与第一链 c DNA 的合成 |
| 1.2.2 DlAGO4亚细胞定位预测 |
| 1.2.3 DlAGO4酶切位点分析 |
| 1.2.4 引物设计与合成 |
| 1.2.5 PCR的扩增及产物回收 |
| 1.2.6 载体酶切 |
| 1.2.7 重组载体构建 |
| 1.2.8 重组质粒转化农杆菌感受态 |
| 1.2.9 农杆菌侵染烟草叶片 |
| 1.2.10 亚细胞定位观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的基因酶切位点分析结果 |
| 2.2 目的片段和线性化载体获得 |
| 2.3 重组质粒的鉴定和获得 |
| 2.4 DlAGO4烟草亚细胞定位结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 DlAGO4在龙眼体胚发生早期功能的初步探究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 目标基因靶点 Si RNA 筛选 |
| 1.2.2 DlAGO4基因抑制后龙眼体胚早期细胞形态的观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Dl AGO4 基因靶点 Si RNA 筛选 |
| 2.2 Dl AGO4 基因抑制后龙眼体胚早期细胞形态的观察 |
| 3 讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 在学硕士期间发表论文、获奖及参与学术会议情况 |
| 致谢 |
（7）苋菜AtGAI基因克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 苋菜概况 |
| 2 植物生长发育的影响因素 |
| 2.1 光照 |
| 2.2 温度 |
| 2.3 水分 |
| 2.4 激素 |
| 3 植物DELLA蛋白家族研究进展 |
| 3.1 DELLA蛋白的基本特征 |
| 3.2 DELLA蛋白介导植物激素信号转导 |
| 3.3 DELLA蛋白响应环境信号 |
| 3.4 DELLA蛋白调控植物生长发育 |
| 3.5 DELLA蛋白与次生代谢产物的关系 |
| 4 病毒诱导的基因沉默 |
| 4.1 VIGS技术的作用机制 |
| 4.2 VIGS技术的优缺点 |
| 4.3 VIGS技术的应用现状 |
| 5 本研究的意义与主要内容 |
| 5.1 本研究的意义 |
| 5.2 本研究的主要内容 |
| 第二章 苋菜AtGAI基因克隆与生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 苋菜AtGAI基因的克隆 |
| 2.2 苋菜AtGAI基因生物信息学分析 |
| 2.3 苋菜AtGAI蛋白序列比对及系统进化树分析 |
| 2.4 苋菜AtGAI基因密码子偏好性与进化分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 苋菜AtGAI基因结构分析 |
| 3.2 苋菜AtGAI基因密码子偏好性与进化分析 |
| 第三章 GA_3和PP_(333)处理对苋菜幼苗生长及甜菜色素合成相关基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 外源GA_3和PP_(333)处理对苋菜组培苗生长及甜菜色素合成的影响 |
| 2.2 外源GA_3和PP_(333)处理对苋菜盆栽苗生长及甜菜色素合成的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 GA_3和PP_(333)影响苋菜幼苗生长及甜菜色素合成 |
| 3.2 GA_3 可能通过调控AtGAI基因的表达来影响苋菜幼苗生长及甜菜色素合成 |
| 第四章 温度处理对苋菜幼苗生长及甜菜色素合成相关基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 温度处理对苋菜幼苗形态的影响 |
| 2.2 温度处理对苋菜幼苗甜菜色素含量的影响 |
| 2.3 温度处理对苋菜AtGAI基因及甜菜色素合成相关基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 温度影响苋菜幼苗生长 |
| 3.2 温度影响苋菜甜菜色素的代谢 |
| 第五章 苋菜AtGAI基因的功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pTRV2-AtGAI的载体构建 |
| 2.2 pTRV2-AtGAI、pTRV2-empty及 pTRV1-empty冻融法转化农杆菌检测 |
| 2.3 接种2周后苋菜植株鉴定分析 |
| 2.4 接种2周时喷施外源GA_3处理4d后苋菜植株分析 |
| 3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 小结 |
| 1.1 苋菜AtGAI基因的克隆与生物信息学分析 |
| 1.2 GA_3处理对苋菜幼苗生长及甜菜色素合成相关基因表达的影响 |
| 1.3 PP_(333)处理对苋菜幼苗生长及甜菜色素合成相关基因表达的影响 |
| 1.4 温度处理对苋菜幼苗生长及甜菜色素合成相关基因表达的影响 |
| 1.5 苋菜AtGAI基因的功能分析 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 在读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（8）抗赤霉病RNA干扰片段的鉴定及转玉米VP1基因小麦的抗穗发芽机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 小麦赤霉病及其抗性改良 |
| 1.1.1 赤霉病的发生及危害 |
| 1.1.2 赤霉病致病菌及其防治 |
| 1.1.3 小麦赤霉病抗性 |
| 1.1.4 抗赤霉病转基因小麦 |
| 1.2 小麦穗发芽抗性 |
| 1.2.1 小麦穗发芽的危害 |
| 1.2.2 小麦穗发芽抗性的遗传基础 |
| 1.2.3 脱落酸对穗发芽的调控作用 |
| 1.2.4 Vp1基因在脱落酸调控网络中的作用 |
| 1.2.5 小麦Vp1基因错拼与穗发芽的关系 |
| 1.2.6 外源Vp1基因对小麦Vp1基因功能的补偿作用 |
| 1.2.7 小麦转录组研究 |
| 1.2.8 小麦蛋白组研究 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 小麦材料 |
| 2.1.2 真菌和细菌菌株及载体 |
| 2.1.3 培养基及相关试剂 |
| 2.1.4 PCR扩增引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 双链RNA(ds RNA)体外转录 |
| 2.2.2 双链RNA细菌表达 |
| 2.2.3 双链RNA抑菌作用分析 |
| 2.2.4 农杆菌转化及阳性转化子的鉴定 |
| 2.2.5 小麦农杆菌遗传转化 |
| 2.2.6 小麦基因组DNA的提取(CTAB法) |
| 2.2.7 PCR鉴定 |
| 2.2.8 接种鉴定赤霉病抗性 |
| 2.2.9 毒素测定 |
| 2.2.10 转玉米Vp1基因小麦穗发芽抗性及转录组分析 |
| 2.2.11 转玉米Vp1 基因小麦的iTRAQ测序和蛋白组分析 |
| 2.2.12 qRT-PCR验证转玉米Vp1 基因小麦的RNA转录组结果 |
| 2.2.13 转玉米Vp1基因小麦的蛋白组和转录组相关性分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗赤霉病RNAi片段的筛选与鉴定 |
| 3.1.1 赤霉菌几丁质合酶基因双链RNA的抑菌活性 |
| 3.1.2 赤霉菌葡聚糖合酶基因双链RNA的抑菌活性 |
| 3.1.3 赤霉菌二型肌球蛋白基因双链RNA的抑菌活性 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 转几丁质合酶基因RNAi片段小麦抗赤霉病研究 |
| 3.2.1 转Lem2 驱动的Chs7-3-Chs7-4 片段小麦的筛选与鉴定 |
| 3.2.2 转Ubiquitin驱动的Chs7-3-Chs7-4 片段小麦的筛选与鉴定 |
| 3.2.3 小结 |
| 3.3 转Ubiquitin驱动的不同赤霉菌基因RNAi片段小麦的获得与鉴定 |
| 3.3.1 农杆菌转化子的PCR鉴定 |
| 3.3.2 转Ubiquitin驱动的不同赤霉菌基因RNAi片段小麦的获得 |
| 3.3.3 转Ubiquitin驱动的不同赤霉菌基因RNAi片段小麦的鉴定 |
| 3.3.4 转Ubiquitin驱动的不同赤霉菌基因RNAi片段小麦的抗赤霉病性鉴定 |
| 3.3.5 小结 |
| 3.4 转玉米Vp1基因小麦穗发芽抗性的转录组和蛋白组分析 |
| 3.4.1 转Vp1基因小麦的分子鉴定和穗发芽抗性鉴定 |
| 3.4.2 转Vp1基因小麦在种子发育过程中基因表达和蛋白质含量的变化 |
| 3.4.3 差异基因和差异蛋白的功能分析 |
| 3.4.4 转录后调控是Vp1基因调控小麦内源基因表达的重要方式 |
| 3.4.5 Vp1基因调控了小麦种子发育过程中大量响应和调节基因的表达及蛋白质合成 |
| 3.4.6 转Vp1基因提高了小麦种子发育后期贮藏蛋白的含量 |
| 3.4.7 Vp1基因调控了小麦种子发育过程中多种酶抑制因子和脱水素基因的表达 |
| 3.4.8 Vp1基因调节脱落酸合成和信号传导 |
| 3.4.9 Vp1基因参与了小麦种子发育过程中脱落酸与其它植物激素的交互作用 |
| 3.4.10 小结 |
| 4 讨论 |
| 4.1 赤霉菌基因组中具有抑制赤霉菌的RNAi片段 |
| 4.2 具有抑菌作用的RNAi片段能提高植物抗病能力 |
| 4.3 颖壳特异启动子在小麦赤霉病抗性改良中的应用 |
| 4.4 小麦品种的遗传背景影响RNAi片段抗病作用 |
| 4.5小麦抗穗发芽基因资源Vp1 |
| 4.6 Vp1基因对小麦种子发育进程无显着影响 |
| 4.7 Vp1基因通过多种方式调控小麦内源基因的表达 |
| 4.8 Vp1基因可能处于小麦种子发育过程中脱落酸与其它植物激素交互作用的重要节点上 |
| 4.9 Vp1基因在小麦种子发育后期增强脱落酸调控效果 |
| 4.10 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）SLCCNV和MNSV侵染性克隆的构建及致病因子鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 侵染我国葫芦科作物病毒种类 |
| 1.2 SLCCNV研究背景 |
| 1.2.1 双生病毒的发生与为害 |
| 1.2.2 双生病毒分类及基因组结构 |
| 1.2.3 Begomovirus基因组特征及为害 |
| 1.2.4 SLCCNV生物学特征及研究现状 |
| 1.3 MNSV研究背景 |
| 1.3.1 分类地位、特性与分布 |
| 1.3.2 病毒编码的基因及其致病性 |
| 1.3.3 病毒在细胞间的移动 |
| 1.3.4 病毒传播因素 |
| 1.3.5 植物抗病毒研究 |
| 1.3.6 寄主植物响应MNSV入侵的应答反应 |
| 1.4 侵染性克隆载体的构建及应用 |
| 1.4.1 植物病毒侵染性克隆载体构建 |
| 1.4.2 植物病毒侵染性克隆的应用 |
| 1.5 病毒编码的沉默抑制子 |
| 1.5.1 基因沉默 |
| 1.5.2 病毒编码的RNA沉默抑制子及其作用原理 |
| 1.6 本研究的意义及内容 |
| 第二章 SLCCNV侵染性克隆的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 田间甜瓜病叶检测 |
| 2.3.2 基因组结构 |
| 2.3.3 基因重组分析 |
| 2.3.4 系统进化分析 |
| 2.3.5 侵染性克隆致病性鉴定及烟粉虱传染 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 AC5是SLCCNV编码的致病因子 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 AC5系统进化分析 |
| 3.3.2 AC5的C端激发过敏性坏死反应 |
| 3.3.3 AC5是SLCCNV的致病因子 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SLCCNV AC5沉默抑制功能及其沉默机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 AC5抑制局部沉默 |
| 4.3.2 AC5抑制沉默信号的系统运输 |
| 4.3.3 AC5的C端决定沉默活性 |
| 4.3.4 AC5不抑制双链dsRNA沉默 |
| 4.3.5 AC5沉默在蛋白水平起作用 |
| 4.3.6 核定位信号与PTGS关系 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 携带GFP的 MNSV侵染性克隆重组载体构建 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 5'端和3'端序列分析 |
| 5.3.2 MNSV基因组序列及编码蛋白 |
| 5.3.3 MNSV基因组聚类分析 |
| 5.3.4 侵染性克隆载体的构建 |
| 5.3.5 携带GFP的 MNSV侵染性克隆重组载体 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 MNSV p42与寄主因子互作筛选 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 p42基因致病力鉴定 |
| 6.3.2 p42突变体致病力分析 |
| 6.3.3 整株甜瓜cDNA文库评价 |
| 6.3.4 p42与寄主因子互作筛选 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文结论及后续研究设想 |
| 7.1 全文结论 |
| 7.2 后续研究设想 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:部分载体图谱 |
| 附录Ⅱ:部分试剂 |
| 附录Ⅲ:本研究所用引物 |
| 附录Ⅳ:作者简介 |
| 附录Ⅴ:攻读博士研究生阶段的成绩 |
| 致谢 |
（10）多组学研究水稻幼苗响应镉胁迫的分子机制（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物镉胁迫研究进展 |
| 1.1.1 镉污染的现状和来源 |
| 1.1.1.1 镉污染的现状 |
| 1.1.1.2 镉污染的来源 |
| 1.1.2 镉对植物及人的危害 |
| 1.1.2.1 镉胁迫对植物生长的影响 |
| 1.1.2.2 镉对植物矿质元素及水分代谢的影响 |
| 1.1.2.3 镉胁迫对植物叶绿体结构和光合系统的影响 |
| 1.1.2.4 镉胁迫对植物的活性氧自由基及抗氧化保护系统的影响 |
| 1.1.2.5 镉对人的危害 |
| 1.1.3 植物对镉的吸收、富集和转运机理 |
| 1.1.3.1 镉进入根表皮层的途径 |
| 1.1.3.2 镉进入根木质部的途径 |
| 1.1.3.3 镉进入地上组织的途径 |
| 1.1.3.4 镉通过共质体途径转运的调控机制 |
| 1.1.3.5 镉通过质外体途径转运的机理 |
| 1.1.4 影响镉吸收和转运的因素 |
| 1.1.4.1 土壤的氧化还原势 |
| 1.1.4.2 土壤的PH |
| 1.1.4.3 土壤有机质 |
| 1.1.4.4 植物营养 |
| 1.1.4.5 水稻品种 |
| 1.1.4.6 根表面Fe氧化膜 |
| 1.1.5 植物对镉耐受性及解毒机理 |
| 1.1.5.1 限制镉进入植物体内 |
| 1.1.5.2 镉的螯合和区室化 |
| 1.1.5.3 激活植物体内抗氧化防御系统 |
| 1.1.5.4 金属硫蛋白 |
| 1.1.5.5 抗逆蛋白 |
| 1.1.5.6 信号 |
| 1.1.5.7 转录因子和miRNA |
| 1.2 组学技术及其在水稻逆境中的研究进展 |
| 1.2.1 植物逆境胁迫的转录组学研究进展 |
| 1.2.1.1 转录组学的概念 |
| 1.2.1.2 转录组学的研究方法和技术手段 |
| 1.2.1.3 转录组学在重金属胁迫中的应用研究进展 |
| 1.2.2 植物逆境胁迫的miRNA组学研究进展 |
| 1.2.2.1 miRNA的概念 |
| 1.2.2.2 miRNA的功能 |
| 1.2.2.2.1 转录基因沉默(TGS) |
| 1.2.2.2.2 转录基因激活(TGA) |
| 1.2.2.2.3 转录后调控 |
| 1.2.2.2.4 miRNA对靶基因的网络调控 |
| 1.2.2.3 miRNA研究方法和技术手段 |
| 1.2.2.4 miRNA靶标基因鉴定方法和技术手段 |
| 1.2.2.5 miRNA在重金属胁迫中的应用研究进展 |
| 1.2.3 植物逆境胁迫的磷酸蛋白组学研究进展 |
| 1.2.3.1 磷酸蛋白质概念 |
| 1.2.3.2 磷酸蛋白质的作用 |
| 1.2.3.3 磷酸化蛋白与信号转导 |
| 1.2.3.4 磷酸蛋白组学研究方法 |
| 1.2.3.5 植物逆境胁迫磷酸蛋白质组学研究进展 |
| 1.3 本研究的目的、内容和意义 |
| 第二章 水稻幼苗镉胁迫下的转录组、miRNA组和降解组学研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 Cd含量测定 |
| 2.1.3 水稻组织总RNA的提取 |
| 2.1.4 RNA反转录 |
| 2.1.5 荧光实时定量PCR |
| 2.1.5.1 cDNA的准备 |
| 2.1.5.2 引物设计 |
| 2.1.5.3 准备反应体系 |
| 2.1.5.4 结果分析 |
| 2.1.6 RNA-seq |
| 2.1.6.1 Total RNA样品检测 |
| 2.1.6.2 mRNA文库构建及库检 |
| 2.1.6.3 上机测序 |
| 2.1.6.4 数据生物信息分析 |
| 2.1.7 miRNA组 |
| 2.1.7.1 miRNA提取 |
| 2.1.7.2 miRNA质量检测浓度测定 |
| 2.1.7.3 miRNA3’端进行加“PolyA”处理 |
| 2.1.7.4 PolyA化的RNA进行反转录反应 |
| 2.1.7.5 反转录反应 |
| 2.1.7.6 荧光实时定量PCR |
| 2.1.7.6.1 miRNA检测引物设计遵循以下原则 |
| 2.1.7.6.2 miRNA引物设计方法 |
| 2.1.7.6.3 qRT-PCR反应 |
| 2.1.7.6.4 结果分析 |
| 2.1.7.7 miRNA文库构建及库检 |
| 2.1.7.8 数据生物信息分析 |
| 2.1.8 降解组 |
| 2.1.8.1 构建降解组文库 |
| 2.1.8.2 数据生物信息分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Cd~(2+)胁迫对水稻幼苗的表型影响 |
| 2.2.2 水稻幼苗响应Cd胁迫的基因及其功能分析 |
| 2.2.3 水稻幼苗响应Cd胁迫的miRNAs |
| 2.2.4 响应Cd胁迫的miRNA与其靶向基因之间的调空网络 |
| 2.2.5 响应镉胁迫的差异表达miRNA的靶标基因的功能富集分析 |
| 2.2.6 miRNA与其靶标基因之间的相关性分析 |
| 2.2.7 水稻幼苗响应Cd胁迫的代谢途径 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 水稻幼苗中响应Cd胁迫的miRNA |
| 2.3.2 响应Cd胁迫的信号途径 |
| 2.3.3 响应Cd胁迫的泛素通路分析 |
| 2.3.4 从光合作用角度分析Cd反应途径 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 水稻幼苗镉胁迫下的磷酸蛋白组学研究 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 Cd含量测定 |
| 3.1.3 总蛋白的提取 |
| 3.1.4 总蛋白质含量测定 |
| 3.1.5 还原烷基化和酶解 |
| 3.1.6 TMT标记 |
| 3.1.6.1 TMT定量原理 |
| 3.1.6.2 TMT标记流程 |
| 3.1.7 磷酸化富集 |
| 3.1.8 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析 |
| 3.1.9 磷酸肽和磷酸蛋白的鉴定 |
| 3.1.10 生物信息学 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Cd胁迫对水稻幼苗表型和生理的影响 |
| 3.2.2 磷酸蛋白及磷酸化位点的鉴定 |
| 3.2.3 磷酸蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.4 与磷酸化相关的肽段 |
| 3.2.5 差异表达磷酸蛋白的鉴定 |
| 3.2.6 差异化表达磷酸蛋白的功能分析 |
| 3.2.7 差异化表达磷酸蛋白基因的转录组表达量分析 |
| 3.2.8 差异化磷酸蛋白间的互作 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 信号转导相关的磷酸蛋白 |
| 3.3.2 逆境相关的磷酸化转录因子 |
| 3.3.3 抗逆磷酸化蛋白 |
| 3.3.4 抗氧化自由基相关的磷酸化蛋白 |
| 3.3.5 与水和离子转运相关的磷酸蛋白 |
| 第四章 全文结论与创新之处 |
| 4.1 全文结论 |
| 4.2 本研究的创新之处 |
| 4.3 本研究中的不足 |
| 参考文献 |
| 附录 附表1 qRT-PCR分析的引物序列 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、植物中转录后基因沉默的启动、传导与抑制（论文参考文献）
- [1]葡萄霜霉菌CRN效应因子鉴定与功能分析[D]. 向高青. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]水稻条纹病毒调控寄主Ferredoxin 1基因表达的机制研究[D]. 崔维军. 浙江大学, 2021(01)
- [3]中国小麦花叶病毒诱导下长链非编码RNA的表达、鉴定及作用机制研究[D]. 郑蔚然. 湖南农业大学, 2020(01)
- [4]龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析[D]. 陈荣珠. 福建农林大学, 2020
- [5]拟南芥EMB1270调控叶绿体发育的机理研究与PPR蛋白功能分析新方法[D]. 陈景丽. 上海师范大学, 2020(07)
- [6]龙眼miRNA合成途径相关基因的鉴定及DlAGO4功能的初步研究[D]. 霍雯. 福建农林大学, 2020
- [7]苋菜AtGAI基因克隆及功能分析[D]. 赵春丽. 福建农林大学, 2020
- [8]抗赤霉病RNA干扰片段的鉴定及转玉米VP1基因小麦的抗穗发芽机理[D]. 杨鹏. 华中农业大学, 2019(01)
- [9]SLCCNV和MNSV侵染性克隆的构建及致病因子鉴定[D]. 吴会杰. 华中农业大学, 2019
- [10]多组学研究水稻幼苗响应镉胁迫的分子机制[D]. 钟敏. 江西农业大学, 2019(07)