一、烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达（论文文献综述）
余道兵,程学松,王群,史艳可,张昕[1]（2018）在《植酸酶基因的定点突变及其在巴斯德毕赤酵母表面展示》文中研究指明为解决植酸酶在制粒过程中易变性失活的问题,以黑曲霉（Aspergillus niger）ZJUY中的植酸酶基因phy A为亲本,借助聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）介导的定点突变,对植酸酶基因的关键位点进行密码子优化、引入氢键以及二硫键Cys196-Cys446的缺失突变;凭借无缝克隆成功将锚定片段FS和携带标签Flag的目的片段phy A插入酵母表达载体pPICZαC中;采用氯化锂转化法,将构建的8个表达载体pPICZαC-FS/phy A通过同源重组的方式整合到巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii）GS115基因组上。细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测证实,基因改良后的植酸酶在巴斯德毕赤酵母细胞表面成功展示。重组菌株A31、A61和A84的植酸酶活性均可达7 000 U/g。与分泌型植酸酶相比,展示酶具有更好的高温和酸碱耐受性,其中菌株A61在90℃水浴处理1h后仍有18%的酶活,在pH 1.64.0范围内,残余酶活保持在80%以上。菌株A61这一特性可以克服制粒过程中（6090℃）植酸酶变性失活的不足,能够较好地满足动物饲料用酶的需求。
苗华彪[2]（2017）在《基于计算机辅助设计改造饲用植酸酶、木聚糖酶酶学特性的研究》文中研究表明植酸酶和木聚糖酶是两种广泛使用的酶制剂,可应用到饲料、食品、造纸、环境治理等生产过程中。在上述产业中,植酸酶和木聚糖酶在饲料工业中的应用最为成熟,为饲料工业的可持续发展提供了高效、节粮、环保等保障。为了进一步降低生产成本并提高酶的应用性能,本研究结合计算模拟技术和定点突变技术,对两种酶制剂的酶学性质进行改造。首先,针对各个蛋白的空间结构或结构参数进行比较、分析,寻找可能改变其酶学性质的突变位点;随后,利用定点突变技术、构建表达载体、发酵突变蛋白、测定突变蛋白的酶学特性;最后,利用分子动力学模拟阐明其酶学性质改变机制。本研究对植酸酶和木聚糖酶分别进行如下改造:1.来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的植酸酶（phy-N）酶活高,但热稳定性较差;而烟曲霉（Aspergillus fumigatus）植酸酶（phy-F）热稳定性良好,但酶活相对较低。如果能够将二者优势叠加,将有利于植酸酶的应用和推广。（1）本研究首先将两种植酸酶phy-N和phy-F进行三维结构的超级叠加（superimpose）,计算其相对应原子的距离,结果发现有三部分（Glu35-Ser42,Gly163-Arg168和Arg248-Ser254）氨基酸序列的距离偏差?4?。因此,首次对这三部分共18个氨基酸残基进行复合突变,获得突变型植酸酶phy-N-18,并对比野生型和突变型植酸酶的酶学特性:突变型植酸酶phy-N-18及野生型phy-N的最适温度均为50℃,高于55℃时酶活力迅速下降,均属于中温酶;phy-N-18的最适pH为6.0,较phy-N提高了0.5个单位,pH稳定性研究表明phy-N-18较phy-N具有更宽的作用范围;phy-N-18的热稳定性较phy-N有良好的改良,在高温环境下（70℃,80℃,90℃）,分别对其进行长时间耐受,phy-N-18相对剩余活力高于phy-N:在70℃、80℃和90℃下处理两种植酸酶1小时,phy-N-18比phy-N的相对剩余活力提高了20.3%、19.8%和3.4%;此外,将phy-N-18与10种市场在售的植酸酶产品进行热稳定性比较,phy-N-18的热稳定性处于中等水平,但较phy-N已有大幅提升。我们获得了一株热稳定性有所改良的植酸酶phy-N-18,实验显示突变的18个位点能够提高植酸酶phy-N热稳定性。（2）实验证明植酸酶phy-N-18的热稳定性较野生型phy-N有所提高。然而,我们并不清楚具体哪些突变位点在18个突变位点中起主要作用。因此,利用分子动力学模拟技术对野生型和突变型植酸酶分别进行两个温度（50℃和70℃）的模拟分析,通过扫描18个位点在野生型和突变型植酸酶中与其它氨基酸的相互作用,我们发现在突变型植酸酶phy-N-18中有9个氨基酸与周围的氨基酸残基形成的氢键概率显着高于野生型中这9个位点氢键形成的概率。因此,我们将目光集中于这9个位点,将野生型植酸酶phy-N进行定点突变和克隆表达,获得突变型植酸酶phy-N-9,其酶学特性研究如下:植酸酶phy-N-9的温度适应性与phy-N及phy-N-18一致;其pH适应性与phy-N-18一致;phy-N-9的热稳定性较phy-N-18及phy-N有更高的提升,在70℃、80℃和90℃条件下处理1小时,phy-N-9的相对剩余酶活比phy-N-18分别提高14.1%、17.2%和25.9%,相比phy-N更是提高了34.4%、37.0%和29.3%;而phy-N-9相比10种市场在售的植酸酶产品,其热稳定性居于领先水平,明显好于phy-N-18;然而,突变型植酸酶phy-N-9和phy-N-18的催化效率相对野生型phy-N有所下降,分别下降60.0%和68.0%,此现象有待进一步的研究。2.来源于Neocallimastix patriciarum木聚糖酶Xyn CDBFV是一种市场上广泛应用的耐热木聚糖酶,然而面对木聚糖酶在工业生产中尤其是高温环节的需求,改造其酶学性质得到耐热性更强木聚糖酶仍是一项艰巨的任务。已知,来自Nonomuraea flexuosa耐热木聚糖酶NFX具有极高耐热性。因此,我们通过比对XynCDBFV和NFX晶体结构中的温度因子（B-factor）参数,发现相比于NFX,XynCDBFV的C端序列（207-NGGA-210）极不稳定。通过多序列比对,我们首次发现不论是细菌来源的还是真菌来源的木聚糖酶在C端有一段保守的序列（207-SSGS-210）,因此我们将XynCDBFV的207-NGGA-210氨基酸利用定点突变技术突变为207-SSGS-210（N207S,G208S,A210S）一个带有三个突变位点的突变型木聚糖酶Xyn-MUT,并构建真核表达载体,对其发酵、纯化并研究野生型与突变型木聚糖酶酶学特性,如下:热稳定性研究表明,在70℃、80℃和90℃条件下处理木聚糖酶1小时,Xyn-MUT的相对剩余酶活比XynCDBFV分别提高了5.8%、14.2%和7.5%;动力学研究显示:Xyn-MUT的催化效率较XynCDBFV提高了0.6倍。突变型木聚糖酶Xyn-MUT相比XynCDBFV的耐热性有显着提高,为了在分子层面阐述其耐热机理,我们在65℃和80℃分别对二者进行分子动力学模拟,模拟分析发现:Xyn-MUT中的S210和S208相比与XynCDBFV中的A210和G208能够形成更多的氢键;同时Xyn-MUT中207-SSGS-210形成β折叠的倾向性更高。本研究为第一例通过改造木聚糖酶的C端序列来提高其热稳定性的研究,为今后木聚糖酶的改造提供了新思路。综上,利用计算机辅助设计和定点突变技术,我们获得了一株较野生型热稳定提高约30.0%、pH适应范围更广的突变型植酸酶phy-N-9和一株较野生型热稳定性提高约10.0%、催化效率提高0.6倍的突变型木聚糖酶Xyn-MUT,这两株突变酶能够更好地应用到饲料工业及其他相关产业。
李丁[3]（2016）在《新型无抗多拷贝毕赤酵母表达平台的构建及新壳聚糖酶基因的重组表达》文中认为毕赤酵母（Pichia pastoris）具有较强的胞外表达能力,可以在由甲醇和无机盐组成的简单培养基中进行高密度发酵,因而被广泛应用于各种重组蛋白的工业化生产。生产过程中对重组菌株的改造主要通过提高外源基因在宿主体内的拷贝数,以及共表达分子伴侣来实现。鉴于酵母细胞提供的有限种类的筛选压力使重组质粒不能反复整合到基因组上,因此研发出一种利用单一抗性即可多次编辑基因组的表达载体具有重要意义。本研究建立了一种可以快速获得高拷贝无抗性酵母表达平台的方法。其原理在于含有多拷贝外源基因的表达质粒整合到酵母基因组上后,质粒上携带的抗性基因可以被甲醇诱导的Cre重组酶删除。产生的无抗性酵母转化子可以接受下一轮表达质粒的整合,并最终实现利用单一抗性提高外源基因的拷贝数。构建该质粒时发现,甲醇诱导的AOX启动子可以被大肠杆菌识别并起始Cre重组酶的表达,使质粒内部发生重组,Cre表达元件被删除。本研究将lacO基因插入到AOX启动子和CRE基因之间,控制了 Cre重组酶在大肠杆菌中的泄漏表达,从而完成了新型毕赤酵母表达载体pMC-GAPα和pMC-AOXα的构建。大肠杆菌的植酸酶AppA是一种耐热植酸酶,在饲料行业中具有潜在产业化前景,但低表达量限制了该酶的工业化生产。利用构建的表达载体,以appA为报告基因,检测pMC系列质粒对AppA在毕赤酵母中表达的改善效果。检测结果显示目的蛋白的产量对基因的剂量有依赖性,呈现出正相关性,该结论对于GAP启动子和AOX启动子都适用。GAP组12拷贝转化子与1拷贝转化子相比,酶活产量提高2.90倍,AOX组12拷贝转化子的酶活与对照相比则提高4.45倍,达到了目前产业化表达水平。当插入的外源基因拷贝数超过一定界限时,由于宿主体内的分子伴侣有限,相当部分的新生肽链不能正确折叠从而被靶向至内质网相关降解途径降解（ERAD）,因此出现了基因拷贝数升高,酶活反而下降的现象。横向比较相同基因剂量条件下GAP组和AOX组启动子的表达水平,发现AOX组的1、2、4个拷贝的表达水平均低于GAP组相应拷贝数的表达水平,但8拷贝和12拷贝的表达水平高于GAP组。此结果证实单拷贝条件下GAP启动子有较高的转录启始效率,同时,高拷贝水平上GAP组较低的酶活水平,提示着GAP和AOX启动子在“启动子的识别与调控”方面存在着差异。以上研█究说明pMC系列表达质粒可以有效提高外源基因的基因剂量,进而提高目的蛋白的表达量。酵母是工业生产中常用的表达宿主,在培养基中使用廉价的碳源可以有效控制生产成本。糖蜜是以蔗糖为主要成分的工业副产物,可以作为廉价碳源添加到酵母培养基中。由于毕赤酵母无法直接利用蔗糖,本研究将来源于酿酒酵母的蔗糖酶基因SUC2插入到GAP为启动子的多拷贝转化子中,以期使其获得利用蔗糖的能力,在廉价的培养基中高效表达目的蛋白。结果显示,SUC2导入到毕赤酵母转化子后虽使其获得了以蔗糖为碳源进行生长的能力,但植酸酶的酶活产量降低了 41.3%,推测其原因为α-Factor和SUC2的信号肽发生干扰。在实现酵母重组表达的工业用酶中,关于壳聚糖酶和几丁质酶的报导也有很多。这两种酶在植物真菌性病害的生物防治中都具有一定的应用潜力。Aquabacterium sp.A7-Y是本实验室分离的一株新菌,其基因组上存在9个几丁质降解相关的基因序列。本研究首先在大肠杆菌中重组表达了以上糖苷水解酶,其中两个壳聚糖酶检测到了相关活性,将其分别命名为ChoA和ChoB。ChoA的原始核苷酸序列全长1404 bp,编码467个氨基酸,预测蛋白大小为50.7kDa,其中前23个氨基酸是信号肽序列。ChoA与来源于Thermobifida fusca的内切葡聚糖酶的相似性为61%。ChoB的原始核酸序列全长1551 bp,编码516个氨基酸,预测蛋白大小为57.68 kDa,不含信号肽序列。ChoB与来源于Streptomyces sp.Sirexaa-e的壳聚糖酶的相似性为73%。将去掉信号肽的ChoA和ChoB在E.coli BL21（DE3）中进行重组表达,利用Ni2+-NTA亲和层析获得纯化重组蛋白ChoB;通过在ChoA的N端加上6个赖氨酸,提高了其表达量,并获得了 ChoA的纯化蛋白。对二者进行相关酶学特性的分析,结果显示ChoA的比酶活为18.53 U·mg-1,ChoB的比酶活为13.18 U·mg-1;二者的最适反应pH均为5.0,最适反应温度都是40℃。相比ChoB而言,ChoA的热稳定性更高,对DMF和SDS以外的供试化学试剂更不敏感。在底物特异性和水解产物特异性方面,ChoA不仅可以水解壳聚糖,还可以水解羧甲基纤维素钠,ChoB只能专一性水解壳聚糖。ChoA水解壳聚糖的终产物为三、四、五、六糖,而ChoB的水解终产物为壳二糖和壳三糖。真菌对峙实验结果表明ChoB不能显着抑制供试的两种植物病原真菌的生长,而ChoA可对黄瓜枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum sp.cucmrium）产生一定的抑制效果。由于壳聚糖酶具有一定的应用价值,而之前的实验证实pMC系列表达载体可以提高目的蛋白的表达量,故将choA和choB克隆到pMC载体并进行酵母重组表达,以期得到大量的蛋白来满足后续研究的需要。酶活测量结果显示,choA转化子的发酵液上清中的酶活产量为0.178 U·mL-1,而choB转化子的发酵液上清中检测不到相应活性。构建choA的多拷贝转化子以提高目的蛋白的产量,结果显示当choA的拷贝数为4个时其酶活产量最高（达到0.324 U·mL-1）,是1拷贝转化子的1.82倍。将来源于 P.pastoris 的 PDI、ERO1、BIP、HAC1、SSA1 基因,和来源于S.cerevisiae 的 YDJ1、SSA4、SSE1、SSO1、SSO2基因与choA共表达（这10个分子伴侣均被报导可以提高目的蛋白的产量）,结果显示 PDI、ERO1、HAC1、YJD1、SSA4、SSE1、SSO2 对 choA的表达均具有不同程度的促进作用,对GAP-1-choA（含有1个拷贝的转化子）分别提高了 31%、16%、17%、21%、15%、24%和 11%,对 GAP-choA（含有 4 个拷贝的转化子）则分别提高了 80%、30%、38%、31%、21%、36%和21%。将除了HAC1以外的6个分子伴侣陆续构建到一个质粒上,与choA共表达,并且提高choA的拷贝数,发现优化后ChoA的表达量为2.319 U·mL-1,是未优化前的13.03倍,提示“复合型”优化策略可以更高效的提高目的蛋白的表达量。综合以上研究,密码子优化、不同的启动子与信号肽的组合、构建多拷贝宿主和共表达分子伴侣等措施的综合使用,可以有效提高目的蛋白的表达量。而本研究获得的pMC系列表达载体可以实现无抗生素抗性的高拷贝酵母转化子,以及无抗生素抗性的共表达分子伴侣的酵母转化子的快速构建,因而具有广泛的应用前景。
陆益新[4]（2016）在《隔孢伏革菌植酸酶在毕赤酵母中的高效表达研究》文中进行了进一步梳理植酸酶作为在饲料添加剂添加于单胃动物饲料中,可提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收率,并减轻动物粪便中磷对环境的污染,植酸酶的喂养效果已得到了确认,因此具有极高的应用价值,但植酸酶在天然材料中含量太低,难以获得大量产品,价格昂贵；同时酶的热稳定性难以完全满足饲料加工的要求。因此,提高植酸酶基因的表达水平,改善植酸酶的稳定性是一个函待解决的问题。本研究按照毕赤酵母对遗传密码子的偏好性,利用重叠PCR方法人工合成6-phyA,将其插入到pPIC9K载体,构建成6-phyA整合型毕赤酵母表达载体,通过电转化转入GS115酵母细胞,并筛选出Mur高拷贝转化子,建立了隔孢伏革菌植酸酶分泌表达量高的毕赤酵母株。主要结果如下：1.根据GenBank隔孢伏革菌植酸酶编码序列成功合成34条引物,并利用重叠延伸PCR技术合成了6-PhyA基因。对合成的植酸酶序列进行了毕赤酵母密码子嗜好性分析,结果较为理想,经软件分析,其翻译为氨基酸序列与野生型100%同源。2-通过对信号肽的选择开展研究,试图通过6-PhyA本身的信号肽与仪信号肽相融合,以促进植酸酶的表达,但是效果不理想,通过用酿酒酵母细胞研究6-PhyA野生型信号肽作用,发现在强启动子GPD的驱动下,未发现其能介导6-PhyA在酿酒酵母细胞中的表达,由此证明,野生型信号肽的存在并不能促进植酸酶的表达。3.将植酸酶基因克隆到表达载体pPIC9K中,电击化转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/L6ph。经甲醇诱导72h后,产酶量达到最高峰,酶活力达到23.7U/mL,实现了植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达。4.对植酸酶酶学性质的研究表明,SDS-PAGE分析表明表达植酸酶的分子量为50 kD左右。PhyA植酸酶最适温度为37-C,最适pH值为5.5,适合单胃动物的消化道环境；在55℃作用60min后,残余酶活是味保温处理的样品活性的44%,超过55℃保温处理,酶活急剧下降；金属离子对植酸酶的活性没有影响。
陆益新,王瑞鲲,田永杰,吴倩倩,李湘鸣[5]（2015）在《密码子优化的隔孢伏革菌植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达》文中研究表明本研究目标是建立隔孢伏革菌植酸酶（6-phy A）分泌表达量高的毕赤酵母株,其作为饲料添加剂,可促进单胃类动物消化道对饲料磷的吸收,减少家畜粪便中磷对环境的污染,又可满足饲料加工的需要。按照毕赤酵母对遗传密码子的偏好性,利用重叠P CR方法人工合成6-phy A,将其插入到p PIC9K载体,构建成6-phy A整合型毕赤酵母表达载体,通过电转化转入G S115酵母细胞,并筛选出M ut+高拷贝转化子。通过S DS-PAGE分析,发现在该酵母细胞克隆株的发酵液中,见有一明显6-phy A条带,经测表达产物酶活性,发现均为对照酵母株的7.5倍以上,说明6-phy A在所构建的毕赤酵母株中成功、有效的表达。
王磊[6]（2014）在《转植酸酶和内切葡聚糖酶基因乳酸杆菌的构建及其肉鸡饲喂效果验证》文中提出β-葡聚糖和植酸（盐）是单胃动物日粮中主要的两种抗营养因子，对蛋白质、脂类、矿物质离子等营养素均具有极强的吸附和螯合能力，同时单胃动物（如猪和家禽）胃肠道缺乏或很少分泌β-葡聚糖和植酸降解酶，导致一些营养素的消化和吸收率降低，大量营养素被排泄到体外，造成对环境的污染。在实际生产中，通过添加外源性饲料酶制剂可在一定程度上消除这两种抗营养因子的不良影响，但也增加了饲料成本，且只能取得短期的效应，同时在饲料制粒过程中，酶制剂易因高温而失活；因此运用基因工程技术，构建能够表达和分泌水解酶类的乳酸杆菌重组菌，将是一种可替代的和廉价的策略。本研究的目的在于从自然界中筛选具有高植酸酶活性或内切葡聚糖酶活性的菌株，并克隆其对应的植酸酶基因和内切葡聚糖酶基因，同时从肉鸡肠道内筛选和鉴定优势益生乳酸杆菌作为宿主菌，通过基因工程技术将两个酶基因同时克隆到乳酸杆菌中，构建既具有益生特性又具有植酸酶活性和内切葡聚糖酶活性的多功能转基因乳酸杆菌，以低有效磷水平的大麦-小麦型日粮为基础日粮，验证其肉鸡饲喂效果，以此来改善肉鸡营养素利用率、提高肉鸡生产性能、降低肉鸡肠道疾病发生率、节约饲养成本，并为多功能转基因乳酸杆菌在动物生产中应用提供理论依据和技术支持。主要研究结果如下：1.从自然界中分别筛选出1株产内切葡聚糖酶的细菌和1株产植酸酶的真菌，经菌落形态、染色观察及16S和18S保守序列测序鉴定，WL001为枯草芽孢杆菌，WL002为烟曲霉。Bacillus. subtilis WL001发酵产内切葡聚糖酶的最佳碳源为麸皮，氮源为蛋白胨，初始pH为6-7，培养时间为24h；Aspergillus. fumigatus WL002发酵产植酸酶的最佳碳源为麸皮，氮源为蛋白胨，初始pH为5-6，培养时间为24h。B. subtilis WL001内切葡聚糖酶和A. fumigatus WL002植酸酶反应的最适温度均为60℃，最适pH分别为5.5和5.5-6.5。2.从B. subtilis WL001基因组DNA中成功克隆内切葡聚糖酶基因，大小1500bp，命名为celW，获得Genbank登录号（No. KJ528404）；内切葡聚糖酶基因在Ecoil BL21（DE3）中实现可溶性表达，蛋白分子量为55kD，胞内上清内切葡聚糖酶活性为1.18U/ml。从A. fumigatus WL002基因组DNA中成功克隆植酸酶基因成熟肽，大小1320bp，命名为phyAW，获得Genbank登录号（No. KJ528403）；植酸酶基因成熟肽在EcoilTransetta （DE3）中实现可溶性表达，蛋白分子量为48.2kD，胞内上清植酸酶活性为0.64U/ml。3.乳酸杆菌在肉鸡嗉囊中密度最大、分布最广，在盲肠中密度最小、分布最少，大多集中分布在肉鸡肠道前端。L. reuteri、L. johnsonii、L. acidophilus、L. crispatus、L.salivarius和L. aviarius是贯穿于整个肉鸡肠道的优势乳酸杆菌。L. reuteri是肉鸡肠道最丰富的乳酸杆菌。L. reuteri XC1具有良好的益生特性，是理想或潜在的基因工程宿主菌。4.成功构建了内切葡聚糖酶基因乳酸杆菌表达质粒、植酸酶基因乳酸杆菌表达质粒及其共表达质粒，分别命名为pLEM4157（cel）、pLEM4158（phy）、pLEM4159-cel/phy。通过电转化和平板筛选，获得相应的具有内切葡聚糖酶活性（0.96±0.08U/mL）的转基因乳酸杆菌L. reuteri pLEM4157（cel）、具有植酸酶活性（0.51±0.13U/mL）的转基因罗伊乳酸杆菌L. reuteri pLEM4158（phy），及同时具有内切葡聚糖酶和植酸酶活性（内切葡聚糖酶活性0.68±0.17U/mL；植酸酶活性0.42±0.05U/mL）罗伊乳酸杆菌L. reuteripLEM4159-cel/phy。转基因罗伊乳酸杆菌获得与野生型罗伊乳酸杆菌相似的酸和胆盐耐受特性，当pH为2.0和3.0时，其成活率分别是13%和21%左右，当胆盐浓度为0.3%和0.5%时，其成活率分别是10%和0.3%左右。5. L. reuteri pLEM4158（phy）和L. reuteri pLEM4159-cel/phy可改善21–42日龄肉仔鸡饲料转化率；L. reuteri pLEM4157（cel）、L. reuteri pLEM4158（phy）和L. reuteripLEM4159-cel/phy可改善整个饲养期（1-42d）肉仔鸡饲料转化率，但对肉仔鸡日增重和日采食量无显着影响。6. L. reuteri pLEM4159-cel/phy可提高21日龄肉仔鸡胫骨灰分、钙和磷水平；L.reuteri pLEM4157（cel）可提高21日龄肉仔鸡胫骨钙水平；罗伊乳酸杆菌组21日龄肉仔鸡胫骨磷含量呈现增加的趋势，对21日龄肉仔鸡胫骨钙的沉积有轻微的促进作用；L.reuteri pLEM4158（phy）可提高42日龄肉仔鸡胫骨磷水平。7.饮水饲喂转基因罗伊乳酸杆菌能降低肉仔鸡21日龄和42日龄十二指肠、空肠pH，对肉仔鸡屠宰性能无显着影响，仅可轻微降低腹脂率，可显着降低胸肌滴水损失、蒸煮损失和剪切力，提高肌肉的嫩度。8. L. reuteri pLEM4159-cel/phy可显着提高21日龄和42日龄肉仔鸡十二指肠绒毛高度；L. reuteri pLEM4158（phy）、L. reuteri pLEM4159-cel/phy和L. reuteri pLEM4157（cel）可显着降低21日龄肉仔鸡十二指肠和空肠隐窝深度，增加21日龄肉仔鸡空肠肠壁厚度，降低42日龄肉仔鸡回肠隐窝深度，增加42日龄肉仔鸡十二指肠绒毛高度；L. reuteri pLEM4158（phy）和L. reuteri pLEM4159-cel/phy可显着提高42日龄肉仔鸡回肠绒毛高度和绒毛宽度。9. L. reuteri pLEM4159-cel/phy可显着降低21日龄肉仔鸡盲肠大肠杆菌的数量；L.reuteri pLEM4157（cel）可显着降低肉仔鸡盲肠韦荣球菌的数量；饲喂转基因罗伊乳酸杆菌，21日龄肉仔鸡盲肠大肠杆菌、韦荣球菌和拟杆菌的数量呈现降低的趋势，双歧杆菌和乳酸杆菌的数量呈现增加的趋势，42日龄肉仔鸡盲肠乳酸杆菌和粪肠球菌的数量呈现增加趋势。综上所述：本研究获得1株产内切葡聚糖酶的B. subtilis WL001和1株产植酸酶的A. fumigatus WL002；成功克隆目的基因，并实现大肠杆菌可溶性表达。L. reuteri是鸡肠道最丰富的乳酸杆菌。L. reuteri XC1具是理想或潜在的基因工程宿主菌。获得具有益生特性、内切葡聚糖酶和植酸酶活性的多功能转基因乳酸杆菌。重组的罗伊乳酸杆菌对肉仔鸡饲料转化率、胫骨特性、肠道pH、小肠组织形态和盲肠微生物菌群有一定的改善作用。
廖燕[7]（2012）在《定向进化技术提高重组突变黑曲霉N25植酸酶酶活及热稳定性的研究》文中指出植酸酶作为一种饲料添加剂可以提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染。利用蛋白质工程手段改造植酸酶分子是获得有实用价值植酸酶的有效手段。本研究采用易错PCR技术和DNA改组技术对黑曲霉N25的毕赤酵母基因工程菌PP-NPep-6A中植酸酶phyA6A基因进行改造。通过一轮易错PCR改造,96孔板高通量筛选后,获得了一株有较高活性和高热稳定性的产植酸酶突变基因工程菌PP-NPep-11C。Southern印迹结果表明,突变的植酸酶phyA11C基因以单拷贝方式整合进毕赤酵母染色体中。利用硫酸铵分级沉淀、DEAE-阴离子交换柱层析及葡聚糖G-100凝胶层析对突变酶进行纯化,表达产物的SDS-PAGE分析表明,突变体和PP-NPep-6A大小一致,均为70.15kDa。酶学性质研究表明：与出发菌株PP-NPep-6A所产植酸酶相比,其最适反应温度61℃,提高了1℃；最适反应pH未发生变化,为5.5；在70℃,80℃,90℃水浴处理10min,热稳定性分别提高20%,26%,19%;70℃条件下半衰期为9mmin,延长了3min；比活力提高58%,km降低44%,催化效率提高78%。测序结果显示,突变植酸酶phyA11c基因序列有12个碱基发生了突变,引起3个氨基酸位点发生改变,分别是195位的苏氨酸（Thr）突变为亮氨酸（Leu）,368位谷氨酰胺（Gln）突变为谷氨酸（Glu）,376位苯丙氨酸（Phe）突变为酪氨酸（Tyr）。本研究继续以PP-NPep-1lC中phyA11C基因并结合实验室前期构建的突变菌株PP-NPep-6A、PP-NPm-8, PP-NPm-44-252的植酸酶基因作为模板,采用DNA改组技术对突变植酸酶基因继续进行改造,经高通量筛选后获得了三株具有有益突变的产植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-NPds-8F、PP-NPds-12D、PP-NPds-12G。Southern印迹结果表明,三种突变的植酸酶基因（phyA8F、phyA12D、phyA12G）均以单拷贝方式整合进毕赤酵母染色体中。利用硫酸铵分级沉淀、DEAE-阴离子交换柱层析及葡聚糖G—100凝胶层析对三种突变酶进行纯化,表达产物的SDS-PAGE分析表明,三种突变体和PP-NPep-6A大小一致,均为70.15kDa。酶学性质研究表明：与出发菌株PP-NPep-6A所产植酸酶相比,（1）PP-NPds-8F、PP-NPds-12G的最适反应温度未发生变化,为60℃;PP-NPds-12D的最适反应温度为61。C,提高了1℃；（2）三种突变酶的最适反应pH均未发生变化,为5.5；（3）PP-NPds-8F在70℃,80℃,90℃水浴处理10min,热稳定性分别提高15%,23%,13%,70℃条件下半衰期为7.9min,延长了1.9min；PP-NPds-12D在70℃,80℃,90。C水浴处理10mmin,热稳定性分别提高35%,40%,31%,70℃条件下半衰期为12.8min,延长了6.8mmin；PP-NPds-12G在70℃,80℃,90-C水浴处理10mmin,热稳定性分别提高17%,21%,15%,70。C条件下半衰期为8.4min,延长了2.4mmin；（3）PP-NPds-8F比活力提高54%,Km降低35%,催化效率提高60%；PP-NPds-12D比活力提高44%,Km降低21%,催化效率提高26%；PP-NPds-12G比活力提高66%,Km降低61%,催化效率提高97%；（4）测序结果显示,突变植酸酶phyA8F序列有5个碱基发生了突变,引起1个氨基酸位点发生改变,即172位的谷氨酰胺（Gln）突变为精氨酸（Arg）；突变植酸酶phyA12D序列有8个碱基发生突变,引起2个氨基酸位点发生改变,即172位的谷氨酰胺（G1n）突变为精氨酸（Arg）,432位的赖氨酸（Lys）突变为精氨酸（Arg）；突变植酸酶phyA12G序列有10个碱基发生了突变,引起2个氨基酸位点发生改变,即368位的谷氨酰胺（Gln）突变为谷氨酸（Glu）,432位的赖氨酸（Lys）突变为精氨酸（Arg）。为研究突变菌株中突变位点对植酸酶酶学性质的影响以及确定是否可以将通过定向进化产生的单个突变逐个添加到目标酶基因中以获得热稳定性或者催化效率均有所提高的更优突变体,以出发菌株PP-NPeP-6A中phyA6A基因为模板,利用定点突变技术构建三种突变体PP-NPsm-M4（Q172R/K432R/Q368E）、PP-NPsm-M5（Q172R/K432R/Q368E/F376Y）、PP-NPsm-M6（Q172R/K432R/Q368E/F376Y/T195L）。利用硫酸铵分级沉淀、DEAE-阴离子交换柱层析及葡聚糖G-100凝胶层析对三种突变酶进行纯化,表达产物的SDS-PAGE分析表明,三种突变体和PP-NPep-6A大小一致,均为70.15kDa。酶学性质研究表明：（1）三种植酸酶的最适反应温度均为60℃和最适反应pH为5.5,未发生变化；（2）PP-NPsm-M4在70℃,80℃,90℃水浴处理10min,热稳定性分别提高20%,25%,18%,70℃条件下半衰期8.8mmin,延长了2.8min;PP-NPsm-M5在70℃,80℃,90℃水浴处理10mmin,热稳定性分别提高22%,29%,21%,70℃条件下半衰期10mmin,延长了4min；PP-NPsm-M6的热稳定性无明显变化,70℃条件下半衰期5.8min；（3）PP-NPsm-M4植酸酶的比活力提高54%,Km降低30%,催化效率提高23%；PP-NPsm-M5植酸酶的比活力提高62%,Km降低25%,催化效率提高71%；PP-NPsm-M6植酸酶的比活力降低5.5%,Km增加11%,催化效率降低20%。通过以上研究,获得了在毕赤酵母中高效表达并且热稳定性、催化效率均有所改善的植酸酶。通过探讨植酸酶结构与功能关系以及突变位点对植酸酶功能的协同效应,为应用蛋白质工程技术改变植酸酶的理化性质提供实验依据,同时也为植酸酶基因工程菌投入生产奠定坚实基础。
黎其友[8]（2011）在《植酸酶appA基因的克隆、表达及酶学性质分析》文中研究说明植酸是植物性饲料中磷的主要存在形式,在谷物和豆类中其含量超过总磷的80%,磷是动植物生长发育不可缺少的重要元素之一。植酸酶是一种能够水解植酸并释放无机磷的磷酸酶类,广泛存在于植物及微生物中,它作为单胃动物的饲料添加剂已得到了世界范围内的广泛认可。单胃动物的胃、肠道环境中因缺乏植酸酶或植酸酶活性很低导致不能分解植酸而释放其中的无机磷,植酸能够螯合植物营养因子降低其利用率,导致必须向饲料中添加营养因子以满足其生长发育的需要,从而造成成本增高和带来环境污染等影响。通过向动物饲料中添加植酸酶就可以缓解这一问题。来自于大肠杆菌的appA植酸酶是一种新型的植酸酶,它在单胃动物胃肠道的酸性环境中适应能力和分解植酸的能力都很强,而且,appA植酸酶还是目前已知的活性最强的植酸酶。本研究采用维生素C-钼蓝法从饲喂青饲料的猪粪便中筛选到一株高产appA植酸酶活性的大肠杆菌菌株,并根据已报道的基因序列设计一对特征性PCR引物,克隆到了该植酸酶appA基因。DNA测序结果表明,本研究所克隆到的植酸酶基因片段与已报道的appA植酸酶基因具有较高的同源性,该植酸酶appA基因阅读框大小为1233 bp,编码411个氨基酸,其表达产物理论分子质量（MW）和等电点（pI）分别为44.821 kDa和6.09,（G+C）%含量为54.60%。氨基酸结构分析表明该appA植酸酶具有与酸性磷酸酶相同的活性保守基序RHGxRxP和催化活性中心HD,并且存在有3个潜在N-糖基化位点。为获得大量的appA植酸酶,我们将appA基因克隆到甲醇营养型巴斯德毕赤酵母GS115中进行诱导表达,经PCR阳性鉴定和酶活性测定,筛选到了一株能够表达较高酶活性的appA植酸酶基因工程菌GS115/appA,通过SDS-PAGE凝胶电泳检测表达产物,得到一条约55-60 kDa的特征条带。表达蛋白经Ni亲和柱纯化,其appA植酸酶比活力为2669.46U/mg,分子量约57.2 kDa。酶学性质分析表明,重组appA植酸酶的最适温度和最适pH分别为55℃和pH3.0,热稳定性表现为热处理温度高于60℃,appA植酸酶活性开始降低,随着处理时间的延长,酶活不稳定性表现越明显。
李晓宇,张横江,柳志强,刘美珍[9]（2011）在《奥默柯达酵母植酸酶基因phy1在毕赤酵母中的表达》文中研究说明将奥默柯达酵母（Kodamaea ohmeri）植酸酶基因phy1构建到巴斯德毕赤表达载体pPICZαA中,转入到受体菌X-33中,成功实现了奥默柯达酵母植酸酶基因phy1的分泌表达。利用BMMY培养基进行诱导培养,甲醇诱导3 d后,重组酶产量达到最高,为6 290 U/mL,SDS-PAGE显示重组酶的大小约为62 ku。通过对表达产物的酶学性质研究,发现该重组酶具有较好的热稳定性及较广泛的pH适用范围,其最适作用温度为65℃,最适作用pH为5.0。
钊倩倩[10]（2010）在《青霉植酸酶phyA基因的克隆、表达及蛋白性质的改良》文中指出植酸（phytic acid or myo-inositol hexakisphosphate,缩写为IP6）即肌醇六磷酸酯,属于维生素B族,广泛存在于自然界的各种植物组织和粮食产品中,其盐类（phytate）是磷和肌醇的主要存储形式。单胃动物和人类体内由于缺乏能够水解植酸盐的酶类而无法利用植酸中的磷,植酸盐经过肠道,最后通过粪便排出体外；而为了补充动物食料中的无机磷,需要向饲料中加入额外的无机磷。这一方面提高了饲料的生产成本,另一方面,难于利用的植酸酶及过量添加的无机磷,还对牲畜饲喂地区的环境造成了严重的污染。同时,植酸是一种抗营养因子,对金属离子具有很强的络合作用,能阻止动物对磷、二价矿质元素以及蛋白质、脂肪等的利用。植酸酶的出现则解决了这些问题,它可以将植酸及其盐类降解为肌醇和磷酸,这不仅可以避免补加无机磷到饲料中,间接减少了粪便中磷的排放,而且解决了植酸的抗营养问题,有利于动物对矿物元素及金属离子的吸收和利用。植酸酶（myo-inositol hexakisphosphate phosphohyrolases, EC 3.1.3.8 and 3.1.3.26）即肌醇六磷酸水解酶,是将植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。在自然界中,植酸酶广泛的存在于动物、植物及微生物体内,其中应用最为广泛的是来自于微生物特别是一些真菌（如霉菌、酵母等）和细菌（如大肠杆菌、芽孢杆菌等）的植酸酶。由于植酸酶具有极高的应用价值,性质优良的植酸酶基因被越来越多的克隆、研究和利用。植酸酶的分类也很广泛,依据植酸中磷酸基团的降解位点可分为3-型植酸酶和6-型植酸酶；依据作用条件的不同又可分为酸性、中性和碱性植酸酶。其中酸性植酸酶类尤其是组氨酸酸性磷酸酶类由于作用条件接近动物体内环境而应用最为广泛。本课题以从土壤中筛选到的一株能分泌植酸酶活性的青霉菌株为基础。采用了CODEHOP PCR和TAIL PCR相结合的方法克隆到了未知的青霉植酸酶基因。本方法首先选取10个已发表的来源于不同种属的真菌植酸酶家族的蛋白（HAPs）序列,ClustalW比对寻找适合引物设计的保守区（blocks）,应用CODEHOP程序设计一对引物CDE1和CDE2,以青霉的总RNA反转录得到的cDNA为模板,扩增出植酸酶cDNA的部分序列。然后设计三组嵌套引物,及高（G+C）%含量的AD引物（arbitrary degenerate primer）,以青霉基因组为模板,采用TAIL-PCR分别扩增得到植酸酶基因的5’和3’端未知序列。对克隆得到的序列进行拼接得到了植酸酶基因的全长及部分5’UTR和3’UTR的序列。此种克隆方法相对于传统的通过测定植酸酶蛋白的部分氨基酸序列来设计杂交探针筛选DNA文库或cDNA文库的基因克隆方法,更加简单方便。通过对克隆的植酸酶基因序列进行分析得知,植酸酶基因长1504 bp,内含子位置为43-160 bp之间,cDNA为1386 bp,得到蛋白为461 aa,理论分子量为50.42 KDa,无信号肽序列存在,理论等电点为6.10,蛋白含有6个潜在的N-糖基化位点。氨基酸序列中存在典型的RHGXRXP及HD序列,说明来自青霉的植酸酶序列属于组氨酸酸性磷酸酶家族。将克隆得到的植酸酶序列与已发表的真菌植酸酶序列进行比对发现,在含有共同的保守序列RHGXRXP及HD序列的基础上,与来自一株黑曲霉（GenBank的序列号是EF197825）的植酸酶序列DNA相似性为65%,与一株草酸青霉（GenBank的序列号是AY071824）的植酸酶序列DNA相似性为99%,这些结果在一定程度上代表了植酸酶基因序列的进化。天然的植酸酶蛋白通常表达量比较低,无法达到生产的要求,为此,很多真核表达系统被用来进行蛋白的高通量表达,比如酿酒酵母、毕赤酵母、黑曲霉及米曲霉等。其中毕赤酵母由于体内含有受甲醇严格诱导的强启动子,对外源蛋白的翻译后折叠、修饰及糖基化更接近高等真核生物甚至人类,而且毕赤酵母具有生长快速和操作简便的特点,从而越来越成为一种很有潜力的表达系统。在本课题中我们将植酸酶成熟肽的编码序列连入表达载体pPIC9,采用PEG1000的方法整合插入真核表达系统毕赤酵母GS115的基因组上。利用表达系统中的甲醇诱导型强启动子AOXI promoter及信号肽a-factor,得到了高表达量的分泌型重组植酸酶蛋白。性质测定得知,经发酵后获得的发酵液蛋白含量为302mg/L,蛋白的最适作用温度为50℃,最适pH值为5.5-6.0,由于存在糖基化,经SDS-PAGE检测到的表观分子量为67-75 KDa,采用Endoglycosidase Hf去糖基化后的蛋白大小为50 KDa左右,与氨基酸序列推导出的理论值相符。重组蛋白对胃蛋白酶表现出很好的抗性,当蛋白酶／植酸酶的质量比为0.01时,37℃处理2hr后,酶活仍然可保持原来的96.7%,SDS-PAGE检测显示没有植酸酶蛋白的降解。重组植酸酶对胰蛋白酶比较敏感,当蛋白酶／植酸酶的质量比为0.001时,37℃处理2 hr后,酶活损失约80%,SDS-PAGE检测发现明显的蛋白降解。青霉植酸酶对胃蛋白酶的高抵抗特性为其在动物胃内发挥作用奠定了很好的基础。在工业生产中,植酸酶的加工存在一个几秒到几分钟的高温制粒过程,温度通常达到65-90℃,这就要求植酸酶必须具有良好的热稳定性。另外,做为一种饲料添加剂,植酸酶对于植酸的降解作用主要发生在单胃动物的胃内,降解时的环境温度37℃,pH 3.5-5.0,并且存在大量的胃蛋白酶,因此植酸酶的最适作用温度和pH,以及对胃蛋白酶的抗性在一定程度上也可以影响到的它的应用。针对这些问题,我们采用Mn2+-dITP介导的随机突变技术,构建了青霉植酸酶基因突变体库,突变基因转入毕赤酵母,通过对突变蛋白的性质测定,最终筛选到两株热稳定性提高,而最适作用温度和pH有所下降的突变株,对突变基因进行测序,结果分别为Mut2-28（T11A, G56E, L65F, Q144H和L151S）,Mut2-249（T11A, H37Y, G56E, L65F, Q144H, L151S和N354D）。两个突变株所产生的重组植酸酶蛋白在保持了突变前的良好的胃蛋白酶抗性的基础上,蛋白的活性,最适温度,pH,及热稳定性都有了很大的改善。突变蛋白的活性分别为133.3 U及121.5U/mg蛋白,最适温度分别为37-55℃和37-50℃。经过80℃,5 min的热处理,突变蛋白的残余酶活分别为70.36%和88.96%。Mut2-28保持了突变前的最适pH5.5-6.0,而Mut2-249的最适pH则降至pH4.8。所有改进的性质使得本课题得到的两个突变体蛋白能很好的耐受加工制粒过程中的高温,并且能够适应单胃动物胃内的低温酸性环境,因此具有很高的商业价值。目前一些常用的植酸酶蛋白如黑曲霉植酸酶,烟曲霉植酸酶的晶体结构被公布以后,对其后进行的植酸酶性质与功能的研究提供了帮助。我们以烟曲霉植酸酶蛋白的晶体结构为参照,应用SWISS MODEL （http://swissmodel.expasy.org）在线软件预测了青霉植酸酶的三级结构,初步确定了它的活性中心的组成,其中催化中心包含如下氨基酸：Arg71, His72, Arg75, Argl55, His352和Asp353,底物结合中心包含如下氨基酸：Thr78,Lys81,Lys84,Asp215,Asp252和Lys291。通过结构分析可以发现,突变G56E,L65F,Q144H和L151S均增加了突变位点与其它氨基酸残基之间的氢键数量,这增强了相邻的二级结构之间的相互作用,从而增加了整个蛋白分子的热稳定性；而突变N354D的侧链pKa由7.0下降到3.86,这个变化影响了催化中心的pKa,从而造成了植酸酶最适pH的改变；另外,突变L151S侧链与His352侧链的空间距离的增大（2.96A→4.35A）有利于底物与催化中心的自由结合作用,从而提高了植酸酶的催化活性。在青霉植酸酶蛋白分子表面Loop上存在的胃蛋白酶切割位点中,Met1、Phe2、Ala5、Leu6和Phe32处于氨基酸序列的N末端,它们的降解对蛋白质的结构及功能没有明显的影响；其余的切割位点具有一个共同的特点,即处于糖基化位点的周围,例如Leu53、Pro373、Gln431处于糖基化位点Asn367周围,Thr112、Leu113处于糖基化位点Asn110周围,Thr241、Leu242处于糖基化位点Asn95周围,糖链在阻止蛋白酶的降解过程中发挥了重要的作用。胰蛋白酶切割位点中,Argl36、Arg142、Lys212、Arg376和Arg407的羧基所组成的肽键,由于暴露在分子表面,远离糖基化位点,因此容易被胰蛋白酶识别而被切割,这可能是造成Penicilliumsp.植酸酶蛋白对胰蛋白酶敏感的关键原因。另外,在活性位点RHGXRXP序列存在的胰蛋白酶切割位点（Arg71和Arg75）,可能对植酸酶结构的进一步被破坏和活性的丧失具有一定作用。本文中植酸酶突变后性质的改变及结构的变化进一步证明了蛋白质的结构与功能之间存在着必然的联系。
二、烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达（论文提纲范文）
（1）植酸酶基因的定点突变及其在巴斯德毕赤酵母表面展示（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 分子生物学与生化试剂 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 植酸酶基因的定点突变及其他相关片段的扩增 |
| 1.2.3 表达载体p PICZαC-FS/phy A的构建与鉴定 |
| 1.2.4 展示植酸酶的转化表达 |
| 1.2.5 植酸酶表面展示的鉴定 |
| 1.2.6 展示植酸酶活性的测定 |
| 1.2.7 展示植酸酶最适温度及热稳定性的测定 |
| 1.2.8 展示植酸酶最适p H及酸碱耐受性的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 突变位点的引入 |
| 2.2 表达载体p PICZαC-FS/phy A的构建 |
| 2.2.1 表达载体p PICZαC-FS/phy A示意图 |
| 2.2.2 fs无缝克隆和phy A无缝克隆的扩增 |
| 2.2.3 载体p PICZαC双酶切线性化 |
| 2.2.4 表达载体p PICZαC-FS/phy A的测序鉴定 |
| 2.3 K.phaffii GS115的氯化锂转化 |
| 2.3.1 表达载体p PICZαC-FS/phy A线性化 |
| 2.3.2 PCR筛选阳性转化子 |
| 2.4 免疫荧光检测 |
| 2.5 流式细胞仪检测 |
| 2.6 展示植酸酶活性的诱导曲线 |
| 2.7 温度对展示植酸酶活性的影响 |
| 2.8 p H对展示植酸酶活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）基于计算机辅助设计改造饲用植酸酶、木聚糖酶酶学特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 计算机辅助蛋白质设计研究概况 |
| 1.1.1 计算机辅助蛋白质设计的定义 |
| 1.1.2 计算机辅助蛋白质分子设计前的准备 |
| 1.1.2.1 蛋白质分子设计的两个不同层次 |
| 1.1.2.2 蛋白质分子设计流程 |
| 1.1.2.3 蛋白质设计的目标及解决的方法 |
| 1.1.2.4 突变体设计的步骤 |
| 1.1.3 蛋白质设计的途径和方法 |
| 1.1.3.1 理性设计 |
| 1.1.3.2 非理性设计 |
| 1.1.4 基于计算机辅助蛋白质设计的参数 |
| 1.2 植酸酶研究概况 |
| 1.2.1 植酸酶和植酸 |
| 1.2.2 植酸酶的来源 |
| 1.2.2.1 动物来源的植酸酶 |
| 1.2.2.2 植物来源的植酸酶 |
| 1.2.2.3 微生物来源的植酸酶 |
| 1.2.3 植酸酶的分类 |
| 1.2.4 植酸酶基因工程表达系统 |
| 1.2.5 植酸酶的应用及发展 |
| 1.2.5.1 植酸酶作为添加剂的应用 |
| 1.2.5.2 植酸酶在食品产业中的应用 |
| 1.2.5.3 植酸酶在生物技术中的应用 |
| 1.2.5.4 植酸酶的发展前景 |
| 1.3 木聚糖酶研究的基本概况 |
| 1.3.1 木聚糖酶家族及特点 |
| 1.3.2 木聚糖酶酶学性质 |
| 1.3.3 木聚糖酶的分子催化机理及结构 |
| 1.3.4 木聚糖酶的应用 |
| 1.3.4.1 木聚糖酶在造纸产业中的应用 |
| 1.3.4.2 木聚糖酶在食品产业中的应用 |
| 1.3.4.3 木聚糖酶在饲料产业中的应用 |
| 1.3.4.4 木聚糖酶在其他方面的应用 |
| 1.3.5 木聚糖酶基因的克隆与表达 |
| 1.3.6 木聚糖酶的国内外研究概况、水平和发展趋势 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 第2章 根据RMSD值对植酸酶酶学特性的改造 |
| 2.1 晶体结构计算分析确定突变位点 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 常用溶液 |
| 2.2.5 常用培养基 |
| 2.2.6 DNA测序与引物合成 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌pMD19-T-phy-N突变模板的构建 |
| 2.3.1.1 植酸酶phy-N目的基因的扩增 |
| 2.3.1.2 PCR扩增产物的纯化 |
| 2.3.1.3 大肠杆菌E.coli Trans1-T1感受态细胞制备 |
| 2.3.1.4 连接 |
| 2.3.1.5 转化 |
| 2.3.1.6 阳性重组子的鉴定 |
| 2.3.2 植酸酶p MD19-T-phy-N-18 的获得 |
| 2.3.2.1 突变引物的设计 |
| 2.3.2.2 突变的实施 |
| 2.3.2.3 突变后的检测 |
| 2.3.3 植酸酶phy-N-18 真核表达载体的构建 |
| 2.3.3.1 植酸酶phy-N-18 目的基因和线性化载体的获取 |
| 2.3.3.2 PCR扩增产物及线性化载体的纯化 |
| 2.3.3.3 连接 |
| 2.3.3.4 转化 |
| 2.3.3.5 阳性重组子的鉴定 |
| 2.3.4 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N在毕赤酵母中的高效表达 |
| 2.3.4.1 重组质粒的线性化 |
| 2.3.4.2 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 |
| 2.3.4.3 电转化及阳性克隆菌株的获得 |
| 2.3.4.4 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N的诱导表达 |
| 2.3.5 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N的检测及定量 |
| 2.3.6 植酸酶酶活力的测定 |
| 2.3.6.1 方法原理 |
| 2.3.6.2 标准曲线 |
| 2.3.6.3 反应 |
| 2.3.6.4 样品测定 |
| 2.3.6.5 植酸酶活性单位定义 |
| 2.3.7 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N的酶学性质 |
| 2.3.7.1 pH适性和温度适性的测定 |
| 2.3.7.2 不同化学试剂及金属离子对植酸酶酶活力的影响的测定 |
| 2.3.7.3 动力学常数Km和Vmax的测定 |
| 2.3.7.4 重组植酸酶与市场产品耐热性对比的测定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 植酸酶phy-N和phy-F晶体结构比对 |
| 2.4.2 植酸酶p MD19-T-phy-N突变模板的构建 |
| 2.4.2.1 phy-N的基因扩增及突变模板质粒pMD19-T-phy-N的构建 |
| 2.4.2.2 重组质粒pMD19-T-phy-N的转化 |
| 2.4.3 植酸酶p MD19-T-phy-N-18 的构建 |
| 2.4.3.1 重组质粒pMD19-T-phy-N-18 植酸酶的定点突变 |
| 2.4.3.2 重组质粒pMD19-T-phy-N-18 植酸酶的转化 |
| 2.4.4 重组质粒pPIC9K-phy-N-18 的构建 |
| 2.4.4.1 突变型phy-N-18 基因全长的扩增及表达载体pPIC9K的线性化 |
| 2.4.4.2 植酸酶phy-N-18 与载体pPIC9K的连接及转化 |
| 2.4.5 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N在毕赤酵母中的高效表达 |
| 2.4.6 重组植酸酶phy-N-18 及phy-N的鉴定 |
| 2.4.7 植酸酶phy-N-18 及phy-N酶学性质比较研究 |
| 2.4.7.1 植酸酶活性分析 |
| 2.4.7.2 植酸酶的pH活性和pH稳定性测定 |
| 2.4.7.3 植酸酶phy-N和phy-N-18 的最适温度和热稳定性测定 |
| 2.4.7.4 金属离子对植酸酶phy-N和phy-N-18 活力的影响 |
| 2.4.7.5 植酸酶phy-N和phy-N-18 的动力学参数 |
| 2.4.7.6 植酸酶phy-N和phy-N-18 与市场产品耐热性的比较 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 分子动力学模拟改造植酸酶酶学特性 |
| 3.1 分子动力学模拟确定phy-N-18 耐热机制 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 分子动力学模拟细节 |
| 3.3.2 植酸酶phy-N-9 突变的实施及突变体的克隆、表达、酶学特性的研究 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 突变位点形成的氢键致使phy-N-18 的热稳定性提高 |
| 3.4.2 植酸酶p MD19-T-phy-N-9 的构建 |
| 3.4.2.1 重组质粒pMD19-T-phy-N-9 植酸酶的定点突变 |
| 3.4.2.2 重组质粒pMD19-T-phy-N-9 植酸酶的转化 |
| 3.4.3 重组质粒pPIC9K-phy-N-9 的构建 |
| 3.4.3.1 突变型phy-N-9 基因全长的扩增及表达载体pPIC9K的线性化 |
| 3.4.3.2 植酸酶phy-N-9 与载体pPIC9K的连接及转化 |
| 3.4.4 重组植酸酶phy-N-9 在毕赤酵母中的高效表达 |
| 3.4.5 重组植酸酶phy-N-9 的鉴定 |
| 3.4.6 突变型植酸酶phy-N-9、phy-N-18 及phy-N酶学性质比较性研究 |
| 3.4.6.1 植酸酶活性分析 |
| 3.4.6.2 植酸酶的pH活性和pH稳定性测定 |
| 3.4.6.3 植酸酶phy-N、phy-N-18 与phy-N-9 的最适温度和热稳定性测定 |
| 3.4.6.4 金属离子对植酸酶phy-N、phy-N-18 和phy-N-9 活力的影响 |
| 3.4.6.5 植酸酶phy-N、phy-N-18 和phy-N-9 的动力学参数 |
| 3.4.6.6 植酸酶phy-N、phy-N-18 和phy-N-9 与市场产品耐热性的比较 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 利用温度因子(B-factor)对木聚糖酶酶学特性的改造 |
| 4.1 比较不同木聚糖酶温度因子确定突变位点 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 主要培养基 |
| 4.2.5 主要溶液 |
| 4.2.6 DNA测序与引物合成 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 木聚糖酶B-factor的计算 |
| 4.3.2 木聚糖酶的分子动力学模拟细节 |
| 4.3.3 大肠杆菌pMD19-T-XynCDBFV突变模板的构建 |
| 4.3.3.1 木聚糖酶目的基因的扩增 |
| 4.3.3.2 纯化PCR扩增产物 |
| 4.3.3.3 大肠杆菌E.coli Trans1-T1感受态细胞制备 |
| 4.3.3.4 连接 |
| 4.3.3.5 转化 |
| 4.3.3.6 阳性重组子的鉴定 |
| 4.3.4 木聚糖酶突变体pMD19-T-Xyn-MUT的构建 |
| 4.3.4.1 突变引物的设计 |
| 4.3.4.2 突变的实施 |
| 4.3.4.3 突变后的检测 |
| 4.3.5 木聚糖酶pGAP5`AOX-XynCDBFV及其突变体Xyn-MUT真核表达载体的构建 |
| 4.3.5.1 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT目的基因和线性化载体的获取 |
| 4.3.5.2 PCR扩增产物及线性化载体的纯化 |
| 4.3.5.3 连接 |
| 4.3.5.4 转化 |
| 4.3.5.5 阳性重组子的鉴定 |
| 4.3.6 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT在毕赤酵母中的高效表达 |
| 4.3.7 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT的纯化及鉴定 |
| 4.3.8 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT酶活测定方法 |
| 4.3.9 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT酶学特性分析 |
| 4.3.9.1 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT最适反应pH及p H稳定性 |
| 4.3.9.2 木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT最适反应温度及温度稳定性 |
| 4.3.9.3 不同金属离子及化学试剂对木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT的影响 |
| 4.3.9.4 重组木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT酶促动力学参数 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 计算机辅助设计突变位点 |
| 4.4.2 突变位点所形成的氢键协助重组酶提高其耐热性 |
| 4.4.3 木聚糖酶pMD19-T-XynCDBFV突变模板的构建 |
| 4.4.3.1 XynCDBFV的基因扩增及突变模板质粒p MD19-T-XynCDBFV的构建 |
| 4.4.3.2 重组质粒pMD19-T-Xyn CDBFV的转化 |
| 4.4.4 木聚糖酶pMD19-T-Xyn-MUT的构建 |
| 4.4.4.1 重组质粒木聚糖酶p MD19-T-Xyn-MUT的定点突变 |
| 4.4.4.2 突变型重组质粒木聚糖酶pMD19-T-Xyn-MUT的转化 |
| 4.4.5 木聚糖酶重组质粒pGAP5`AOX-Xyn CDBFV及pGAP5`AOX-Xyn-MUT的构建 |
| 4.4.5.1 突变型Xyn-MUT基因及野生型XynCDBFV全长的扩增及表达载体p GAP5`AOX的线性化 |
| 4.4.5.2 突变型木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT与载体pGAP5`AOX连接及转化 |
| 4.4.6 重组木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT在毕赤酵母中的高效表达 |
| 4.4.7 重组木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT的纯化和鉴定 |
| 4.4.8 重组木聚糖酶XynCDBFV及Xyn-MUT的酶学性质研究 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小节 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 创新 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 实验中所使用的缓冲液的配制 |
| A1 不同pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制 |
| A2 不同pH值的甘氨酸-NaOH缓冲液的配制 |
| A3 不同pH值的Tris-HCl缓冲液的配制 |
| A4 不同pH值的乙酸-乙酸钠缓冲液的配制 |
| 附录B 本文所涉及到的氨基酸序列 |
| B1 黑曲霉植酸酶phy-N的氨基酸序列 |
| B2 烟曲霉植酸酶phy-F的氨基酸序列 |
| B3 突变体植酸酶phy-N-18 的氨基酸序列 |
| B4 突变体植酸酶phy-N-9 的氨基酸序列 |
| B5 木聚糖酶XynCDBFV的氨基酸序列 |
| B6 突变体木聚糖酶Xyn-MUT的氨基酸序列 |
| 附录C 本文所涉及到的核苷酸序列 |
| C1 黑曲霉植酸酶phy-N的核苷酸序列 |
| C2 烟曲霉植酸酶phy-F的核苷酸序列 |
| C3 突变型植酸酶phy-N-18 的核苷酸序列 |
| C4 突变型植酸酶phy-N-9 的核苷酸序列 |
| C5 木聚糖酶XynCDBFV的核苷酸序列 |
| C6 突变体木聚糖酶Xyn-MUT的核苷酸序列 |
| 附录D 氨基酸中英文对照及缩写表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 |
| 致谢 |
（3）新型无抗多拷贝毕赤酵母表达平台的构建及新壳聚糖酶基因的重组表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语说明 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 毕赤酵母概述 |
| 2 毕赤酵母在工业生产方面的应用现状 |
| 2.1 生物制药方面的应用现状 |
| 2.2 工业酶制剂方面的应用现状 |
| 3 毕赤酵母高效表达策略 |
| 3.1 提高外源基因拷贝数对重组表达的影响 |
| 3.2 共表达分子伴侣对重组表达的影响 |
| 4 在毕赤酵母中进行重组表达所遇到的问题 |
| 4.1 目的蛋白的分泌表达不具备广谱性 |
| 4.2 多拷贝转化子的产量难以预期 |
| 4.3 多拷贝的外源基因在宿主体内存在不稳定性 |
| 5 本研究的意义与立题依据 |
| 参考文献 |
| 第二章 新型高拷贝酵母表达载体的构建 |
| 第一节 酵母表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要培养基与溶液 |
| 1.5 本节所用引物的序列 |
| 1.6 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 表达载体抗性自消除部分的构建 |
| 2.2 控制AOX启动子的泄漏表达 |
| 2.3 表达载体功能的初步验证 |
| 2.4 表达载体构建完成 |
| 第二节 耐热植酸酶AppA在Pichiapastoris GS115中的重组表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 培养基、试剂和溶液 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 植酸酶的全基因合成与密码子优化 |
| 1.5 低拷贝表达菌株的构建 |
| 1.6 低拷贝表达菌株的活性验证 |
| 1.7 高拷贝表达菌株的构建与验证 |
| 1.8 来源于Saccharomyces cerevisiae的SUC2蔗糖酶基因与GAP-appA共表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 植酸酶的全基因合成与密码子优化 |
| 2.2 含有不同appA拷贝数的重组表达质粒的构建 |
| 2.3 低拷贝表达菌株的构建与验证 |
| 2.4 高拷贝表达菌株的构建与验证 |
| 2.5 摇瓶规模的发酵实验与SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.6 来源于 cerevisiae的SUC2蔗糖酶基因与appA共表达 |
| 本章讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 Aquabacterium sp. A7-Y基因组中几丁质降解相关基因资源的挖掘 |
| 第一节 Aquabacterium sp.A7-Y来源的壳聚糖酶和几丁质酶基因的克隆、表达和纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 培养基与试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 PCR扩增所用引物 |
| 1.5 基因组DNA提取 |
| 1.6 序列分析 |
| 1.7 表达菌株的构建 |
| 1.8 大肠杆菌粗酶液的酶活检测 |
| 1.9 重组酶的纯化 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Aquabacterium sp. A7-Y总DNA提取 |
| 2.2 菌株A7-Y中几丁质降解相关酶基因序列分析 |
| 2.3 PCR扩增 |
| 2.4 重组表达载体的构建 |
| 2.5 表达菌株的SDS-PAGE电泳与活性验证 |
| 2.6 重组壳聚糖酶ChoA的纯化 |
| 2.7 重组壳聚糖酶ChoB的纯化 |
| 第二节 重组壳聚糖酶ChoA和ChoB的酶学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 重组酶的表达和纯化 |
| 1.3 重组酶酶活性的测定 |
| 1.4 pH和温度对重组酶的活性和稳定性的影响 |
| 1.5 重组壳聚糖酶的底物谱分析与比酶活确定 |
| 1.6 有机溶剂、螯合剂、表面活性剂对重组酶的活性的影响 |
| 1.7 金属离子对重组酶的水解活性的影响 |
| 1.8 重组壳聚糖酶的水解产物分析 |
| 1.9 ChoA和ChoB与植物病原真菌的对峙实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pH和温度对重组酶的活性和稳定性的影响 |
| 2.2 重组壳聚糖酶的底物谱分析与比酶活确定 |
| 2.3 有机溶剂、螯合剂、表面活性剂对重组酶活性的影响 |
| 2.4 金属离子对重组酶活性的影响 |
| 2.5 重组壳聚糖酶的水解模型初步分析 |
| 2.6 ChoA和ChoB与植物病原真菌的对峙实验 |
| 本章讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 壳聚糖酶ChoA和ChoB在P.pastoris GS115中的重组表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 培养基、试剂、溶液 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 1拷贝choA和choB的酵母转化子的构建与验证 |
| 1.5 多拷贝choA酵母转化子的构建与验证 |
| 1.6 10个分子伴侣与choA共表达 |
| 1.7 分子伴侣组合与不同拷贝数的choA共表达 |
| 1.8 实时荧光定量PCR (qPCR)检测酵母转化子的choA拷贝数 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 choA和choB在毕赤酵母中的重组表达 |
| 2.2 不同基因剂量对重组蛋白表达的影响 |
| 2.3 不同分子伴侣对重组蛋白表达量的影响 |
| 2.4 分子伴侣组合与不同拷贝数的choA共表达 |
| 2.5 qPCR检测不同转化子中choA的拷贝数 |
| 本章讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 主要创新点 |
| 问题与展望 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 致谢 |
（4）隔孢伏革菌植酸酶在毕赤酵母中的高效表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的植酸酶基因的合成与克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 引物的设计 |
| 1.2 6-磷酸植酸酶(6-PhyA)基因的合成 |
| 1.3 6-PhyA毕赤酵母密码子嗜好分析 |
| 1.4 PCR产物的克隆 |
| 2 结果 |
| 2.1 L6ph密码子的毕赤酵母嗜好分析 |
| 2.2 pUC57/6-PhyA转化子质粒 |
| 3 本章小结 |
| 第二章 含野生型信号肽6-PhyA基因在毕赤酵母中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毕赤酵母分泌型表达载体的构建 |
| 1.2 毕赤酵母细胞的转化 |
| 1.3 6ph在毕赤酵母中的表达 |
| 1.4 植酸酶的生物学性质的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 毕赤酵母表达载体pPIC9K/6ph的酶切鉴定 |
| 2.2 毕赤酵母转化子的筛选 |
| 2.3 6ph在毕赤酵母中表达 |
| 2.4 植酸酶活性的检测 |
| 3 本章小结 |
| 第三章 含野生型信号6ph基因的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 GPD驱动的植酸酶酵母表达载体的构建 |
| 1.2 酿酒酵母细胞的转化与鉴定 |
| 1.3 植酸酶活性的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 表达载体pGPD-6ph-1的构建 |
| 2.2 pGPD-6ph酿酒酵母表达载体的构建 |
| 2.3 W303-1A/pGPD-6ph细胞PCR鉴定 |
| 2.4 植酸酶的表达鉴定 |
| 3 本章小结 |
| 第四章 α信号肽引导的6ph基因在毕赤酵母中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 无野生型信号肽6-磷酸植酸酶基因的PCR扩增 |
| 1.2 pPIC9K/L6ph的构建 |
| 1.3 pPIC9K/L6ph阳性转化子的鉴定 |
| 1.4 高拷贝L6ph毕赤酵母的建立 |
| 1.5 毕赤酵母转化子的PCR鉴定 |
| 1.6 植酸酶活性的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 pPIC9K/L6ph转化子质粒的酶切鉴定 |
| 2.2 GS115毕赤酵母转化子的PCR鉴定 |
| 2.3 植酸酶活性的检测 |
| 3 本章小结 |
| 第五章 植酸酶的酶学性质的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 时间对酶活性的影响 |
| 1.2 植酸酶最适反应温度的研究 |
| 1.3 植酸酶最适pH的研究 |
| 1.4 植酸酶热稳定性的研究 |
| 1.5 金属离子对酶活性影响的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 培养时间对产酶的影响 |
| 2.2 温度对酶活性的影响 |
| 2.3 植酸酶的最适pH |
| 2.4 植酸酶的热稳定性 |
| 2.5 金属离子对植酸酶的影响 |
| 第六章 讨论 |
| 1 酵母表达系统 |
| 2 外源性基因在酵母细胞中的高效表达 |
| 3 植酸酶的酶学性质 |
| 4 未来展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）密码子优化的隔孢伏革菌植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 隔孢伏革菌植酸酶基因6-phy A的合成 |
| 1.2 人工合成的6-phy A毕赤酵母密码子嗜好分析 |
| 1.3 6-phy A毕赤酵母表达载体的构建 |
| 1.4 高拷贝6-phy A毕赤酵母的建立 |
| 1.5 6-phy A转基因毕赤酵母的PCR鉴定 |
| 1.6 6-phy A在毕赤酵母中的表达 |
| 1.6.1 诱导表达 |
| 1.6.2 SDS-PAGE分析 |
| 1.6.3 6-phy A活性的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 6-phy A密码子的毕赤酵母嗜好分析 |
| 2.2 Mut+表型毕赤酵母 (GS115/L6-ph) 的PCR鉴定 |
| 2.3 6-phy A的SDS-PAGE分析 |
| 2.4 6-phy A的活性 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（6）转植酸酶和内切葡聚糖酶基因乳酸杆菌的构建及其肉鸡饲喂效果验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 文献综述 |
| 第一章 植酸和纤维素及其水解酶类、乳酸杆菌研究进展 |
| 1.1 植酸 |
| 1.1.1 植酸（盐）的结构、来源及贮存部位 |
| 1.1.2 植酸（盐）的化学特性 |
| 1.1.3 植酸与营养素之间的拮抗作用 |
| 1.2 植酸酶 |
| 1.2.1 植酸酶简介 |
| 1.2.2 植酸酶在动物日粮中应用 |
| 1.2.3 植酸酶与其它营养成分的交互作用 |
| 1.2.4 植酸酶基因工程研究进展 |
| 1.3 纤维素和纤维素酶 |
| 1.3.1 纤维的种类 |
| 1.3.2 纤维对家禽营养吸收的影响 |
| 1.3.3 动物日粮中纤维水解酶的作用 |
| 1.3.4 纤维水解酶基因工程研究进展 |
| 1.4 乳酸杆菌 |
| 1.4.1 乳酸杆菌概述 |
| 1.4.2 乳酸杆菌分类学和系统发育 |
| 1.4.3 乳酸菌在食品和饲料生物技术中的应用 |
| 1.4.4 乳酸杆菌作为益生菌 |
| 1.4.5 乳酸杆菌在畜禽中的应用 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 产植酸酶和内切葡聚糖酶菌株的筛选及鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 产内切葡聚糖酶和植酸酶菌株的筛选 |
| 2.2.2 筛选菌株的鉴定 |
| 2.2.3 目标菌株产酶条件优化 |
| 2.2.4 目标菌株酶学性质分析（最适温度和最适 pH） |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 内切葡聚糖酶和植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 内切葡聚糖酶基因和植酸酶基因的克隆及鉴定 |
| 3.2.2 E.coli 表达载体的构建 |
| 3.2.3 pET-celW 和 pET-phyWM 在大肠杆菌中的表达及平板检测 |
| 3.2.4 重组菌内切葡聚糖酶和植酸酶活性测定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 鸡肠道优势乳酸杆菌鉴定及益生特性分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 特异性片段的扩增与标准曲线的建立 |
| 4.2.2 鸡肠道优势乳酸杆菌实时荧光定量 PCR 分析 |
| 4.2.3 乳酸杆菌益生特性研究 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因和烟曲霉植酸酶基因在罗伊乳酸杆菌中的共表达 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 内切葡聚糖酶和植酸酶单个表达质粒的构建 |
| 5.2.2 内切葡聚糖酶和植酸酶基因共表达质粒的构建 |
| 5.2.3 植酸酶基因和内切葡聚糖酶基因在 L. reuteri XC1 中的表达 |
| 5.2.4 酸和胆盐耐受性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 重组乳酸杆菌肉鸡饲喂效果研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 重组乳酸杆菌对肉鸡生长性能影响 |
| 6.2.2 重组乳酸杆菌对肉鸡胫骨特性的影响 |
| 6.2.3 重组乳酸杆菌对肉鸡小肠 pH 的影响 |
| 6.2.4 重组乳酸杆菌对肉鸡屠宰性能和肉品质的影响 |
| 6.2.5 重组乳酸杆菌对肉鸡小肠组织形态的影响 |
| 6.2.6 重组乳酸杆菌对肉鸡盲肠微生物菌群的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 研究结论与创新点 |
| 7.1 研究结论 |
| 7.2 本研究创新点 |
| 7.3 还需深入研究的内容 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词（Abbreviation） |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）定向进化技术提高重组突变黑曲霉N25植酸酶酶活及热稳定性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植酸酶概述 |
| 1.1.1 植酸及植酸酶 |
| 1.1.2 植酸酶的特性 |
| 1.2 饲用植酸酶蛋白质工程研究进展 |
| 1.2.1 植酸酶改性策略 |
| 1.2.2 饲用植酸酶改性研究进展 |
| 1.3 本研究的前期工作基础及目的意义 |
| 1.3.1 本研究的前期工作基础 |
| 1.3.2 本研究的目的意义 |
| 1.4 本研究的技术路线 |
| 第二章 易错PCR技术提高突变黑曲霉N25植酸酶酶活及热稳定性的研究 |
| 2.1 试验材料与仪器 |
| 2.1.1 菌株及载体 |
| 2.1.2 试剂与溶液 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 通过易错PCR技术进行植酸酶突变体库构建 |
| 2.2.2 植酸酶突变体库的高通量筛选 |
| 2.2.3 重组产突变植酸酶的基因工程菌的诱导表达 |
| 2.2.4 重组产突变植酸酶的基因工程菌的遗传稳定性分析 |
| 2.2.5 重组产突变植酸酶的基因工程菌的拷贝数分析 |
| 2.2.6 突变植酸酶基因序列及结构分析 |
| 2.2.7 突变酶的纯化及酶学性质分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 通过易错PCR技术进行植酸酶突变体库的构建 |
| 2.3.2 植酸酶突变体库的高通量筛选 |
| 2.3.3 重组突变植酸酶基因工程菌的诱导表达 |
| 2.3.4 重组突变植酸酶基因工程菌的遗传稳定性分析 |
| 2.3.5 重组突变植酸酶基因工程菌的拷贝数分析 |
| 2.3.6 突变植酸酶基因序列及结构分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 通过易错PCR技术对植酸酶phyA6A基因的定向进化 |
| 2.4.2 突变菌株植酸酶基因拷贝数分析 |
| 2.4.3 突变菌株植酸酶整体结构分析 |
| 2.4.4 突变菌株植酸酶结构与能量的关系 |
| 第三章 DNA改组技术提高突变黑曲霉N25植酸酶酶活及热稳定性的研究 |
| 3.1 试验材料与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 通过DNA改组技术进行植酸酶突变体库的构建 |
| 3.2.2 植酸酶突变体库的高通量筛选 |
| 3.2.3 重组产突变植酸酶的基因工程菌的诱导表达 |
| 3.2.4 重组产突变植酸酶的基因工程菌的遗传稳定性分析 |
| 3.2.5 重组产突变植酸酶的基因工程菌的拷贝数分析 |
| 3.2.6 突变植酸酶基因序列及结构分析 |
| 3.2.7 突变酶的纯化及酶学性质分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 通过DNA改组技术进行植酸酶突变体库的构建 |
| 3.3.2 植酸酶突变体库的高通量筛选 |
| 3.3.3 重组产突变植酸酶的基因工程菌的诱导表达 |
| 3.3.4 重组突变植酸酶基因工程菌的遗传稳定性分析 |
| 3.3.5 重组突变植酸酶基因工程菌的拷贝数分析 |
| 3.3.6 突变植酸酶基因序列及结构分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 通过DNA改组技术进行植酸酶突变体库的构建 |
| 3.4.2 突变植酸酶突变植酸酶成熟蛋白结构与能量分析 |
| 第四章 突变位点对植酸酶酶学性质影响的研究 |
| 4.1 试验材料与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 植酸酶基因的定点突变 |
| 4.2.2 重组表达载体的构建 |
| 4.2.3 重组表达载体的电击转化及转化子的筛选 |
| 4.2.4 重组毕赤酵母的诱导表达 |
| 4.2.5 突变植酸酶纯化及酶学性质研究 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 植酸酶基因的定点突变 |
| 4.3.2 重组表达载体的构建 |
| 4.3.3 重组表达载体的电击转化及转化子的筛选 |
| 4.3.4 重组毕赤酵母的诱导表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 突变植酸酶的纯化及酶学性质研究 |
| 5.1 试验材料与仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 突变植酸酶的分离纯化 |
| 5.2.2 突变酶的酶学性质分析 |
| 5.3 结与分析 |
| 5.3.1 突变植酸酶的分离纯化 |
| 5.3.2 突变植酸酶的酶学性质 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 突变菌株植酸酶的酶学性质 |
| 5.4.2 突变菌株植酸酶结构与最适pH的关系 |
| 5.4.3 突变菌株植酸酶结构与热稳定性的关系 |
| 5.4.4 突变菌株植酸酶结构与催化效率的关系 |
| 5.4.5 突变植酸酶热稳定性曲线分析 |
| 5.4.6 突变位点对植酸酶功能的协同效应 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（8）植酸酶appA基因的克隆、表达及酶学性质分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植酸酶 |
| 1.2 植酸酶的来源 |
| 1.2.1 植物来源的植酸酶 |
| 1.2.2 动物来源的植酸酶 |
| 1.2.3 微生物来源的植酸酶 |
| 1.3 植酸酶的作用机理 |
| 1.4 植酸酶的酶学性质 |
| 1.4.1 分子量 |
| 1.4.2 最适pH值 |
| 1.4.3 最适温度 |
| 1.4.4 热稳定性 |
| 1.4.5 其它性质 |
| 1.5 植酸酶活性的测定方法 |
| 1.5.1 硫酸亚铁-钼蓝法 |
| 1.5.2 丙酮-磷钼酸铵法 |
| 1.5.3 维生素C-钼蓝法 |
| 1.5.4 钒-钼酸铵法 |
| 1.6 植酸酶的应用 |
| 1.6.1 植酸酶在饲料工业中的应用 |
| 1.6.2 植酸酶在食品工业中的应用 |
| 1.6.3 植酸酶在医药领域的应用 |
| 1.6.4 在农业生产应用上 |
| 1.7 植酸酶基因工程的研究进展 |
| 1.7.1 微生物高效表达植酸酶基因 |
| 1.7.2 植酸酶基因在植物中表达 |
| 1.7.3 植酸酶热稳定性研究 |
| 1.8 appA植酸酶研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究目的及意义 |
| 2.2 研究的主要内容 |
| 2.3 研究路线 |
| 第三章 高活性植酸酶appA菌株的筛选及基因克隆 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 PCR引物 |
| 3.1.3 药品、酶及试剂盒 |
| 3.1.4 主要生化试剂和溶液 |
| 3.1.5 植酸酶活性测定溶液 |
| 3.1.6 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 高活性植酸酶appA菌株的筛选 |
| 3.2.2 植酸酶appA基因的克隆 |
| 3.2.3 植酸酶appA基因序列分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 高活性植酸酶appA菌株的筛选 |
| 3.3.2 大肠杆菌基因组的获得 |
| 3.3.3 目的基因PCR产物 |
| 3.3.4 阳性重组子的筛选 |
| 3.3.5 植酸酶appA目的基因测序 |
| 3.3.6 植酸酶appA基因序列分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 植酸酶appA基因在毕赤酵母中表达 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌种与质粒 |
| 4.1.2 酶与试剂盒及主要试剂 |
| 4.1.3 培养基 |
| 4.1.4 主要试剂及常用溶液 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 阳性克隆质粒DNA提取 |
| 4.2.2 目的基因和pPIC9K空表达载体双酶切 |
| 4.2.3 目的基因与表达载体连接 |
| 4.2.4 转化 |
| 4.2.5 碱裂解法提取重组质粒DNA |
| 4.2.6 表达载体pPIC9K-appA线性化 |
| 4.2.7 毕赤酵母GS115感受态细胞制备 |
| 4.2.8 线性化载体电转化毕赤酵母GS115 |
| 4.2.9 阳性重组子继代培养 |
| 4.2.10 PCR法筛选转化子 |
| 4.2.11 阳性重组子酶活性鉴定 |
| 4.2.12 植酸酶appA阳性重组子(His~+)毕赤酵母诱导表达 |
| 4.2.13 诱导表达蛋白样品处理 |
| 4.2.14 SDS-PAGE凝胶的制备、加样及电泳 |
| 4.2.15 凝胶染色与脱色 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 阳性T克隆质粒提取 |
| 4.3.2 EcoR Ⅰ和Not Ⅰ 双酶切鉴定 |
| 4.3.3 pPIC9k酵母表达构建 |
| 4.3.4 表达重组子的转化及筛选鉴定 |
| 4.3.5 基因工程菌植酸酶诱导表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 酵母表达系统 |
| 4.4.2 外源蛋白在毕赤酵母中表达 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 重组植酸酶表达蛋白纯化及酶学性质分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 药品及试剂 |
| 5.1.2 不同pH值缓冲液 |
| 5.1.3 酶活性测定试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 重组植酸酶appA表达蛋白纯化 |
| 5.2.2 纯化植酸酶SDS-PAGE分析 |
| 5.2.3 植酸酶appA表达蛋白溶液定量分析 |
| 5.2.4 植酸酶酶学性质研究 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 表达产物的纯化和SDS-PAGE检测 |
| 5.3.2 重组植酸酶定量分析 |
| 5.3.4 重组植酸酶最适pH测定 |
| 5.3.5 重组植酸酶最适温度测定 |
| 5.3.6 重组植酸酶热稳定性测定 |
| 5.4 结论 |
| 5.4.1 重组植酸酶的纯化 |
| 5.4.2 重组植酸酶的性质 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结及下一步研究进展 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）奥默柯达酵母植酸酶基因phy1在毕赤酵母中的表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 植酸酶基因phy1表达片段的克隆及鉴定 |
| 1.2.2 表达载体的构建 |
| 1.2.3 毕赤酵母的电击转化及筛选 |
| 1.2.4 阳性转化子的PCR分析 |
| 1.2.5 重组酵母的诱导表达 |
| 1.2.6 重组植酸酶的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.7 温度和pH对重组植酸酶活性的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 植酸酶基因phy1表达片段的克隆 |
| 2.2 表达载体pPICZαAphy1的构建 |
| 2.3 阳性转化子的PCR分析 |
| 2.4 重组酵母的诱导表达 |
| 2.5 重组植酸酶的SDS-PAGE分析 |
| 2.6 温度和pH对重组植酸酶活性的影响 |
| 3 讨论 |
（10）青霉植酸酶phyA基因的克隆、表达及蛋白性质的改良（论文提纲范文）
| 中文目录 |
| INDEX |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 植酸 |
| 1.1.1 植酸的定义与性质 |
| 1.1.2 植酸的分布 |
| 1.1.3 植酸的用途及危害 |
| 1.2 植酸酶 |
| 1.2.1 植酸酶的定义及分类 |
| 1.2.2 植酸酶的来源 |
| 1.2.3 植酸酶的性质 |
| 1.3 植酸酶的应用、限制因素及解决办法 |
| 1.3.1 植酸酶的商业化应用 |
| 1.3.2 植酸酶的工业应用限制因素及其改造成果 |
| 1.4 本文的立题依据及研究意义 |
| 1.4.1 本文的立题依据 |
| 1.4.2 本论文的研究意义 |
| 第二章 青霉植酸酶基因PHYA的克隆 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒及遗传特性 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Penicillium sp.total RNA、genomic DNA的提取及反转录 |
| 2.2.2 mRNA的反转录 |
| 2.2.3 植酸酶基因phyA部分序列的克隆 |
| 2.2.4 植酸酶基因的5’及3’端未知序列的扩增 |
| 2.2.5 植酸酶基因序列的克隆及测序 |
| 2.2.6. 植酸酶成熟肽编码序列的扩增 |
| 2.2.7 软件分析植酸酶基因序列及其编码的蛋白特征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Total RNA和genomic DNA的纯度和浓度检测 |
| 2.3.2 Penicillium sp.植酸酶部分序列的扩增 |
| 2.3.3 植酸酶基因的5’及3’端未知序列的扩增 |
| 2.3.4 植酸酶基因的全序列组装 |
| 2.3.5 植酸酶成熟肽cDNA序列的扩增结果 |
| 2.3.6 植酸酶基因及蛋白序列的性质分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 PENICILLIUM SP.植酸酶基因在毕赤酵母中的分泌性表达 |
| 3.1. 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 表达载体的构建 |
| 3.2.2 表达载体转化毕赤酵母及转化子的验证 |
| 3.2.3 重组毕赤酵母的诱导表达及产酶曲线的测定 |
| 3.3. 结果与讨论 |
| 3.3.1 表达载体pPIC9-PophyA的构建 |
| 3.3.2 毕赤酵母转化子的验证 |
| 3.3.3 重组酵母表型的筛选 |
| 3.3.4 重组植酸酶蛋白的产植酸酶曲线 |
| 3.4. 本章小结 |
| 第四章 毕赤酵母表达植酸酶蛋白的纯化及性质测定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与培养基 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 粗酶液的获得 |
| 4.2.2 植酸酶蛋白的纯化 |
| 4.2.3 纯化的植酸酶蛋白性质测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 植酸酶蛋白的纯化 |
| 4.3.2 植酸酶蛋白的性质 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 植酸酶蛋白的性质改造 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株与质粒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 青霉植酸酶随机突变体库的构建 |
| 5.2.2 突变基因在P. pastoris GS115中的转化及表达 |
| 5.2.3 随机突变体库的筛选 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 E.coli转化子的质粒阳性验证 |
| 5.3.2 P. pastoris转化子的PCR验证 |
| 5.3.3 突变子蛋白的筛选结果 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 青霉植酸酶蛋白三级结构的预测 |
| 6.1 实验方法 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 Penicillium sp.植酸酶蛋白的三级结构及分析 |
| 6.2.2 突变植酸酶蛋白的耐热机理 |
| 6.2.3 突变植酸酶蛋白的温度曲线变化机理 |
| 6.2.4 2-249 突变植酸酶蛋白的最适pH降低机理 |
| 6.2.5 Penicillium sp.植酸酶蛋白的蛋白酶抗性分析 |
| 6.3 本章小结 |
| 全文总结 |
| 论文的创新点 |
| 今后的工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录1.PENICILLIUM SP.的PHYA基因序列(COMPLETE CDS) |
| 附录2 PENICILLIUM SP.植酸酶氨基酸序列中潜在的PEPSIN及TRYPSIN蛋白酶切割位点分布 |
| 附录3. PENICILLIUM SP.与A.FUMIGATUS的植酸酶氨基酸序列比对结果 |
| 致谢 |
| 在读期间发表和被录用的论文 |
| 外文论文 |
| References |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达（论文参考文献）
- [1]植酸酶基因的定点突变及其在巴斯德毕赤酵母表面展示[J]. 余道兵,程学松,王群,史艳可,张昕. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2018(01)
- [2]基于计算机辅助设计改造饲用植酸酶、木聚糖酶酶学特性的研究[D]. 苗华彪. 云南师范大学, 2017(02)
- [3]新型无抗多拷贝毕赤酵母表达平台的构建及新壳聚糖酶基因的重组表达[D]. 李丁. 南京农业大学, 2016(07)
- [4]隔孢伏革菌植酸酶在毕赤酵母中的高效表达研究[D]. 陆益新. 扬州大学, 2016(02)
- [5]密码子优化的隔孢伏革菌植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达[J]. 陆益新,王瑞鲲,田永杰,吴倩倩,李湘鸣. 饲料广角, 2015(12)
- [6]转植酸酶和内切葡聚糖酶基因乳酸杆菌的构建及其肉鸡饲喂效果验证[D]. 王磊. 西北农林科技大学, 2014(03)
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